Name: Scheiding van spinazie thylakoïde eiwitcomplexen door elektroforese van het Gel van de Native groen en karakterisering van de Band met Time-Correlated Single Photon Counting (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Leer de scheiding van spinazie thylakoïde eiwitcomplexen door Native Green Gel elektroforese en karakterisering met TCSPC. Deze snelle, robuuste methode analyseert monsters binnen één dag.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Financiering en ondersteuning werden verstrekt door de afdeling scheikunde aan de Michigan State University.

1. stamoplossingen voorbereiding voor het gieten van inheemse groene Gels
<ol><li>Bereiden een 4 x geconcentreerd bufferoplossing voor het oplossen van gel bestaande uit 40% glycerol, glycine van 200 mM en 100 mM Tris gebufferd op een pH van 8,3.</li>
	<li>Een 4 x geconcentreerd bufferoplossing voorbereiden stapelen gels, bestaande uit 40% glycerol, glycine van 200 mM en 100 mM Tris gebufferd op een pH van 6.3.</li>
	<li>Bewaar deze buffers bij 4 ° C om te voorkomen dat de groei van de schimmel. Opmerking: De buffers zijn stabiele maandenlang bij 4 ° C, zodat de bereiding van 100-200 mL elke buffer voor verder gebruik wordt aanbevolen.</li>
	<li>Bereiden 1 L van 10 x uitvoeren buffer met 250 mM Tris HCl pH 8.3, 1.92 M glycine, en 1% SDS. De 10 x buffer waarop de benchtop opslaan.</li>
</ol>2. stockoplossing voorbereiding voor isolatie en solubilisatie van thylakoiden
<ol><li>100 mL TMK homogenisering buffer 50 mM Tris buffer (pH 7), met 10 mM MgCl2en 10 mM KCl bereiden en bewaren bij 4 ° C. Opmerking: Dit is de belangrijkste buffer voor homogenisatie en manipuleren van thylakoïde monsters. Anderzijds kunnen geconcentreerde stamoplossingen worden voorbereid en verdund zonodig (Tris buffer MgCl2en KCl kan alle gemakkelijk worden opgeslagen op de benchtop zodra 1 M concentreert zich).</li>
	<li>Bereiden van stamoplossingen van de thylakoïde solubilisatie wasmiddelen, B-decyl maltoside (DM) en n-octyl B-d-glucoside (OG), door het oplossen van elke wasmiddel in TMK buffer op 20% w / v. bevriezing bij-20 ° C in 1 mL aliquots.</li>
	<li>Bereiden thylakoïde solubilisatie buffer (SB), die ook de buffer monster laden.<ol>
<li>In de eerste plaats merk TMK-glycerol buffer door 7 mLs voor TMK buffer en 3 mLs glycerol te combineren.</li>
		<li>Om 800 μL van TMK-glycerol buffer, voeg 100 μl van de stockoplossing DM en 100 μl van de stockoplossing OG. Bewaar deze SB werkoplossing, met 2% DM en 2% OG, bevroren bij-20 ° C in 1 mL aliquots. Opmerking: Elk aliquot kan worden ontdooid en refrozen zo nodig.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. gieten groene Mini Gels voor Later gebruik
<ol><li>Aparte stapelen en het oplossen van gel oplossingen in 15 mL wegwerp proefbuizen voorbereiden. Opmerking: De volumes geboden zijn voldoende voor een enkele mini gel met behulp van 1,5 mm plaat afstandhouders.<ol>
<li>Combineren om de stapelvolgorde gel-oplossing, 1,25 mL 4 x stapelen gel-buffer, 0,5 mL van 40% acrylamide stockoplossing (39:1 C) en 3,25 mL water te geven van 5 mL 4% acrylamide in 1 x stapelen buffer. Zodat het oplossen gel combineren oplossing 1.875 mL 4 x oplossen van buffer, 0.94 mL van 40% acrylamide stockoplossing (39:1 C) en 4,7 mL water geven van 7,5 mL 5% acrylamide in 1 x oplossen van buffer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Giet het oplossen gel.<ol>
<li>50 μl van 10% ammoniumnitraat persulfate (APS) toevoegen aan het oplossen gel oplossing, dan toevoegen van 10 μL van TEMED, dop van de tube en voorzichtig omkeren van meerdere keren te mengen. Giet onmiddellijk de gel oplossing tussen de platen van de gel, waardoor ongeveer 1 cm tussen de bovenkant van het oplossen gel en de onderkant van de kam tanden voor de stapelvolgorde gel.</li>
		<li>Zachtjes Pipetteer 100% ethanol op de bovenkant van het oplossen gel naar niveau de gel. Opmerking: Als de gel niet binnen 15 min stelt, verse APS oplossing dient te geschieden en/of nieuwe TEMED moet worden gebruikt.</li>
		<li>Nadat de gel heeft polymeervorm (de interface tussen de gel en de ethanol gemakkelijk zichtbaar en worden niet verplaatst als de gel is getipt), pour uit de ethanol en blot met een absorberend papier.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Giet de stapelvolgorde gel.<ol>
<li>Voeg toe 25 μL van 10% APS aan de stapelvolgorde gel oplossing, voeg 5 l TEMED, vervolgens GLB en omdraaien om te mixen op dezelfde wijze als het oplossen gel. Giet de oplossing van de gel bovenop het oplossen gel totdat de ruimte tussen de platen is volledig gevuld en invoegen van een 10-well kam. Opmerking: Als u klaar bent om te worden gebruikt, de kam te verwijderen van de gel en de putjes met water spoelen, om ervoor te zorgen dat de putten recht en onbelemmerd door gel zijn. De gel kan worden opgeslagen met de kam bewaard bij 4 ° C gedurende ten minste enkele dagen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. isolatie van ruwe thylakoïde membranen van spinazie bladeren
Opmerking: Alle stappen moeten worden uitgevoerd op het ijs met behulp van vooraf gekoeld apparatuur en buffers. Dim verlichting wordt ook aangeraden. Afhankelijk van de experimentator de discretie en de biologische processen bestudeerde, moeten protease en/of phosphatase inhibitors vers worden toegevoegd aan TMK buffers voordat homogenisering.
<ol><li>Volledig Meng spinazie bladeren in TMK buffer met een glas Dounce homogenizer. Opmerking: Ongeveer 1 tot 2 mL buffer is doorgaans voldoende voor een kleine baby spinazie blad. Een enkele baby spinazie blad kan in het algemeen bieden genoeg materiaal om te laden verschillende putten op een 1,5 mm mini gel.</li>
	<li>Filter de ruwe blad homogenaat om te verwijderen van de onoplosbare puin.<ol>
<li>Om een eenvoudige filter apparaat, een delicate taak knippen veeg in helft en vouw het in kwartalen. Pak de delicate taak wissen in de bodem van een disposable spuit 5 mL en vooraf nat de veeg met TMK buffer.</li>
		<li>Gebruik de plunjer van de injectiespuit te drukken van overtollige buffer uit de delicate taak wipe en er zeker van te zijn dat de wipe-filter aan de onderkant van de spuit stevig is ingedrukt nadat de zuiger is verwijderd.</li>
		<li>Pipetteer van het homogenaat blad in het midden van het doekje filter en gebruik de zuiger het homogenaat passeren door het filter. Het verzamelen van de gefilterde homogenaat in een centrifugebuis 1,5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugeer het homogenaat bij 5.000 x g gedurende 10 minuten bij 4° C tot pellet onoplosbaar materiaal, met inbegrip van thylakoïde membranen. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 mL TMK buffer.</li>
	<li>De hoeveelheid chlorofyl in elk monster normaliseren door het aanpassen van het volume van elk monster geresuspendeerde thylakoïde zodat elk monster dezelfde totale hoeveelheid chlorofyl bevat, zoals hieronder beschreven. Opmerking: Dit zal het toestaan van elk monster aan ontbindend worden in dezelfde hoeveelheid wasmiddel en minimaliseert variabiliteit in solubilisatie als gevolg van verschillen in volume van het pellet.<ol>
<li>Om extract chlorofyl van elk monster van geresuspendeerde thylakoïde membranen, neem een 50 μl aliquoot in een tube van de microcentrifuge 1,5 mL en 950 μL van methanol aan toevoegen. De buis van het GLB en meng door het omkeren van meerdere malen.</li>
		<li>Centrifugeer het methanol/chlorofyl extract bij 10.000 x g gedurende 10 minuten naar pellet neergeslagen eiwitten.</li>
		<li>Bepaal de chlorofylconcentratie van het supernatans dat volgens Porra et al.met pigment. 23. Neem extinctie lezingen op 652 en 665 nm met behulp van een spectrofotometer en een meetcel 1 cm. Bepalen totale chlorofylconcentratie met behulp van de onderstaande vergelijking: Chls een + b (μg/mL) = 22.12 (Abs 652 nm) + 2.71 (Abs 665 nm)</li>
		<li>Met behulp van chlorofyl concentratie metingen als een gids, verwijderen en verwijderen van sommige volume van elk monster, zo nodig, zodat elke buis dezelfde totale hoeveelheid chlorofyl bevat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pellet opnieuw thylakoïde membranen door centrifugeren bij 5.000 x g gedurende 10 min. verwijderen en verwijder het supernatant. Wees voorzichtig met het verwijderen van alle bovendrijvende vloeistof zonder aspirating van om het even welk van de pellet.</li>
</ol>5. solubilisatie van een thylakoïde membranen voor laden op inheemse Gels
<ol><li>Ontdooi een aliquoot gedeelte van TMK 30% glycerol schoonmaakmiddel (SB) en omkeren van meerdere keren te mengen. Houd het op ijs.</li>
	<li>Los de pellet thylakoïde door toe te voegen het juiste volume van SB tot een chlorofylconcentratie van 1 mg/mL. Opmerking: Deze concentratie is een startpunt voor het vinden van de optimale solubilisatie voorwaarden, die empirisch moeten worden vastgesteld. De chlorofylconcentratie moet hetzelfde tussen monsters om geldige vergelijkingen worden gemaakt.</li>
	<li>Pipetteer herhaaldelijk op en neer terwijl ze voorzichtig om te voorkomen dat het schuim van het monster. Houd op ijs toe thylakoïde monsters te solubilize. Opmerking: Solubilize gedurende ten minste 10 minuten. Solubilisatie tijd moet lang genoeg dat het verschil in solubilisatie tijd tussen monsters wordt geminimaliseerd. Voorbeeld: Als 3 minuten vereist zijn voor het solubilize van alle monsters, dan ongeveer 30 minuten mag worden voor solubilisatie.</li>
	<li>Centrifugeer ontbindend ze bij 10.000 x g bij 4 ° C tot pellet onoplosbaar materiaal. Opmerking: Ontbindend thylakoïde monsters zijn stabiel op ijs voor uren, maar opslag bij-70 ° C moet worden voorkomen, aangezien cycli bevriezen-ontdooien in een verlies van megacomplex bands resulteren kunnen.</li>
</ol>6. scheiding van ontbindend thylakoïde eiwitten door inheemse gelelektroforese
<ol><li>Laden van de ontbindend thylakoïde supernatant bereid in stap 5.4 rechtstreeks op de inheemse gel eerder bereid. Een 1,5 mm gel, geladen 15 μL van ontbindend thylakoïde per putje.</li>
	<li>Stel de inheemse groene gel op in wezen dezelfde wijze als de SDS-pagina gelen met 1 x uitgevoerd buffer. Stel de gel bij 100 V en plaats de hele gel tank op nat ijs voor de duur van de vlucht te verzachten resistieve verwarming van de gel. Opmerking: De gel moet ongeveer 2 uur voor het gratis pigment aan de voorzijde van de migratie aan de onderkant van de gel (Figuur 1).</li>
</ol>7. excisie van thylakoïde Complex Bands uit inheemse groene Gels
Opmerking: De specifieke band van belang uit de gel middendoor is nodig zijn om de band te worden geplaatst in het pad van de lichtbundel en om te voorkomen dat strooilicht fluorescentie van nabijgelegen complexen worden verzameld.
<ol><li>Verwijder de gel uit de elektroforese cel en spoelen buffer off van de gel-platen met gedestilleerd water. Verwijderen van de bovenste plaat van de gel en spoel de gel met gedestilleerd water.</li>
	<li>Houden van de gel op de bodemplaat voor glas en plaats de gel en de plaat op ijs. Wanneer niet in gebruik, houden de gel in het donker en bedek met een plastic wrap te voorkomen uitdroogt.</li>
	<li>Accijnzen met de gel op de glasplaat blijven, elke band van belang als u klaar bent voor TCSPC analyse. Accijnzen bands netjes met een scherpe scalpel of scheermesje en zorgen dat de verwijderde band geen contaminerende band-materiaal bevat.</li>
</ol>8. verzameling van kamertemperatuur Steady-State fluorescentie Spectra
<ol><li>Voor elk complex dat zal worden geanalyseerd door TCSPC, wordt een kamertemperatuur fluorescentie spectrum genomen tussen 600 en 800 nm met behulp van een fluorescentie spectrometer. Opmerking: De golflengte van de excitatie gebruikt voor het verzamelen van dit spectrum moet overeenkomen met de golflengte gebruikt voor TCSPC.</li>
</ol>9. TCSPC van groene Gel Bands
Opmerking: Zie Figuur 2 voor een voorstelling van het TCSPC-setup.
<ol><li>Sandwich het gel segment tussen twee glazen microscopie glijdt. Gebruik plakband, op elk uiteinde van één van de microscopie dia's geplaatst en meer dan meerdere malen gevouwen als wilt maken van afstandhouders, zodat de dia's kunnen worden samengehouden stevig zonder het comprimeren van het gel-segment. Opmerking: Hiermee maakt u een pad voor de laserstraal te geven tussen de Microscoop dia's en door het gel-segment.</li>
	<li>Een kleine hoeveelheid water toevoegen aan het segment van de gel op de rand van het glas dia's een gladde interface maken die signaal verstrooiing zal verminderen.</li>
	<li>Klem de gel/dia sandwich in het pad van de bundel, dus dat de lichtbundel treft het segment van de gel door middel van de open rand van de platen, waardoor fluorescentie emissie worden via de kant van het glas dia's waarin de gel is ingeklemd, loodrecht op het pad van de lichtbundel. Opmerking: De golflengte van de excitatie gebruikt zal afhangen van het experiment. Een golflengte van 435 nm zal wekken zowel chlorofyl a en chlorofyl b, terwijl 465 nm bij voorkeur chlorofyl b zal prikkelen. In dit geval, 435 nm werd gebruikt als de excitatie golflengte.</li>
	<li>Verzamel 10.000 totale gegevenspunten op regelmatige tijdstippen uit het emissiespectrum van de fluorescentie voor elk complex. Bijvoorbeeld, het verzamelen van gegevens elke 10 nm, beginnend op 680 nm en eindigend bij 750 nm. Opmerking: Bereiden meerdere gel banden voor elk complex worden bestudeerd, zodat dat vers monster beschikbaar is in het geval dat photobleaching voldoende signaal-collectie voorkomt.</li>
</ol>10. TCSPC (Data-analyse)
<ol><li>Voor een gegeven complex, normaliseren eerst de piekhoogte van elke curve verval voor alle golflengten verzameld. Opmerking: Deze stap is niet nodig voor de bouw van DAS, maar voorziet in verval curven worden bedekt en als een eerste inspectie van de gegevens visueel met elkaar vergeleken.</li>
	<li>Staart-match elke verval curve tot de steady-state fluorescentie spectrum van het complex, zoals hieronder beschreven.<ol>
<li>Kies een timepoint waarna het verval signaal heeft afgevlakt, meestal na een paar nanoseconden.</li>
		<li>Voor elke golflengte, normaliseren de verval-curve zodat de signaalsterkte op de geselecteerde timepoint gelijk aan de waarde van het spectrum van de fluorescentie steady-state op die golflengte is (dat wil zeggen, de waarden van alle golflengten samen op de geselecteerde timepoint opnieuw zal maken de steady-state fluorescentie spectrum).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bouwen verval-medewerker spectra (DAS) van de staart zoekwoorden verval curven, zoals hieronder beschreven.<ol>
<li>Met behulp van gegevens punten van de staart zoekwoorden verval curven bouwen een aantal percelen graphing intensiteit van de fluorescentie vs. golflengte op regelmatige tijdstippen (bijvoorbeeld elke 10 ps). Bijvoorbeeld, is de DAS op 50 ps gebouwd door het uitzetten van de waarde van elke curve verval op 50 ps vs. golflengte.</li>
		<li>Overlay aller de verval-geassocieerde spectra maken een waterval stijl plot die het verval van het spectrum van de fluorescentie na verloop van tijd toont.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Yamori, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosynthetic+response+to+fluctuating+environments+and+photoprotective+strategies+under+abiotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Research%22%5BJournal%5D)">Photosynthetic response to fluctuating environments and photoprotective strategies under abiotic stress.</a> Journal of Plant Research. 129 (3), 379-395 (2016).</li>
<li>Kim, J. H., Nemson, J. A., Melis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosystem+II+reaction+center+damage+and+repair+in+Dunaliella+salina+%28Green+Alga%29+%28analysis+under+physiological+and+irradiance-stress+conditions%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Photosystem II reaction center damage and repair in Dunaliella salina (Green Alga) (analysis under physiological and irradiance-stress conditions).</a> Plant Physiology. 103 (1), 181-189 (1993).</li>
<li>Sundby, C., McCaffery, S., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turnover+of+the+photosystem+II+D1+protein+in+higher+plants+under+photoinhibitory+and+nonphotoinhibitory+irradiance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Turnover of the photosystem II D1 protein in higher plants under photoinhibitory and nonphotoinhibitory irradiance.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (34), 25476-25482 (1993).</li>
<li>Dietze, lL., Bräutigam, K., Pfannschmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosynthetic+acclimation%3A+state+transitions+and+adjustment+of+photosystem+stoichiometry-functional+relationships+between+short-term+and+longterm+light+quality+acclimation+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Photosynthetic acclimation: state transitions and adjustment of photosystem stoichiometry-functional relationships between short-term and longterm light quality acclimation in plants.</a> FEBS Journal. 275 (6), 1080-1088 (2008).</li>
<li>Horton, P., Ruban, A. V., Walters, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+light+harvesting+in+green+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Physiology+and+Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of light harvesting in green plants.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 655-684 (1996).</li>
<li>Baker, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorophyll+fluorescence%3A+a+probe+of+photosynthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo.</a> Annual Review of Plant Biology. 59, 89-113 (2008).</li>
<li>Williams, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+and+interaction+of+the+two+photosystems+in+photosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatial organization and interaction of the two photosystems in photosynthesis.</a> Nature. 225 (5239), 1214-1217 (1970).</li>
<li>Bellafiore, S., Barneche, F., Peltier, G., Rochaix, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State+transitions+and+light+adaptation+require+chloroplast+thylakoid+protein+kinase+STN7%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">State transitions and light adaptation require chloroplast thylakoid protein kinase STN7.</a> Nature. 433 (7028), 892-895 (2005).</li>
<li>Shapiguzov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PPH1+phosphatase+is+specifically+involved+in+LHCII+dephosphorylation+and+state+transitions+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">The PPH1 phosphatase is specifically involved in LHCII dephosphorylation and state transitions in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (10), 4782-4787 (2010).</li>
<li>Pribil, M., Pesaresi, P., Hertle, A., Barbato, R., Leister, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+plastid+protein+phosphatase+TAP38+in+LHCII+dephosphorylation+and+thylakoid+electron+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of plastid protein phosphatase TAP38 in LHCII dephosphorylation and thylakoid electron flow.</a> Public Library of Science Biology. 8 (1), (2010).</li>
<li>Larsson, U. K., Jergil, B., Andersson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+lateral+distribution+of+the+light-harvesting+chlorophyll-a%2Fb-protein+complex+induced+by+its+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Changes in the lateral distribution of the light-harvesting chlorophyll-a/b-protein complex induced by its phosphorylation.</a> European Journal of Biochemistry. 136 (1), 25-29 (1983).</li>
<li>Minagawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State+transitions--the+molecular+remodeling+of+photosynthetic+supercomplexes+that+controls+energy+flow+in+the+chloroplast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">State transitions--the molecular remodeling of photosynthetic supercomplexes that controls energy flow in the chloroplast.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (8), 897-905 (2011).</li>
<li>Ruban, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonphotochemical+Chlorophyll+Fluorescence+Quenching%3A+Mechanism+and+Effectiveness+in+Protecting+Plants+from+Photodamage%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nonphotochemical Chlorophyll Fluorescence Quenching: Mechanism and Effectiveness in Protecting Plants from Photodamage.</a> Plant Physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).</li>
<li>Rokka, A., Suorsa, M., Saleem, A., Battchikova, N., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+assembly+of+thylakoid+protein+complexes%3A+multiple+assembly+steps+of+photosystem+II%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Synthesis and assembly of thylakoid protein complexes: multiple assembly steps of photosystem II.</a> Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 159-168 (2005).</li>
<li>Li, L., Aro, E. M., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Photodamage+and+Protein+Turnover+in+Photoinhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Photodamage and Protein Turnover in Photoinhibition.</a> Trends in Plant Science. , (2018).</li>
<li>Dunahay, T. G., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+photosystem+I+complexes+from+octyl+glucoside%2Fsodium+dodecyl+sulfate+solubilized+spinach+thylakoids%3A+characterization+and+reconstitution+into+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Isolation of photosystem I complexes from octyl glucoside/sodium dodecyl sulfate solubilized spinach thylakoids: characterization and reconstitution into liposomes.</a> Plant Physiology. 78 (3), 606-613 (1985).</li>
<li>Allen, K. D., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+16+to+20+chlorophyllprotein+complexes+using+a+low+ionic+strength+native+green+gel+system%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Resolution of 16 to 20 chlorophyllprotein complexes using a low ionic strength native green gel system.</a> Analytical Biochemistry. 194 (1), 214-222 (1991).</li>
<li>Peter, G. F., Thornber, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+composition+and+organization+of+higher+plant+photosystem+II+light-harvesting+pigment-proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Biochemical composition and organization of higher plant photosystem II light-harvesting pigment-proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (25), 16745-16754 (1991).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).</li>
<li>Schwarz, E. M., Tietz, S., Froehlich, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosystem+I-LHCII+megacomplexes+respond+to+high+light+and+aging+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Photosynthesis+Research%22%5BJournal%5D)">Photosystem I-LHCII megacomplexes respond to high light and aging in plants.</a> Photosynthesis Research. 136 (1), 107-124 (2018).</li>
<li>Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+native+gel+systems+for+separation+of+thylakoid+protein+complexes%3A+novel+super-+and+mega-complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes.</a> Biochemical Journal. 439 (2), 207-214 (2011).</li>
<li>Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+hierarchical+megacomplex+formation+in+Arabidopsis+thylakoid+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane.</a> Plant Journal. 92 (5), 951-962 (2017).</li>
<li>Porra, R. J., Thompson, W. E., Kriedemann, P. E. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0005272889803470">Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 975 (3), 384-394 (1989).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Een succesvolle thylakoïde solubilisatie en native gel uitvoeren zal resulteren in de resolutie van meerdere afzonderlijke zichtbaar groene banden op de gel zonder aanzienlijke vervorming of het smeren van de bands. Overbelasting de gel, een hoge concentratie van wasmiddel, een onjuiste monster pH, onopgeloste materiaal, runnen van de gel te snel of bij een te hoge temperatuur, en een ten onrechte gegoten gel zijn allemaal factoren die kunnen bijdragen tot slecht opgelost thylakoïde complexen. Terwijl het optimaliseren v...

Fotosynthetische organismen moeten voortdurend hun fysiologie aan veranderende milieu omstandigheden hun productiviteit te maximaliseren en met succes concurreren met buren1aanpassen. Dit geldt met name voor de machine verantwoordelijk voor de licht-reacties van fotosynthese, als omgevingslicht voorwaarden door drie ordes van grootte tussen donker en vol zonlicht fluctueren kunnen. Bovendien, kunnen milieufactoren zoals droogte, koude of hittestress verminderen de beschikbaarheid van kooldioxide voor fixatie van koolstof, die de natuurlijke elektron gootsteen voor de producten van de licht-reacties. Planten moeten, daarom, oogst en gebruik maken van de zonnestraling zo efficiënt mogelijk met behoud van de mogelijkheid om te verdrijven van overtollige licht energie als dit nodig is. Terwijl photooxidative schade nog steeds routinematig onder alle lichtomstandigheden2,3, onvermogen om te beheren energie van de geabsorbeerde excitatie met succes kan leiden tot de catastrofale celbeschadiging en dood optreedt. Verschillende adaptieve mechanismen bestaan waarmee de fotosynthetische toestellen worden afgesteld zowel aan veranderingen in de heersende milieuomstandigheden en voorbijgaande fluctuaties (dat wil zeggen, over zowel de korte als de lange termijn)4. Het gaat hierbij om de lange termijn response (LTR) en niet-fotochemische blussen (NPQ). NPQ is zelf geacht te omvatten ten minste drie andere component fenomenen, waaronder staat overgangen (qT), snel afleidbare energie blussen (qE) en photoinhibition (qI)5.
Deze processen werden oorspronkelijk waargenomen en grotendeels in termen van spectroscopische fenomenen gedefinieerd [bijvoorbeeld NPQ verwijst naar een daling in waargenomen chlorofyl fluorescentie (blussen van chlorofyl fluorescentie) thats niet te wijten aan een toename in de snelheid van Fotochemie]6. De term "overgangen van de staat" ook naar de waargenomen verwijst verandering in de relatieve hoeveelheid fluorescentie van PSI en PSII7. Terwijl de spectroscopische technieken die opsomming van deze verschijnselen mogelijk hebben gemaakt [inzonderheid pulse amplitude gemoduleerd (PAM) Fluorescentiespectroscopie] en blijven een essentieel middel voor het observeren en het ontleden van fotosynthetische processen in vivo, veel van de biochemie is vereist voor het ophelderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan deze spectroscopische waarnemingen. Staat overgangen, bijvoorbeeld, houdt een fosforylatie/defosforylerings-cyclus van de LHCII eiwitten door de STN7 kinase en fosfatase TAP38/PPH1, respectievelijk8,9,10. Deze cyclus regelt de fysieke distributie van de antenne van de LHCII tussen de twee photosystems door een deel van LHCII trimeren van PSII naar PSI, waardoor het wijzigen van de absorptie dwarsdoorsnede van de photosystems11,12. De qE component van NPQ zet snel overtollige excitatie energie in warmte door middel van de acties van de Violaxanthine/zeaxanthine epoxidatie/de-epoxidatie cyclus en de publieke omroepen-eiwit. De exacte rol van publieke omroepen in dit proces is nog steeds niet volledig begrepen13. De component van de qI van NPQ, photoinhibition, wordt over het algemeen toegeschreven om schade aan de proteïne van de D1 van PSII. Herstel van volledige fotosynthetische bevoegdheid vereist een uitgebreide herstelproces te repareren van beschadigde PSII photocenters. De PSII reparatie cyclus omvat de migratie van PSII complexen uit de granal stapels, ontmanteling van de complexen, vervanging van beschadigde D1 eiwitten, opnieuw samenstellen van de complexen PSII en verkeer van PSII complexen terug naar de granal stapels14. De precieze aard van de photoinhibition en PSII photodamage blijft een onderwerp van intensieve controle15.
De moeilijkheid bij het bestuderen van verschijnselen als staat overgangen of PSII reparatie vloeit gedeeltelijk voort uit het feit dat er niet een eenvoudige manier is te visualiseren van de mechanica van complexe biochemische systemen. De klassieke biochemische aanpak voor het begrip van een proces is het eerst scheiden van zijn onderdelen, zodat ze kunnen worden gekarakteriseerd in isolatie. Native gelelektroforese is ontstaan uit de succesvolle pogingen in de jaren 1980 te scheiden en karakteriseren de Fotosysteem complexen van de thylakoïde membranen met meer voorbereidende methoden (namelijk sacharose kleurovergang centrifugeren en chromatografie)16. Het wasmiddel systemen ontwikkeld om het zachtjes solubilize de inheemse complexen van de membranen thylakoïde werden snel aangepast aan elektroforetische scheidingsmethoden, vooral door Allen en article17 en en Peter en Thornber18, leiden aan inheemse groene gelelektroforese. Hoewel vertegenwoordigen slechts één uit een verscheidenheid van technieken in het experimentele arsenaal, inheemse pagina een aantal aantrekkelijke kenmerken die een algemeen werkzame methode hebben gemaakt in het onderzoek van de fotosynthese heeft. Inheemse pagina is relatief snel en eenvoudig, waarbij weinig gespecialiseerde apparatuur, terwijl het verstrekken van hoge resolutie scheiding van een groot aantal thylakoïde complexen gelijktijdig. Dit zorgt ervoor dat inheemse pagina een handig hulpmiddel voor de studie van thylakoïde dynamiek en, in combinatie met standaard pagina in de tweede dimensie, alsmede een verscheidenheid van wasmiddel en buffer systemen, een veelzijdig systeem voor het zoeken en karakterisering van nieuwe thylakoïde complexen.
Dat gezegd zijnde, hebben inheemse groene gels een reputatie als een onbetrouwbare techniek, met name in onervaren handen, omdat het gemakkelijk is voor de productie van slechte resultaten vage, smeary gels met enkele bands uit. Dit probleem werd opgelost, gedeeltelijk, met de introductie van blauw-native pagina19. Het gebruik van coommassie kleurstof in de BN buffersysteem maakt eiwit scheiding robuuster. Daarom kan BN-pagina is vaak een gemakkelijker en betrouwbaarder techniek voor een relatieve beginner instellen en hoge resolutie scheidingen van thylakoïde complexen. Om deze redenen geworden BN-pagina de methode van keuze voor het meeste werk voor dit veld. Terwijl BN-pagina over het algemeen langzamer is uitgevoerd dan groene gelelektroforese, het belangrijkste nadeel is dat de coommassie kleurstof kleuring interfereert met de identificatie van zwakke chlorofyl-bevattende bands, terwijl ook downstream spectroscopische karakterisering problematisch.
De biochemische informatie verstrekt door inheemse gels en 2D SDS-pagina kan aanzienlijk worden versterkt in combinatie met gegevens van spectroscopische technieken. Ongeacht het systeem, een centraal probleem met het gebruik van inheemse gels te identificeren complexen is dat er altijd de identificatie kan worden aangevochten (dat wil zeggen, de eiwitten in een band gevonden kan altijd vertegenwoordigen comigrating complexen of onderdelen, eerder dan een enkel fysiologisch authentiek complex). Spectroscopische karakterisering biofysische informatie over de pigmenten in groene gel bands en kan worden gebruikt om te bepalen welke soorten complexen zijn ze waarschijnlijk bevatten. Chlorofyl fluorescentie is vooral nuttig in dit verband als gevolg van de vaak sterk verschillende spectra en de levensduur van de fluorescentie die karakteristiek voor verschillende fotosynthetische pigment-eiwitcomplexen zijn. Terwijl eenvoudige steady-state 77K fluorescentie spectra historisch nuttig zijn bij de bevestiging van de identiteit van de inheemse gel complexen, bieden moderne tijd-gecorreleerde één foton tellen (TCSPC) veel meer informatie. TCSPC kunnen niet alleen de karakterisatie van complexen op basis van de levensduur van de fluorescentie, maar maakt ook mogelijk de gedetailleerde beschrijving van de energie-overdracht tussen spectrale componenten binnen een complex. Dit soort karakterisering wordt steeds noodzakelijker als het gebruik van verschillende inheemse gel systemen spreads en nieuwe putatief complexen worden ontdekt, waardoor de identificatie van eiwitcomplexen beter worden geverifieerd en het verstrekken van nieuwe biofysische informatie over de werking van deze complexen.
In dit document bieden we een methode waarmee degenen die weinig of geen ervaring met inheemse gelelektroforese om de resolutie van de hoge kwaliteit van inheemse thylakoïde complexen met het oog op het onderzoek naar de mechanica van de licht-reacties van fotosynthese. Deze basistechniek kan vervolgens worden opgedreven naar eigen goeddunken van de experimentator resultaten verbeteren of uitbreiden van toepasselijkheid op andere soorten. Vervolgens beschrijven we het proces voor het onderwerpen van inheemse groene gel bands aan het TCSPC, evenals enkele stappen voor fundamentele analyse en betere presentatie van de gegevens verstrekt door de techniek. De koppeling van de inheemse gelelektroforese met TCSPC analyse breidt het nut van deze gel-systemen door middel van verificatie en biofysische karakterisering van eiwitcomplexen binnen de bands. Het systeem van de groene gel hier beschreven is gebaseerd op die ontwikkeld door Allen en article17 met enkele wijzigingen en is hetzelfde als die in Schwarz et al.gebruikt. 20. dit systeem is een van de vele maar heeft specifieke functies die handig voor deze methode zijn. Het is snel genoeg, zodat thylakoïde isolatie, de gelelektroforese van het en TCSPC analyse handige kunnen worden uitgevoerd op één dag wegnemen van mogelijke problemen van monster opslag en afbraak. Wij vinden ook dat deze methode robuust in de handen van onervaren gebruikers, is terwijl nog steeds resultaten die variëren van goede naar superior, afhankelijk van de mate van optimalisatie.
Het is belangrijk om te beseffen dat de gevisualiseerd op een native gel complexen afhankelijk zijn op zowel het wasmiddel en buffer systemen die worden gebruikt, alsook op de biologische eigenschappen van het organisme onderzocht. Verschillende systemen van wasmiddel en buffer scheiden bij voorkeur verschillende soorten complexen, en een bepaalde fotosynthetische organisme zal hebben verschillende complexen van andere organismen, niet alle die aanwezig zijn in een bepaalde omstandigheid zal zijn. Het systeem hier beschreven is bijzonder geschikt voor de studie van PSI megacomplexes, zoals beschreven in Schwarz et al.. 20, maar het valt op de meer destabiliserende kant van het spectrum voor degenen die studeren van PSII megacomplexes. Voor een uitgebreide studie van de verschillende systemen voor wasmiddel en buffer gebruikt in native gelelektroforese van thylakoïde eiwitten, is het aanbevolen om Järvi et al.bekijken. 21 en Rantala et al. 22.

<table><tbody><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>#648310</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Decyl Maltoside</td><td>Sigma</td><td>D7658</td><td>n-decyl beta d maltopyranoside, niet dodecyl maltoside of alpha decyl maltoside</td></tr><tr><td>Octyl Glucoside</td><td>Sigma</td><td>O8001</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>BioRad</td><td>161-0148</td><td>37.5/1 C 40% oplossing</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>BioRad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate</td><td>BioRad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr></tbody></table>

scheiding van spinazie thylakoïde eiwitcomplexen door elektroforese van het gel van de native groen en karakterisering van de band met time-correlated single photon counting

Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting

De licht-reacties van fotosynthese worden uitgevoerd door een reeks van gepigmenteerde eiwitcomplexen in de thylakoïde membranen. De stoichiometrie en de organisatie van deze complexen op zowel lange als korte tijd schalen als gevolg van de processen die aan te passen aan veranderende milieu omstandigheden fotosynthese hoogdynamische is (dat wil zeggen, niet-fotochemische blussen, staat de overgangen, en de op lange termijn antwoord). Historisch, deze processen zijn beschreven spectroscopically in termen van veranderingen in de chlorofyl fluorescentie en spectroscopie blijft een belangrijke methode voor het fotosynthetische controleparameters. Er zijn een beperkt aantal manieren waarin de onderliggende complexe dynamiek van de eiwitten kunnen worden gevisualiseerd. Hier beschrijven we een snelle en eenvoudige methode voor het hoge-resolutie scheiding en visualisatie van thylakoïde complexen, inheemse groene gelelektroforese. Deze methode gaat gepaard met tijd-gecorreleerde één foton tellen voor gedetailleerde karakterisering van de chlorofyl fluorescentie-eigenschappen van bands gescheiden op de groene gel.

Representatieve resultaten voor groene gelelektroforese worden gepresenteerd in Figuur 1. Lane 1 bevat een voorbeeld van ideale resultaten voor groene gelelektroforese van spinazie ze, waarin een maximum aantal heldere, scherpe groene banden zichtbaar zijn. Deze resultaten zijn enigszins atypisch, gedeeltelijk omdat niet alle van de bands gezien in baan 1 normaal aanwezig zijn in een monster zijn. Extra monster opruimen, in de vorm van chloroplast isolatie vo...

Hier presenteren we een protocol om te scheiden van ontbindend thylakoïde complexen door Native groen gelelektroforese. Groene gel banden worden vervolgens gekenmerkt door tijd gecorreleerd Single Photon Counting (TCSPC) en basisstappen voor data-analyse worden verstrekt.

Scheiding van spinazie thylakoïde eiwitcomplexen door elektroforese van het Gel van de Native groen en karakterisering van de Band met Time-Correlated Single Photon Counting

The light reactions of photosynthesis are carried out by a series of pigmented protein complexes in the thylakoid membranes. The stoichiometry and ...

Deze methode is nuttig voor het beantwoorden van bepaalde belangrijke vragen op het gebied van fotosynthese onderzoek, zoals putatieve thylakoïde complexen fysiologisch echte complexen met energetisch verbonden componenten? Het belangrijkste voordeel van de groene gel en TCSPC protocol hier beschreven is dat het snel en robuust. Monsters kunnen eenvoudig worden verwerkt en geanalyseerd in een enkele dag, waardoor problemen van opslag en stabiliteit minder een punt van zorg.Hoewel TCSPC inzicht kan geven in de fotosynthetische systemen die we hier hebben bestudeerd, kan het ook worden toegepast op andere systemen, variërend van chemische tot fysische en biologische, zoals studies van fluorescerende moleculaire beweging in vloeistoffen, cellen of nieuw-structurele motieven zoals monomoleculaire lagen en ionische vloeistoffen. Om deze procedure te beginnen, bereid de benodigde voorraadoplossingen en groene minigels zoals beschreven in het tekstprotocol. Vervolgens, het verkrijgen van wat ijs en dim de lichten.Met behulp van een glazen Dounce homogenisator, volledig homogeniseren de spinazie bladeren in ongeveer een tot twee milliliter TMK buffer. Als u een eenvoudig filterapparaat wilt maken, snijdt u een delicate taak doormidden en vouwt u deze in kwarten. Verwijder de zuiger uit een spuit en pak de gevouwen taak in de bodem van de spuit.Pipette het blad homogenaat in het midden van de taak-veeg filter, gebruik dan de zuiger om het homogenaat door het filter en het verzamelen in een 1,5-milliliter centrifuge buis. Centrifugeer het homogenaat op 5,000 g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten om het onoplosbare materiaal, inclusief de thylakoïde membranen, te pelleteren. Gooi de supernatant weg en verleg de pellet in een milliliter TMK-buffer.Om chlorofyl uit elk monster te halen, neem je een aliquot van 50 microliter en breng je het over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Voeg 950 microliter methanol toe, dop de buis en meng door het meerdere keren om te keren. Centrifuge op 10,000 g gedurende 10 minuten om de neergeslagen eiwitten te pelleteren.Met behulp van de chlorofylconcentratie metingen als een gids, verwijderen en gooi wat volume uit elk monster indien nodig totdat elke buis bevat dezelfde totale hoeveelheid chlorofyl. Centrifuge 10 minuten lang op 5,000 g om de thylakoïde membranen opnieuw te pelleteren. Verwijder en gooi de supernatant, voorzichtig om alle supernatant te verwijderen zonder de pellet te verstoren.Ontdooi eerst een aliquot van TMK 30%glycerol wasmiddeloplossing. Keer meerdere keren om te mengen en houd de oplossing op ijs. Voeg een passend volume van de wasmiddeloplossing toe om de pellet op te lossen en resulteren in een uiteindelijke chlorofylconcentratie van één milligram per milliliter.Pipet herhaaldelijk op en neer terwijl voorzichtig om schuim in het monster te voorkomen. Houd vervolgens het monster op ijs om thylakoïde monsters te laten oplosen. Nadat de oplosting is voltooid, centrifugeer het monster op 10, 000 g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten om het onoplosbare materiaal te pelleteren, wat resulteert in een helder, donkergroen supernatant.Laad hierna 15 microliter oplosbaar thylakoïde supernatant direct op elke put van een eerder voorbereide 1,5-millimeter inheemse gel. Met behulp van 1X lopende buffer, beginnen met het uitvoeren van de native groene gel op 100 volt. Plaats de hele gel tank op nat ijs voor de duur van de run om weerstand te beperken verwarming.Wanneer de gel klaar is met lopen, verwijder deze uit de elektroforese cel en spoel de loopbuffer af van de gelplaten met gedestilleerd water. Haal de bovenste plaat uit de gel en spoel de gel af met gedestilleerd water. Plaats de gel, die nog steeds op de onderste glasplaat, op ijs;wanneer de gel niet in gebruik is, bedek het met plastic folie en houd het in het donker om te voorkomen dat het uitdrogen.Gebruik vervolgens een scherpe scalpel of scheermesje om elke groep van belang te verduisteren wanneer ze klaar zijn om verder te gaan met de TCSPC-analyse. Zorg ervoor dat de uitgesneden band geen vervuilend bandmateriaal bevat. Gebruik voor elk complex dat wordt geanalyseerd een fluorescerende spectrometer om een fluorescerend spectrum op kamertemperatuur te maken tussen 600 en 800 nanometer.Plaats plakband op beide zijden van de dia's en vouw het meerdere malen om spacers te creëren, waardoor de dia's stevig bij elkaar kunnen worden gehouden zonder de ruimte tussen te comprimeren, en vervolgens de gelschijf tussen twee glazen microscopiedia's sandwich. Voeg een kleine hoeveelheid water toe aan de gelschijf aan de rand van de glazen platen om een vloeiende interface te creëren die de signaalverstrooiing vermindert. Klem vervolgens de gelsandwich in het balkpad, zodat de balk de gelschijf door de open rand van de platen raakt.Verzamel voor elk complex 10.000 totale gegevenspunten op regelmatige tijdstippen over het fluorescentieemissiespectrum. Om de gegevens voor een bepaald complex te analyseren, normaliseert u eerst de piekhoogte van elke vervalcurve voor alle verzamelde golflengten en komt de staart overeen met elke vervalcurve met het steady state fluorescentiespectrum van het complex zoals beschreven in het tekstprotocol. Representatieve resultaten voor de groene gel elektroforese geeft een voorbeeld van een ideaal resultaat voor de analyse van spinazie thylakoïden, waar een aantal heldere, scherpe groene banden zichtbaar zijn.Rijstroken 2 en 3 geven meer typische resultaten van eenvoudige thylakoïde isolatie en elektroforese op een niet-gradiënt 5%acrylamide gel. Rijstroken 4, 5 en 6 geven een voorbeeld van slechte resultaten als gevolg van toenemende graden van onder oplosbare steekproef, terwijl baan 7 de resultaten laat zien die kunnen worden bereikt wanneer Arabidopsis thylakoïden worden gebruikt in plaats van spinazie. Nadat de gegevenscurven van de TCSPC-gegevens zijn ingesteld op hetzelfde tijdregister, kunnen ze worden genormaliseerd tot dezelfde piekhoogte, waardoor de curven kunnen worden vergeleken als een eerste analyse van de gegevens.Piek-genormaliseerde verval bochten van verschillende complexen kunnen dan worden bedekt met elkaar op een bepaalde golflengte, waardoor de verschillen in gedrag tussen de complexen worden gevisualiseerd. Staart die de bederfkrringen aan het passen past maakt de bouw van verval-bijbehorende spectra mogelijk. Zoals hier te zien, het verval-geassocieerde spectra voor de LHCII is opmerkelijk voor het gebrek aan dynamische functies en de vorm van de LHCII fluorescentie spectrum blijft hetzelfde als het signaal vervalt na verloop van tijd.Het verval van het fluorescentiespectrum wordt ook vertraagd, waardoor 100 picoseconden nodig zijn om maximale fluorescentie te bereiken. Dit suggereert dat energie niet wordt overgedragen tussen energetisch verschillende pigmenten binnen het complex als de fluorescentie vervalt. Het verval-geassocieerde spectra wordt vervolgens gebouwd voor de Band 5 complex.Vergeleken met de LHCII, de fluorescentie van Band 5 vervalt veel sneller, het bereiken van maximale intensiteit in slechts 30 picoseconden en vervolgens vervallen tot minder dan 20% van de initiële intensiteit na 500 picoseconden. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat de interpretatie van de TCSPC-gegevens zal afhangen van aanvullende biochemische informatie ter identificatie van de componenten van de complexen in studie, bijvoorbeeld door 2 DSDS-PAGE en Western Blotting of massaspectrometrie.

separation-spinach-thylakoid-protein-complexes-native-green-gel

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

We beschrijven hier een protocol voor de zuivering en karakterisering van plantaardig eiwit complexen. We zien dat door immunoprecipitatie een eiwit in een complex, zodat we kunnen zijn post-translationele modificaties en zijn interactie partners identificeren.

Identificatie van post-translationele modificaties van Plant eiwitcomplexen

De beschreven vergelijkende, kwantitatieve proteomics aanpak is gericht op het verkrijgen van inzicht in de samenstelling van multiprotein complexen onder verschillende omstandigheden en wordt aangetoond door het vergelijken van genetisch verschillende stammen. Voor kwantitatieve analyse gelijke volumes van verschillende fracties van een sucrose dichtheidsgradiënt gemengd en geanalyseerd met massaspectrometrie.

Een nieuwe aanpak voor de Vergelijkende analyse van de multiprotein Complexen Gebaseerd op<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabole Labeling en kwantitatieve massaspectrometrie

Dit protocol beschrijft de reconstituurtie van licht-oogstcomplexen in vitro. Deze integrale membraaneiwitten coördineren chlorofylen en carotenoiden en zijn verantwoordelijk voor het oogsten van licht in hogere planten en groene algen.

In Vitro Reconstructie van Licht-oogsten Complexen van planten en groene algen

Dit protocol beschrijft hoe je clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE) kunt voorbereiden en uitvoeren, een native scheidingstechniek voor niet-covalente biomoleculaire assemblages en eiwitten uit heterogene monsters die compatibel is met verschillende downstream-eiwitanalysetechnieken.

CN-GELFrEE - Clear Inheems Gel-uitgewassen vloeibare fractie Entrapment elektroforese

Een protocol voor het ontrafelen van plant thylakoïde eiwit complexe organisatie en samenstelling met blauwe inheemse polyacrylamide gel elektroforese (BN-pagina) en 2D-SDS-pagina wordt beschreven. Het protocol is geoptimaliseerd voor Arabidopsis thaliana, maar kan worden gebruikt voor andere plantensoorten met kleine wijzigingen.

Analyse van eiwitcomplexen thylakoïde membraan door blauwe inheemse gelelektroforese

Wij presenteren protocollen hierin voor hoog rendement isolatie van fysiologisch actief ze en eiwit vervoer testen voor de chloroplast twin arginine translocatie (cpTat), secretoire (cpSec1) en signaal erkenning deeltje (cpSRP) trajecten.

Isolatie van fysiologisch actief thylakoiden en hun gebruik in energie-afhankelijke proteÃ¯ne vervoer Assays

Hier presenteren we een protocol te halen, op te lossen en te identificeren mitochondriale supercomplexen die blootstelling aan detergenten en Coomassie blauw minimaliseert. Dit protocol biedt een optimaal evenwicht tussen resolutie, en behoud van enzymactiviteiten, terwijl het minimaliseren van het risico om labiele proteïne-eiwitinteractie te verliezen.

Hybride duidelijke/blauwe inheemse elektroforese voor de scheiding en de analyse van mitochondrial Ademhalingsketen supercomplexen

Het huidige protocol beschrijft de isolatie van fycobilisomen uit cyanobacteriën door centrifugering door middel van een discontinue sucrosedichtheidsgradiënt. De fracties van intacte fycobilisomen worden bevestigd door 77K fluorescerend emissiespectrum en SDS-PAGE-analyse. De resulterende fycobilisoomfracties zijn geschikt voor negatieve kleuring van TEM en massaspectrometrie-analyse.

Isolatie en karakterisering van intact fycobilisoom in cyanobacteriën

Meer dan de helft van de eiwitten zijn kleine eiwitten (moleculaire massa &lt;200 kDa) die zijn uitdagend voor zowel de elektronenmicroscoop beeldvorming en driedimensionale reconstructies. Geoptimaliseerde negatieve kleuring is een robuuste en high-throughput protocol hoog contrast en relatief hoge resolutie (~ 1 nm) beelden van kleine asymmetrische eiwitten of complexen onder verschillende fysiologische omstandigheden te verkrijgen.

Geoptimaliseerd Negatieve kleuring: een High-throughput protocol voor de behandeling Kleine en Asymmetric Protein Structure door Electron Microscopy

Een protocol over de karakterisering en toepassing van vijf verschillende passieve bemonsteringsapparaten wordt gepresenteerd.

Karakterisering en toepassing van passieve samplers voor Monitoring van bestrijdingsmiddelen in het water

Leer de scheiding van spinazie thylakoïde eiwitcomplexen door Native Green Gel elektroforese en karakterisering met TCSPC. Deze snelle, robuuste methode analyseert monsters binnen één dag.

Scheiding van spinazie thylakoïde eiwitcomplexen door elektroforese van het Gel van de Native groen en karakterisering van de Band met Time-Correlated Single Photon Counting (Video) | JoVE Journal

Scheiding van spinazie thylakoïde eiwitcomplexen door elektroforese van het Gel van de Native groen en karakterisering van de Band met Time-Correlated Single Photon Counting

Meer video's verkennen