Analyse van β-Amyloid-geïnduceerde afwijkingen op fibrine Clot structuur door spectroscopie en Scanning elektronen microscopie
30 november 2018
Hier zijn twee methoden die afzonderlijk of in combinatie kunnen worden gebruikt voor het analyseren van het effect van bèta-amyloid op fibrine clot structuur. Inbegrepen is een protocol voor het maken van een in vitro fibrine clot, gevolgd door clot turbiditeit en scanning elektronen microscopie methodes.
Het belangrijkste voordeel van deze op plaat gebaseerde troebelheidstest is dat het snel is en het mogelijk maakt om verschillende amyloïde-bètafibrinogen-interactieremmers in één keer te screenen zonder geavanceerde setup of vereisten. De hoofdverbindingen die zich in de fibrin troebelheidstest bevinden, kunnen verder worden geëvalueerd op hun vermogen om a-bèta-geïnduceerde structurele afwijking in de fibrinstols te herstellen die worden geanalyseerd door elektronenmicroscopie te scannen. Visuele demonstratie van stolselvoorbereiding voor het scannen van elektronenmicroscopie analyse is van cruciaal belang als eventuele variaties in de voorbereiding kan bijdragen aan variaties binnen de experimentele resultaten.
De focus van deze demonstratie ligt hier op A-beta fibrinogen interacties. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast om andere interacties met andere eiwitten en de verbindingen met het fibrinstolsel te analyseren. Begin met het toevoegen van 1,5 micromolar vers bereide fibrinogen in 200 microliter stolselvormingsbuffer aan elke A-bèta-negatieve 42 die putten bevat en controleert en de plaat op een roterend platform bij kamertemperatuur uitbroedt.
Voeg na 30 minuten tegelijkertijd 30 microliters vers bereide trombineoplossing direct toe in het midden van fibrinogen-bevattende put om stolselvorming te starten en lees onmiddellijk de absorptie van de in vitro stolsels op 350 nanometer, waarbij de meting elke 30 tot 60 seconden in de loop van 10 minuten wordt herhaald. Om het effect van A-beta fibrinogen interactieremmers op fibrin stolsel structuur te evalueren, eerst gebruik tangen schoon te plaatsen, 12 millimeter siliconen glazen cirkel deksel slips aan individuele putten van een 12 put plaat en voeg 80 microliter fibrinogen op elke cover slip, voorzichtig verspreiden van de oplossing, zodat ze gelijkmatig worden verdeeld. Voeg 20 microliter tromber van trombine oplossing aan elke put om stolsel vorming te starten.
Bedek de plaat voor een incubatie van 30 tot 60 minuten bij kamertemperatuur en dompel elk stolsel voorzichtig onder in twee milliliter ijskoude natriumcaanolaatbuffer gedurende twee minuten, bedekt, bij kamertemperatuur twee keer, met behulp van een pijpzak van één milliliter om de buffer na elke wasbeurt zorgvuldig te verwijderen. Controleer na de laatste wasbeurt de status van de stolselvorming op de afdekslip en bevestig de stolsels in twee tot drie milliliter ijskoude 2%glutaraldehyde op ijs gedurende 30 minuten. Verwijder aan het einde van de incubatie voorzichtig de glutaraldehyde uit elke put en was de stolsels met een verse natriumcaanoodylaatbuffer zoals aangetoond op ijs.
Om de vaste stolsels te hydrateren in een gesorteerde serie van vijf minuten ijskoude ethanol wast op ijs zonder volledig verwijderen van de ethanol tussen de wasbeurten om de stolsels beschermd tegen blootstelling aan de lucht te houden. Breng tijdens de laatste 100% ethanolwas de afdekkingslip in een monsterhouder van een kritieke puntdroger, waarbij ten minste 1 wasmachine tussen elke afdeksel wordt gedrogeerd en plaats de houder in een met ethanol gevulde kritische puntdrogerkamer. Gebruik na een droogcyclus van 30 minuten koolstoftape om de afdekkingslips op individuele scanning elektronenmicroscopie stubs te monteren en breng de monsters over naar de sputtercoatingkamer van een vacuümsputtercoater.
Dan sputter laag minder dan 20 nanometer van goud palladium of andere geleidende materialen op de monsters voor 25 seconden op vier angstroms per seconde en beeld de monsters op een scanning elektronenmicroscoop uitgerust met een type twee secundaire elektronen detector op vier kilovolts. Fibrin stolsel vorming veroorzaakt verstrooiing van het licht dat door de oplossing, wat resulteert in een verhoogde troebelheid die plateaus aan het einde van de leesperiode. Wanneer fibrinogen in aanwezigheid van A-bèta 42 wordt geïncubeerd neemt de troebelheid van de oplossing met de kromme af die een maximumhoogte van ruwweg de helft bereikt die van fibrinogen alleen.
In aanwezigheid van een A-beta 42 interactieblokker wordt het effect van bèta-amyloïde verbeterd en is de troebelheid hoger dan die met A-beta alleen. Het effect van de blokker verschijnt niet als gevolg van achtergrondturbisiteit als de verbinding verandert niet de fibrin stolsel troebelheid wanneer A-beta afwezig is. Verder, stolselvorming in aanwezigheid van GPRP, een peptide waarvan bekend is dat interfereert met fibrin polymerisatie, toont een aanzienlijk verminderde troebelheid in vergelijking met de fibrin stolsel vorming in de afwezigheid van de remmer.
Fibrinogen gegenereerd in aanwezigheid van trombine en calciumchloride vormen slechts een fibrine gaas met langwerpige en intercalated draden van fibrin evenals grotere bundels. Wanneer A-beta aanwezig is, werden de fibrin draden dunner met verschillende kleverige klonters in aggregaten, wat duidt op A-beta geïnduceerde structurele afwijkingen. In overeenstemming met de resultaten van de troebelheidstest herstelt stolselvorming in aanwezigheid van een A-bèta fibrinogen interactieblokker gedeeltelijk de structuur van het fibrinstolsel van de A-bèta-geïnduceerde veranderingen als er minder klontjes worden waargenomen met deze behandeling.
De stollingstest en scanning elektronenmicroscoopanalyseprotocollen zijn geoptimaliseerd voor het snel en reproduceerbaar evalueren van verschillende A-bèta fibrinogen interactieremmers. En binnenkort gegevens zullen waardevolle informatie over fibrin stolsel vorming die kunnen worden toegepast op verdere studies zowel in vitro en in vivo.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert methoden om het effect van bèta-amyloïd op de structuur van fibrine-stolsels te analyseren, inclusief een in vitro protocol voor fibrine-stolsels en methoden voor stolsel-turbiditeit en scanning-elektronenmicroscopie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Biochemie
- Celbiologie
Achtergrond
- Beta-amyloïd is betrokken bij neurodegeneratieve ziekten.
- Fibrinebloedstolsels spelen een rol in diverse biologische processen.
- Inzicht in de structuur van fibrinebloedstolsels kan leiden tot nieuwe inzichten in ziektemechanismen.
- Eerdere studies hebben structurele abnormaliteiten in fibrinebloedstolsels aangetoond als gevolg van A-beta.
Doel van de studie
- Om het effect van bèta-amyloïde op de structuur van fibrinestolsels te evalueren.
- Om remmers van amyloïde-bèta-fibrinogeen-interacties te screenen.
- Om de preparatie van stolsels voor analyse met scanning-elektronenmicroscopie te demonstreren.
Gebruikte methoden
- Plaat-gebaseerde troebelsmeting voor snelle screening.
- Bereiding van in vitro fibrine-stolsels met behulp van fibrinogeen.
- Scanning-elektronenmicroscopie om de structuur van het stolsel te analyseren.
- Modificatie van protocollen om andere eiwitinteracties te bestuderen.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van hoofdverbindingen die de structurele integriteit herstellen.
- Een visuele demonstratie van de bereiding van het stolsel is cruciaal voor de consistentie.
- Variaties in de bereiding kunnen de experimentele resultaten beïnvloeden.
- Potentieel voor bredere toepassingen bij het bestuderen van proteïne-interacties.
Conclusies
- De gepresenteerde methoden zijn effectief voor het analyseren van de structuur van fibrinestolsels.
- Het screenen van inhibitoren kan leiden tot inzichten in therapeutische strategieën.
- Verder onderzoek kan dieper ingaan op de interacties van andere eiwitten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Dit protocol maakt een snelle, reproduceerbare screening van remmers van de interactie tussen amyloïde-beta en fibrinogeen mogelijk met behulp van een plaatgebaseerde troebelheidsmeting, ter ondersteuning van vroege targetvalidatie bij de therapeutische ontwikkeling voor de ziekte van Alzheimer. De methode levert kwantitatieve gegevens over stolselvorming en structurele bevestiging via scanning elektronenmicroscopie, wat de transitie van hit-to-lead faciliteert voor verbindingen die A-beta-geïnduceerde abnormaliteiten in fibrinestolsels verminderen. Door troebelheidsmetingen te integreren met SEM-beeldvorming, biedt deze aanpak mechanische risicoreductie en voorspellend vertrouwen voor ontdekkingsprogramma's gericht op het neurovasculaire systeem.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroegtijdige ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt de therapeutische hypothese dat de interactie tussen A-beta en fibrinogeen pathologische stolselvorming bij de ziekte van Alzheimer aanstuurt.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk door de troebeling van het stolsel te meten als directe readout van de inhibitie van de A-beta-fibrinogeenbinding.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfoliotriage door verbindingen te identificeren die de normale structuur van het fibrinestolsel herstellen, wat wijst op target-engagement en biologische risicoreductie.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor analyse: De geoptimaliseerde troebelsheidsanalyse is snel, zeer reproduceerbaar en compatibel met multi-well plaatformaten voor het screenen van grote compound-bibliotheken.
- Kwantitatieve output: Meet de absorptie bij 350 nm over tijd, wat kinetische gegevens over stolselvorming oplevert die de effectiviteit van de inhibitor onderscheidt van achtergrondeffecten.
- Structurele bevestiging: Hit-compounds uit de troebelsheidsscreening worden gevalideerd met SEM om het herstel van de architectuur van het fibrinestolsel te visualiseren, waardoor wordt gegarandeerd dat hits geen assay-artefacten zijn.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor de ziekte: Modelleert een cerebrovasculair mechanisme van de Alzheimer-pathologie, waarbij A-beta wordt gekoppeld aan fibrinestolselafwijkingen die geassocieerd zijn met micro-infarcten en cerebrale amyloïde angiopathie.
- Translationele continuïteit: Verbindt in vitro target-interactie (turbiditeit) met de fenotypische stolselstructuur (SEM), wat mechanistische risicoreductie ondersteunt voorafgaand aan in vivo validatie.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Maakt go/no-go-beslissingen mogelijk op basis van dubbele criteria: inhibitie van de vertraging van stolselvorming en het omkeeren van structurele afwijkingen.
Integratie van Pijplijn en Workflow
De methode past binnen het vroege stadium van de ontdekkingsfase, waardoor hypothesetesting van de A-beta-fibrinogeen-interactie als een behandelbaar doelwit mogelijk wordt, waarbij de resultaten worden ingezet in workflows voor lead-identificatie en preklinische validatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door te kwantificeren hoe A-beta de troebeling en structuur van fibrine-stolsels verandert, waardoor de betrokkenheid van signaalpaden bij neurovasculaire dysfunctie wordt verduidelijkt.
- Screening: Biedt assay-gereedheid en reproduceerbaarheid voor high-throughput evaluatie van remmers van de A-beta-fibrinogeen-interactie in een 96-wells plaatformaat.
- Analytics: Levert troebelingkinetiek en SEM-gebaseerde structurele metrieken die een vergelijkende analyse mogelijk maken van de effecten van verbindingen op de vorming en architectuur van stolsels.
- Translationeel onderzoek: Verbindt doelremming aan fenotypisch herstel van het stolsel, wat aansluit bij de preklinische continuïteit voor neurovasculaire Alzheimer-modellen.
- Enterprise Reuse: De troebeling-SEM-workflow is een herbruikbaar platform dat toepasbaar is op andere eiwit-fibrinogeen-interacties buiten A-beta, ter ondersteuning van brede inspanningen voor doelwitvalidatie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellende betrouwbaarheid door biochemische inhibitie te koppelen aan structureel herstel van het stolsel, waardoor mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie wordt verminderd.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid via geoptimaliseerde protocollen voor de preparatie, het wassen, de fixatie en de beeldvorming van stolsels.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen door zowel functionele (troebeling) als structurele (SEM) validatie te vereisen, wat biologische risico's in een laat stadium vermindert.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk van inhibitoren die een dubbele correctie vertonen van zowel de vertraging in stolselvorming als de structurele pathologie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in eiwitpreparatie, assays voor stolselvorming en monsterpreparatie voor scanning-elektronenmicroscopie.
- Is afhankelijk van toegang tot een plaatlezer die kinetische absorbentiemetingen bij 350 nm kan uitvoeren en een vacuümsputtercoater met SEM-beeldvormingscapaciteit.
- Maakt standaardisatie van de stappen voor stolselfixatie, dehydratie en droging noodzakelijk om structurele artefacten te voorkomen die de SEM-interpretatie kunnen beïnvloeden.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het uitbreiden van het protocol naar andere eiwit-fibrinogeeninteracties, met name wat betreft buffersamenstelling en incubatietijden.
- Omvat praktische beperkingen zoals de noodzaak voor verse bereiding van reagentia en zorgvuldige behandeling om variabiliteit in het stolsel door blootstelling aan lucht of inconsistente wassing te voorkomen.
