Scheiding van spinazie thylakoïde eiwitcomplexen door elektroforese van het Gel van de Native groen en karakterisering van de Band met Time-Correlated Single Photon Counting

Deze methode is nuttig voor het beantwoorden van bepaalde belangrijke vragen op het gebied van fotosynthese onderzoek, zoals putatieve thylakoïde complexen fysiologisch echte complexen met energetisch verbonden componenten? Het belangrijkste voordeel van de groene gel en TCSPC protocol hier beschreven is dat het snel en robuust. Monsters kunnen eenvoudig worden verwerkt en geanalyseerd in een enkele dag, waardoor problemen van opslag en stabiliteit minder een punt van zorg.

Hoewel TCSPC inzicht kan geven in de fotosynthetische systemen die we hier hebben bestudeerd, kan het ook worden toegepast op andere systemen, variërend van chemische tot fysische en biologische, zoals studies van fluorescerende moleculaire beweging in vloeistoffen, cellen of nieuw-structurele motieven zoals monomoleculaire lagen en ionische vloeistoffen. Om deze procedure te beginnen, bereid de benodigde voorraadoplossingen en groene minigels zoals beschreven in het tekstprotocol. Vervolgens, het verkrijgen van wat ijs en dim de lichten.

Met behulp van een glazen Dounce homogenisator, volledig homogeniseren de spinazie bladeren in ongeveer een tot twee milliliter TMK buffer. Als u een eenvoudig filterapparaat wilt maken, snijdt u een delicate taak doormidden en vouwt u deze in kwarten. Verwijder de zuiger uit een spuit en pak de gevouwen taak in de bodem van de spuit.

Pipette het blad homogenaat in het midden van de taak-veeg filter, gebruik dan de zuiger om het homogenaat door het filter en het verzamelen in een 1,5-milliliter centrifuge buis. Centrifugeer het homogenaat op 5,000 g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten om het onoplosbare materiaal, inclusief de thylakoïde membranen, te pelleteren. Gooi de supernatant weg en verleg de pellet in een milliliter TMK-buffer.

Om chlorofyl uit elk monster te halen, neem je een aliquot van 50 microliter en breng je het over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Voeg 950 microliter methanol toe, dop de buis en meng door het meerdere keren om te keren. Centrifuge op 10,000 g gedurende 10 minuten om de neergeslagen eiwitten te pelleteren.

Met behulp van de chlorofylconcentratie metingen als een gids, verwijderen en gooi wat volume uit elk monster indien nodig totdat elke buis bevat dezelfde totale hoeveelheid chlorofyl. Centrifuge 10 minuten lang op 5,000 g om de thylakoïde membranen opnieuw te pelleteren. Verwijder en gooi de supernatant, voorzichtig om alle supernatant te verwijderen zonder de pellet te verstoren.

Ontdooi eerst een aliquot van TMK 30%glycerol wasmiddeloplossing. Keer meerdere keren om te mengen en houd de oplossing op ijs. Voeg een passend volume van de wasmiddeloplossing toe om de pellet op te lossen en resulteren in een uiteindelijke chlorofylconcentratie van één milligram per milliliter.

Pipet herhaaldelijk op en neer terwijl voorzichtig om schuim in het monster te voorkomen. Houd vervolgens het monster op ijs om thylakoïde monsters te laten oplosen. Nadat de oplosting is voltooid, centrifugeer het monster op 10, 000 g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten om het onoplosbare materiaal te pelleteren, wat resulteert in een helder, donkergroen supernatant.

Laad hierna 15 microliter oplosbaar thylakoïde supernatant direct op elke put van een eerder voorbereide 1,5-millimeter inheemse gel. Met behulp van 1X lopende buffer, beginnen met het uitvoeren van de native groene gel op 100 volt. Plaats de hele gel tank op nat ijs voor de duur van de run om weerstand te beperken verwarming.

Wanneer de gel klaar is met lopen, verwijder deze uit de elektroforese cel en spoel de loopbuffer af van de gelplaten met gedestilleerd water. Haal de bovenste plaat uit de gel en spoel de gel af met gedestilleerd water. Plaats de gel, die nog steeds op de onderste glasplaat, op ijs;wanneer de gel niet in gebruik is, bedek het met plastic folie en houd het in het donker om te voorkomen dat het uitdrogen.

Gebruik vervolgens een scherpe scalpel of scheermesje om elke groep van belang te verduisteren wanneer ze klaar zijn om verder te gaan met de TCSPC-analyse. Zorg ervoor dat de uitgesneden band geen vervuilend bandmateriaal bevat. Gebruik voor elk complex dat wordt geanalyseerd een fluorescerende spectrometer om een fluorescerend spectrum op kamertemperatuur te maken tussen 600 en 800 nanometer.

Plaats plakband op beide zijden van de dia's en vouw het meerdere malen om spacers te creëren, waardoor de dia's stevig bij elkaar kunnen worden gehouden zonder de ruimte tussen te comprimeren, en vervolgens de gelschijf tussen twee glazen microscopiedia's sandwich. Voeg een kleine hoeveelheid water toe aan de gelschijf aan de rand van de glazen platen om een vloeiende interface te creëren die de signaalverstrooiing vermindert. Klem vervolgens de gelsandwich in het balkpad, zodat de balk de gelschijf door de open rand van de platen raakt.

Verzamel voor elk complex 10.000 totale gegevenspunten op regelmatige tijdstippen over het fluorescentieemissiespectrum. Om de gegevens voor een bepaald complex te analyseren, normaliseert u eerst de piekhoogte van elke vervalcurve voor alle verzamelde golflengten en komt de staart overeen met elke vervalcurve met het steady state fluorescentiespectrum van het complex zoals beschreven in het tekstprotocol. Representatieve resultaten voor de groene gel elektroforese geeft een voorbeeld van een ideaal resultaat voor de analyse van spinazie thylakoïden, waar een aantal heldere, scherpe groene banden zichtbaar zijn.

Rijstroken 2 en 3 geven meer typische resultaten van eenvoudige thylakoïde isolatie en elektroforese op een niet-gradiënt 5%acrylamide gel. Rijstroken 4, 5 en 6 geven een voorbeeld van slechte resultaten als gevolg van toenemende graden van onder oplosbare steekproef, terwijl baan 7 de resultaten laat zien die kunnen worden bereikt wanneer Arabidopsis thylakoïden worden gebruikt in plaats van spinazie. Nadat de gegevenscurven van de TCSPC-gegevens zijn ingesteld op hetzelfde tijdregister, kunnen ze worden genormaliseerd tot dezelfde piekhoogte, waardoor de curven kunnen worden vergeleken als een eerste analyse van de gegevens.

Piek-genormaliseerde verval bochten van verschillende complexen kunnen dan worden bedekt met elkaar op een bepaalde golflengte, waardoor de verschillen in gedrag tussen de complexen worden gevisualiseerd. Staart die de bederfkrringen aan het passen past maakt de bouw van verval-bijbehorende spectra mogelijk. Zoals hier te zien, het verval-geassocieerde spectra voor de LHCII is opmerkelijk voor het gebrek aan dynamische functies en de vorm van de LHCII fluorescentie spectrum blijft hetzelfde als het signaal vervalt na verloop van tijd.

Het verval van het fluorescentiespectrum wordt ook vertraagd, waardoor 100 picoseconden nodig zijn om maximale fluorescentie te bereiken. Dit suggereert dat energie niet wordt overgedragen tussen energetisch verschillende pigmenten binnen het complex als de fluorescentie vervalt. Het verval-geassocieerde spectra wordt vervolgens gebouwd voor de Band 5 complex.

Vergeleken met de LHCII, de fluorescentie van Band 5 vervalt veel sneller, het bereiken van maximale intensiteit in slechts 30 picoseconden en vervolgens vervallen tot minder dan 20% van de initiële intensiteit na 500 picoseconden. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat de interpretatie van de TCSPC-gegevens zal afhangen van aanvullende biochemische informatie ter identificatie van de componenten van de complexen in studie, bijvoorbeeld door 2 DSDS-PAGE en Western Blotting of massaspectrometrie.