Een In Vitro Model van een Parallel-plaat perfusie-systeem te bestuderen van de naleving van de bacteriële om te enten van weefsels

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de pathogenese van infectieve endocarditis, en pathobiogrammen door gebieden zoals het samenspel tussen bacteriën, bloedcellen en endotheelcellen langs het spierstelsel. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de weefseltransplantaten direct kunnen worden blootgesteld aan wederzijdse interacties met verschillende doelen, zoals bacteriën, bloedplaatjes en eiwitten in gestandaardiseerde stroomomstandigheden. De implicatie van deze techniek strekt zich uit tot onze therapie van infectieve endocarditis, omdat het belangrijke moleculaire interacties en factoren kan ontrafelen die een hoge infectiviteit van bepaalde weefsels stimuleren.

Deze methode geeft inzicht in pathogenese van vegetatievorming. Het kan ook van toepassing zijn in studies onderzoeken vasculaire doorlaatbaarheid, celmobiliteit, en gencelexpressie. Om te beginnen met het protocol, plaats een eerder voorbereide weefselbiopsie 10 millimeter in diameter, en dezelfde dikte tussen een microscoop dia en een acht millimeter cirkelvormige perforatie, en een rubberen pakking met het binnenoppervlak naar boven gericht, om contact te maken met de bacteriële suspensie.

Focus op de weefseltransplantatie oriëntatie terwijl geplaatst in de houder. Zorg ervoor dat het binnenoppervlak van het weefsel is al blootgesteld aan de bloedbaan gezichten tot contact opnemen met uw experimentele medium. Steek vervolgens uw houder met het weefsel in de pakkingplaat die is ingebed in het onderste metalen frame van de kamer.

Bevestig het bovenste metalen frame met de bijbehorende pakkingplaat op de bodem van de kamer met de eerder ingebrachte weefselhouder. Monteer vervolgens de hele kamer met acht schroeven en schroefmoeren. Zorg ervoor dat de kamerhoogte altijd hetzelfde is over grafts met behulp van een remklauw of liniaal.

Sluit vervolgens de flowkamer aan op een peristaltische pomp. Sluit vervolgens het vloeistofreservoir van 400 milliliter aan op de buizen. Doorsnede de weefsels met 100 milliliter suspensies van tien tot de zeven fluorescerende kolonievormende eenheden in fosfaat gebufferde zoutoplossing met de pure stress van drie dines per vierkante centimeter en de overeenkomstige stroomsnelheid van vier milliliter per minuut gedurende een uur met behulp van de peristieke pomp en het bacteriële reservoir.

Recirculeren continu de 100 milliliter bacteriële suspensie met behulp van dezelfde collectie reservoir. Na perfusie demontage van de kamer om het transplantaat los te laten. Was het weefselstuk twee keer met vier milliliter PBS in een 12-put plaat met behulp van een orbitale shaker gedurende drie minuten.

Snijd vervolgens het binnenste deel van het transplantaat met behulp van een huidbiopsie punch met een kleinere diameter. Plaats elke weefselbiopsie in een aparte buis van 14 milliliter met een milliliter steriele 0,9% natriumchloride. Maak de bacteriën 10 minuten los van het weefsel met behulp van een sonicatiebad.

Bereid een enkele 14 milliliter buis met 10 milliliter steriele 0,9% natriumchloride om seriële verdunningen van de bacteriële suspensie verkregen na sonicatie te maken. Label de buis nummer twee. Bereid drie 14 milliliter buizen met 10 milliliter steriele 0,9% natriumchloride voor voor seriële verdunningen van de eerste bacteriële suspensie die naar het profusie-experiment wordt gebracht.

Label de buizen nummer drie, nummer vier en nummer vijf. Vervolgens zet u drie agarplaten vast, één voor de bacteriële perfusie, een voor de controleperfusie van PBS en de derde voor de eerste bacteriële suspensie die wordt gebruikt voor perfusies. Label drie sectoren per plaat voor het weefselexperiment op de volgende manier:10-1, 10-3 en 10-4.

Als u het aantal kolonievormende eenheden in de bacteriële perfusing wilt tellen, labelt u de plaat als volgt:10-1, 10-3, 10-5 en 10-7. Vortex de buizen met de weefselbiopsie gedurende 15 seconden per stuk, om seriële verdunningen te maken. Om de seriële verdunningen voor te bereiden, breng 100 microliters van buis nummer één over naar buis nummer twee en draaikolk de buis om de oplossing grondig te mengen.

Verspreid 100 microliter van de inhoud van buis nummer één en nummer twee over de overeenkomstige sectoren, 10-1 en 10-3 van de agarplaat. Dan verspreid 10 microliters van buis nummer twee op sector 10 vier. Herhaal deze stap vier keer om vier afzonderlijke gezwellen te verkrijgen van elk volume van 10 microliter.

Om seriële verdunningen van de oorspronkelijke cultuur voor te bereiden, eerste vortex de verdunning gedurende 15 seconden en overdracht 100 microliter bacteriële suspensie naar buis nummer drie, en meng krachtig door vortexing. Voeg 100 microliters buis nummer drie toe aan buis nummer vier en meng opnieuw. Herhaal de procedure voor buis nummer vijf van buis nummer vier.

Verspreid 100 microliters van de inhoud van buizen nummer drie, nummer vier, nummer vijf, en de gelabelde initiële cultuur respectievelijk op sectoren 10-3, 10-5, 10-7, en 10-1 van de bloed agar plaat. Laat de bloedagar platen onder de laminaire kap aan de lucht drogen van de bacteriële spreads, meestal gedurende 10 minuten. Plaats daarna de platen op 37 graden Celsius voor nachtelijke incubatie.

Tel na nachtelijke incubatie de bacteriële kolonies om het aantal CDU's te verkrijgen. Onder pure stress voorwaarden, soortgelijke bacteriële gehechtheid over de verschillende graft weefsels werd waargenomen voor zowel staphylococcus aureus en staphylococcus epidermidis infectie. Volgens de procedures vertoonde streptococcus sanguinis een aanzienlijke vermindering van de aanhankelijkheid aan de boviene halsaderwand, in vergelijking met de vederneusardiumpatch.

Bij het vergelijken van de drie soorten bacteriën, streptococcus sanguinis presenteert aanzienlijk lagere hechting aan de boviene halsader wand ten opzichte van staphylococcus aureus en staphylococcus epidermidis. Tijdens een poging deze procedure, het is belangrijk om te onthouden te hebben voorbereid juiste weefsels van hetzelfde hoofd. Het zal zorgen voor vergelijkbare omstandigheden in alle experimentmonsters en de variabiliteit van gegevens tussen verschillende reeksen experimenten minimaliseren.

Na de ontwikkeling stelt deze techniek onderzoekers in staat om de complexe wanordesystemen stap voor stap te verkennen door hun in vitro modelbenaderingen te verrijken met verschillende elementen om volledige complexiteit op te bouwen in de buurt van de medische status.