De grootschalige productie van recombinante RNAs op een circulaire steiger met behulp van een systeem van Viroïde afkomstige in Escherichia coli

Deze methode kan helpen om grote hoeveelheden recombinant RNAs van belang voor toepassing in onderzoek of industrie te produceren. Het belangrijkste voordeel is dat recombinant RNA wordt geproduceerd in Escherichia coli in een goedkoop proces dat gemakkelijk kan worden opgeschaald. Belangrijk is dat het RNA wordt geproduceerd op een cirkelvormige RNA steiger, die de zuivering naar homogeniteit vergemakkelijkt.

In tegenstelling tot DNA of eiwitten worden RNAs van belang niet gemakkelijk in grote hoeveelheden geproduceerd in biofabrieken, zoals een Escherichia coli-cultuur. Onze methode is gebaseerd op co-expressie van het RNA van belang ingevoegd in een zeer stabiele cirkelvormige steiger en het toepassen van een ligase die RNA circularisatie bemiddelt. Het ronde RNA steiger is afgeleid van een gepatenteerde viroid.

Viroids zijn relatief kleine, niet-coiling, zeer base-paired circulaire RNAs die besmettelijk zijn voor sommige hogere planten. We kunnen tientallen milligram van het recombinant RNA per liter bacteriële cultuur produceren in reguliere laboratoriumomstandigheden. Om deze procedure te starten, versterkt u de cDNA per PCR zoals beschreven in het tekstprotocol.

Voeg vervolgens 100 nanogram van de plasmide pLELVd-BZB toe aan een buis van 0,5 milliliter. Voeg 10 U van het type IIS beperking enzym BpiI en genoeg van buffer G om een 20 microliter reactie te creëren. Incubeer op 37 graden Celsius gedurende een uur om de plasmide te verteren.

Daarna, scheiden de PCR en spijsvertering producten door elektroforese in een een procent agarose gel in TAE buffer. Vlek de gel door het te schudden in 200 milliliter ethidium bromide bij een concentratie van 0,5 microgram per milliliter. Visualiseer het DNA met behulp van een UV-transilluminator.

Gebruik een scalpel om de banden uit te snijden die overeenkomen met de versterkte cDNA en de BpiI verteerde plasmid. Met behulp van silica gel kolommen, elute de DNAs van de gel fragmenten. Kwantificeer de concentratie van het DNA door spectrofotometrische analyse.

Het opzetten van een Gibson Assembly reactie met behulp van de versterkte cDNA en de verteerde plasmid. Broed een uur lang op 50 graden Celsius. Gebruik vervolgens een silicagelkolom om de reactie te zuiveren.

Na elektroporating bevoegde E.coli DH5-Alpha Cellen, kies verschillende witte kolonies en breng ze naar vloeibaar LB medium. Laat de kolonies 's nachts groeien bij 37 graden Celsius. Gebruik vervolgens een miniprep kit om de plasmiden te zuiveren, en analyseren hun maten door elektroforese in een een procent agarose gel in TAE buffer.

Ten eerste co-electro-electroporate de geselecteerde E.coli stam met zowel de pLELVd-BZB derivaat die de cDNA die overeenkomt met het RNA van belang en de plasmid P15LTRNISM co-express de aubergine tRNA ligase. Breng SOC vloeibaar medium in de elektroporatie cuvette om de cellen te herstellen, en incubeer op 37 graden Celsius gedurende een uur. Dan, plaat de bacteriën op LB vaste medium met 50 microgram per milliliter ampicilline, en 34 microgram per milliliter chlooramphenicol.

Incubeer op 37 graden Celsius 's nachts. De volgende dag, voeg 250 milliliter van vloeibare TB medium, met 50 microgram per milliliter ampicilline, en 34 microgram per milliliter chlooramphenicol, aan een een liter verbijsterd Erlenmeyer fles. Haal de geïncubeerde E.Coli, en kies dan een kolonie en inent het medium in de kolf.

Incubeer bij 37 graden Celsius met krachtig schudden bij 180 RPM gedurende 12 tot 16 uur voor het oogsten van de bacteriën. Giet de geoogste E.Coli cultuur in een 250 milliliter centrifuge fles en spin de cellen op 14,000 G gedurende 10 minuten. Gooi de supernatant weg en verleg de cellen in 30 milliliter water.

Breng deze suspensie over naar een centrifugebuis en draai de cellen opnieuw naar beneden met behulp van de vorige voorwaarden. Gooi de supernatant en voeg 10 milliliter chromatografie buffer aan de cel pellet. Vortex om de cellen in de buffer opnieuw op te plaatsen.

Voeg een volume fenol: chloroform en vortex krachtig om de cellen te breken. Dan, centrifuge op 12,000 G gedurende 10 minuten. Herstel de waterige fase, voeg een volume chloroform, en vortex krachtig.

Centrifuge op 12.000 G gedurende 10 minuten. Filtreer hierna het RNA-preparaat door een spuitfilter van 45 micrometer. Zuiveren van de RNA met behulp van een een milliliter diethyl ethanol amine kolom aangesloten op een vloeibare chromatografie systeem.

Pas de stroomsnelheid aan op één milliliter per minuut en vereenig de kolom met 10 milliliter chromatografiebuffer. Laad vervolgens het monster en was de kolom met 10 milliliter chromatografiebuffer. Elute het RNA met 20 milliliter elutie buffer, en verzamel een milliliter aliquots.

Met behulp van tweedimensionale polyacrylamide gel elektroforese, scheiden de cirkelvormige RNAs van hun lineaire tegenhangers. Bereid eerst een vijf procent polyacrylamidegel in TBE-buffer en met acht molaire ureum zoals beschreven in het tekstprotocol. Meng 20 microliter van de RNA-preparaten met één volume laadbuffer.

Broed op 95 graden Celsius in een verwarmingsblok gedurende 1,5 minuten, en dan snap-cool op ijs. Laad de monsters in de polyacrylamidegel en voer de elektroforese uit onder de juiste omstandigheden voor de gelafmeting. Vlek hierna gedurende 15 minuten de gel in 0,5 microgram per milliliter ethidium bromide.

Was de gekleurde gel met water en visualiseer het RNA onder UV-licht. Elektroforetische analyse van verschillende recombinant plasmiden waarin verschillende cDNAs worden ingevoegd vertonen verschillende migraties in vergelijking met pLELVd-BZB. Merk op dat pLELVd-BZB de lacZ marker bevat, die wordt vervangen door de cDNA die overeenkomt met het RNA van belang, dus terwijl de migratie afhankelijk is van de grootte van de ingevoegde cDNA, zullen de recombinant plasmiden meestal sneller migreren dan de controlplasmid.

De productie van het recombinant RNA in co-geëlektreerde bacteriële culturen wordt gecontroleerd door het breken van de cellen en het analyseren van het RNA door het denatureren van PAGINA. De sterke banden kunnen worden gezien, die aan lege ELVd en chimeric ELVd vormen beantwoorden, waarin de verschillende RNAs van belang werden opgenomen. Interessant is dat een groot deel van het recombinant RNA wordt gezien als een cirkelvormige vorm.

De circulariteit van de belangrijkste fractie wordt waargenomen door een combinatie van twee PAGE's te gebruiken onder denatureringsomstandigheden bij hoge en lage ionische sterkte. De RNA-voorbereiding kan verder worden gezuiverd door anionuitwisselingschromatografie. Zoals hier te zien, is de E.Coli RNA efficiënt behouden op een lage ionische sterkte, en vervolgens eluted op hoge ionische sterkte, met het grootste deel van het RNA wordt verzameld in fracties twee en drie.

Recombinant RNA kan verder worden gezuiverd tot homogeniteit door 2-D elektroforese. Dit protocol maakt het mogelijk om grote hoeveelheden recombinant RNA in Escherichia coli en zuivering tot homogeniteit te produceren dankzij de circulariteit van het eindproduct. Vergeet niet dat de RNA van belang resultaten ingebed in een cirkel RNA steiger afgeleid van een plant viroid.

Als u beide moieties wilt scheiden, moet u een standaardstrategie gebruiken, zoals ribozymes, DNAzymes of RNase H.De opbrengst van dit protocol is afhankelijk van het specifieke RNA van belang, omdat kleine RNA's waarschijnlijk in hogere hoeveelheden worden geproduceerd dan grotere. Voor grootschaligere uitdrukkingen, rekening mee houden dat een optimale tijd om bacteriën te oogsten afhankelijk is van vele factoren, waaronder de E.Coli stam, cultuur medium, en groeiomstandigheden. Wij raden u aan een voorlopige cursustest aan om het optimale productievenster in uw specifieke omstandigheden te vinden.

Vergeet niet dat de recombinant RNAs zich van voorbijgaande aard ophopen in bacteriële cellen, en dat ze volledig verdwijnen in de late groeifase.