Name: Een In Vitro Model van een Parallel-plaat perfusie-systeem te bestuderen van de naleving van de bacteriële om te enten van weefsels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Leer een in vitro stromingskamer-model om bacteriële hechting aan weefseltransplantaten te bestuderen. Deze methode onthult moleculaire interacties die infectieuze endocarditis veroorzaken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd gesponsord door een subsidie van het onderzoek Fonds KU Leuven (OT/14/097) gegeven aan RH. TRV was Postdoctoral Fellow van de onderzoeksstichting FWO - Vlaanderen (België; Verlenen van nummer - 12K0916N) en RH wordt ondersteund door het klinische onderzoek Fonds van UZ Leuven.

1. voorbereiding Graft weefsels van In Vitro Studies
Opmerking: Drie soorten weefsels werden gebruikt: boviene hartzakje patch (BP), Cryopreserved Homograft (CH) en boviene halsslagader transplantaties (BJV). In het geval van BJV conduit en CH (weefsel door de Europese Bank voor Homograft (EHB) verwerkt en opgeslagen in vloeibare stikstof voorafgaand aan het gebruiken), werden zowel de muur en de terugstroming folders gebruikt. BP patch en BJV conduit werden gekocht van de fabrikanten. Ontdooi de CH na de EHB instructies12vóór gebruik.
<ol><li>Spoel alle weefsels met 0,9% NaCl vóór gebruik.</li>
	<li>Bereiden weefsel biopsieën met behulp van een wegwerp Huidbiopt stoot op knip circulaire weefsel stukken (10 mm diameter).</li>
	<li>Alle weefsel patches op dezelfde hoogte met behulp van wegwerp steriele scalpels gesneden.</li>
	<li>Voor weefsels met Glutaaraldehyde (bijvoorbeeld BJV conduit) bevestigd, incubeer stukken van de prothese 's nachts bij 4 ° C met 200 g/L van menselijke albumine te neutraliseren de fixeerspray.</li>
	<li>Wassen uit residuen van Glutaaraldehyde met 0,9% NaCl in een plaat van de microtiterplaat.  Herhaal 3 keer gedurende 1 minuut.</li>
</ol>2. voorbereiding van de bacteriën van de perfusie experimenten
Opmerking: Drie bacteriële isolaten werden gebruikt: S. aureus Cowan (ATCC 12598), S. epidermidis ATCC 149900 en S. sanguinis NCTC 7864. S. aureus en S. epidermidis werden gekweekt bij 37 ° C in al soja Bouillon (TSB) en S. sanguinis werd gekweekt bij 37 ° C met 5% CO2 in hersenen hart infusie Bouillon (BHI).
<ol><li>Bereiden overnachting cultuur van bacteriën op een solide bloed agarplaat.<ol>
<li>Gebruik een steriele lus de bevroren bacteriën Schraap te enten op een bord bloed agar Mueller-Hinton voor overnachting cultuur bij 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gebruik een steriele inoculatie lus te halen een één kolonie van de overnachting bloed agar cultuur en enten in 10 mL van de TSB of BHI in een tube 14 mL en cultuur 's nachts bij 37 ° C.</li>
	<li>Centrifugeer overnachting culturen (3000 x g, 4 ° C, 10 min) en resuspendeer de pellets in 10 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Plaats 14 mL buizen op ijs.</li>
	<li>Bereiden van een aliquoot deel van 3.7 mg/mL oplossing van 5 (6) - carboxy - fluoresceïne N-hydroxy-succinimidyl ester (CF) in ethanol en opgeslagen bij-20 ° C. Verder verdunnen de voorraad voor CF 150 µg/mL met behulp van 'ultrazuiver' water. Opmerking: Buizen beschermen tegen licht met behulp van aluminiumfolie en opgeslagen bij-20 ° C.</li>
	<li>Centrifugeer de bacteriën (3000 x g, 4 ° C, 10 min) en resuspendeer de pellets in 800 µL van PBS en voeg 200 µL van de 150 µg/mL CF oplossing (eindconcentratie van 30 µg/mL gebruikt voor perfusie experimenten). Buizen beschermen tegen licht met aluminiumfolie en incubeer gedurende 30 min met behulp van een roteerschudapparaat.</li>
	<li>Na het labelen, blokkeren met 2% bovien serumalbumine (BSA) oplossing in PBS en spin (3000 x g, 4 ° C, 10 min). Volg met een wassen stap met behulp van 10 mL PBS en pellet bacteriën door middel van centrifugeren (3000 x g, 4 ° C, 10 min).</li>
	<li>Verdun bacteriën met PBS te verkrijgen 107 kolonie-vormende eenheden (kve) /mL (gecontroleerd door CFU tellen op Mueller-Hinton bloed agar platen), hetgeen overeenkomt met een OD600 (extinctie) van 0,65. Houd de buizen in het donker op het ijs voorafgaand aan perfusie experimenten. Opmerking. Houd in gedachten dat OD600 metingen het benaderende aantal bacteriën weerspiegelen. Als u wilt tellen de inoculatie van de effectieve dosis, is de seriële verdunning-methode een extra noodzakelijke stap om te controleren of de OD gebaseerd nummers, zoals beschreven in paragraaf 3.8.</li>
</ol>3. in vitro perfusie experimenten met behulp van een Parallel-plaat Flow kamer
<ol><li>Mount weefsel Biopten van 10 mm in diameter en dezelfde dikte (bereid in de stappen 1.1-1.5) in een kamer-stroomsysteem met de binnenzijde naar boven om contact met de bacteriële suspensie. Opmerking: De dezelfde dikte van het weefsel over verschillende transplantaten zorgt ervoor dat het dezelfde hoogte van het weefsel wordt bereikt in het kanaal waardoor de laminaire flow in alle omstandigheden. Alle elementen van de stroom kamer zijn gepresenteerd en beschreven in Figuur 1.<ol>
<li>Om te beginnen met het protocol, plaatst u de ronde weefsel stuk tussen een microscoopglaasje met een 8 mm ronde perforatie en een rubberen afdichting. Opmerking: Het microscoopglaasje bezit de film van de ultra-dunne bodem zodat de generatie van het gat van 8 mm. Samen met de rubberen vel, het bevestigt het weefsel zodat het rechtstreekse contact tussen het model en het stromend medium en voorkomt ook de dislocatie van de biopsie tijdens het experiment. Het oppervlak van het onderzochte weefsel, die is blootgesteld aan de stroom (kleinere diameter) kan niet worden gemanipuleerd door de verlostang.</li>
		<li>Plaats de houder met het weefsel in de pakking-werkblad dat is ingesloten in het metalen frame van de bodem van de kamer.</li>
		<li>Bevestig het bovenste metalen frame met het bijbehorende blad van de pakking op het onderste gedeelte van de kamer met het eerder ingevoegde weefsel houder. Vervolgens monteren van de hele kamer met acht schroeven en moeren schroef. Zorg ervoor dat de hoogte van de kamer altijd hetzelfde over transplantaties is. Opmerking: De hoogte van de kamer moet worden bepaald altijd op aanscherping van de schroeven. Gebruik een schuifmaat of liniaal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sluit de stroom zaal met een peristaltische pomp en de vloeistof reservoir met de buizen.</li>
	<li>De weefsels met schorsingen van 107 CFU/mL (gecontroleerd door CFU tellen en in verband met OD600 metingen) fluorescently-geëtiketteerden bacteriën in PBS met een schuifspanning van 3 dyne/cm2 (dyne per vierkante centimeter druk eenheid) door perfuse middelen van de peristaltische pomp (stroom tarief 4 mL/min) voor 1 h met gebruikmaking van een 400 mL bacteriële reservoir (In-house ontwerp, Figuur 1) geconditioneerd bij 37 ° C met behulp van een plaat thermostaat (Tabel van materialen).</li>
	<li>Recirculate continu de bacteriële schorsing van 100 mL met behulp van het dezelfde collectie reservoir.</li>
	<li>Na perfusie, ontmanteling van de kamer om te kunnen de prothese en het weefsel stukje twee keer met 4 mL PBS in een 12-well-plate met behulp van het laboratorium roteerschudapparaat gedurende 3 minuten elke wassen. Vervolgens knip het binnenste deel van de prothese met behulp van een Huidbiopt punch van een kleinere diameter.</li>
	<li>Plaats elke biopsie van weefsel in een aparte 14 mL-buis met 1 mL steriele 0.9% NaCl. Label de buis als #1.</li>
	<li>Loskoppelen van de bacteriën uit het weefsel met behulp van een ultrasoonapparaat bad voor 10 min (amplitude = 100% en frequentie = 45 kHz). Opmerking: Volledige detachement van bacteriën uit het weefsel protheses dienen te worden geëvalueerd op de incubatie van patches's nachts bij 37 ° C in TSB opgietvloeistof gevolgd door OD600 metingen ten opzichte van patches die zijn behandeld met een gratis oplossing van bacteriën te beheersen.</li>
	<li>Gebruik een seriële verdunning methode op Mueller-Hinton bloed agar platen wilt tellen CFUs.<ol>
<li>Voorbereiden van een enkele 14 mL-buis met 10 mL steriele zoutoplossing te maken van de seriële verdunningen van de bacteriële suspensie verkregen na ultrasoonapparaat. Label deze buis als #2. Opmerking: Voor elk weefsel experiment één buis met 10 mL van 0.9% NaCl is nodig.</li>
		<li>Bereiden van drie 14 mL buisjes met 10 mL steriele 0.9% NaCl voor seriële verdunningen van het eerste bacteriële suspensie in stap 2.7. Label de buizen als volgt #3, #4, #5. Opmerking: Deze stap is noodzakelijk om te weten van het echte CFU nummer in bacteriële suspensie gebruikt voor de perfusie-experiment.</li>
		<li>Vortex Meng elke buis voor 15 s. Vortex de buizen met de biopsie van weefsel, alsmede de eerste bacteriële suspensie te maken van de seriële verdunningen.</li>
		<li>Bereiden drie agar platen, twee voor het weefsel experiment (perfusie van bacteriën en controle perfusie van PBS) en de derde een voor de eerste bacteriële suspensie gebruikt voor perfusions.</li>
		<li>Label drie sectoren per plaat voor het weefsel experiment in de volgende manier 10-1, 10-3 en 10-4. Als u wilt tellen het aantal CFUs in de bacteriële perfusates, label de plaat als volgt: 10-1, 10-3, 10-5 en 10-7. Opmerking: Alle indicaties op de agar platen zoals 10-1, 10-3 , enzovoort verwijzen naar het definitieve aantal CFU/mL berekend op de volgende dag. Controle plaat is niet vereist voor alle sectoren. Vóór gebruik, moeten bloed agar platen worden geplaatst onder de motorkap van laminaire en geopend om overtollig vocht te verwijderen.</li>
		<li>Blijven de seriële verdunningen voorbereiden, Breng 100 µL van buis #1 aan buis #2 en meng krachtig met vortex.</li>
		<li>Verspreid 100 µL van de inhoud van buis #1 en #2 op de overeenkomstige sectoren 10-1 en 10-3 van de agarplaat. Ook verspreiden van 10 µL van buis #2 op de sector 10-4, herhaalt u deze stap 4 keer te verkrijgen 4 aparte gezwellen van elk volume van 10 µL. Opmerking: Als gevolg van het kleine volume dat wordt gebruikt voor beplating op de sector 10-4, is het raadzaam om meerdere aantal druppels te maken van een gemiddeld aantal volwassen CFUs.</li>
		<li>Ter voorbereiding van de seriële verdunningen van de oorspronkelijke cultuur, Breng 100 µL van bacteriële suspensie uit stap 2.7 aan buis #3 en meng krachtig met vortex. Voeg 100 µL van buis #3 aan buis #4 en meng goed, herhaal de procedure voor latere buis #5.</li>
		<li>Verspreid 100 µL van de inhoud van buizen #3, #4 en #5 de gecorrigeerde bacteriële suspensie (stap 2.7), respectievelijk naar sectoren 10-3, 10-5, 10-7 en 10-1 van het bloed agarplaat.</li>
		<li>Laat de bloed agar platen in de laminaire kap om lucht droog de bacteriële spreads, typisch voor 10 minuten. Daarna, plaats de platen bij 37 ° C voor overnachting incubatie.</li>
		<li>Na een incubatieperiode van overnachting, tellen de bacteriële kolonies te verkrijgen van het aantal CFUs die voortvloeien uit de hechting aan de weefsel biopsieën, alsmede CFUs/mL in de startende bacteriële suspensie gebruikt voor de perfusie. Uitdrukkelijke resultaat als kve/cm2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. fluorescentie microscopie van zelfklevend bacteriën te enten weefsels op perfusie
<ol><li>Na perfusie, wassen weefsel stukken met PBS (zie stap 3.5) en knip het binnenste deel van een prothese met behulp van een punch van een kleinere diameter.</li>
	<li>Een plaat van 6-goed voor te bereiden en druppels van montage medium (Tabel of Materials) plaats.</li>
	<li>Plaats elk stukje weefsel met zijn perfused oppervlakte naar beneden op een enkele druppel van montage medium.</li>
	<li>Lees een plaat met behulp van een scanner van de fluorescentie (Tabel van materialen). Instellen van de parameters van excitatie en emissie golflengten volgens een fluorophore gebruikt voor het labelen van bacteriële.</li>
</ol>

<ol><li>Que, Y. A., Moreillon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infective+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Infective endocarditis.</a> Nature Reviews Cardiology. 8 (6), 322-336 (2011).</li>
<li>Werdan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+infective+endocarditis%3A+pathogen-host+interaction+and+risk+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of infective endocarditis: pathogen-host interaction and risk states.</a> Nature Reviews Cardiology. 11 (1), 35-50 (2014).</li>
<li>Moreillon, P., Que, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infective+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Infective endocarditis.</a> The Lancet. 363 (9403), 139-149 (2004).</li>
<li>Jalal, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+propensity+of+bovine+jugular+vein+material+to+bacterial+adhesions%3A+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Selective propensity of bovine jugular vein material to bacterial adhesions: An in vitro study.</a> International Journal of Cardiology. 198, 201-205 (2015).</li>
<li>Sharma, A., Cote, A. T., Hosking, M. C. K., Harris, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Systematic+Review+of+Infective+Endocarditis+in+Patients+With+Bovine+Jugular+Vein+Valves+Compared+With+Other+Valve+Types%5BTitle%5D)+AND+%22JACC+Cardiovascular+Interventions%22%5BJournal%5D)">A Systematic Review of Infective Endocarditis in Patients With Bovine Jugular Vein Valves Compared With Other Valve Types.</a> JACC Cardiovascular Interventions. 10 (14), 1449-1458 (2017).</li>
<li>Malekzadeh-Milani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+and+predictors+of+Melody%28R%29+valve+endocarditis%3A+a+prospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Cardiovascular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Incidence and predictors of Melody(R) valve endocarditis: a prospective study.</a> Archives of Cardiovascular Diseases. 108 (2), 97-106 (2015).</li>
<li>Hill, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+prosthetic+valve+infective+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Management of prosthetic valve infective endocarditis.</a> American Journal of Cardiology. 101 (8), 1174-1178 (2008).</li>
<li>Claes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clumping+factor+A%2C+von+Willebrand+factor-binding+protein+and+von+Willebrand+factor+anchor+Staphylococcus+aureus+to+the+vessel+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Clumping factor A, von Willebrand factor-binding protein and von Willebrand factor anchor Staphylococcus aureus to the vessel wall.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (5), 1009-1019 (2017).</li>
<li>Fowler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+invasion+by+Staphylococcus+aureus+involves+a+fibronectin+bridge+between+the+bacterial+fibronectin-binding+MSCRAMMs+and+host+cell+beta1+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins.</a> European Journal of Cell Biology. 79 (10), 672-679 (2000).</li>
<li>Patti, J. M., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+adhesins+recognizing+extracellular+matrix+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microbial adhesins recognizing extracellular matrix macromolecules.</a> Current Opinion in Cell Biology. 6 (5), 752-758 (1994).</li>
<li>Massey, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin-binding+protein+A+of+Staphylococcus+aureus+has+multiple%2C+substituting%2C+binding+regions+that+mediate+adherence+to+fibronectin+and+invasion+of+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fibronectin-binding protein A of Staphylococcus aureus has multiple, substituting, binding regions that mediate adherence to fibronectin and invasion of endothelial cells.</a> Cellular Microbiology. 3 (12), 839-851 (2001).</li>
<li>Jashari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Belgian+and+European+experience+with+the+European+Homograft+Bank+%28EHB%29+cryopreserved+allograft+valves--assessment+of+a+20+year+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Chirurgica+Belgica%22%5BJournal%5D)">Belgian and European experience with the European Homograft Bank (EHB) cryopreserved allograft valves--assessment of a 20 year activity.</a> Acta Chirurgica Belgica. 110 (3), 280-290 (2010).</li>
<li>Cheatham, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+hemodynamic+outcomes+up+to+7+years+after+transcatheter+pulmonary+valve+replacement+in+the+US+melody+valve+investigational+device+exemption+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Clinical and hemodynamic outcomes up to 7 years after transcatheter pulmonary valve replacement in the US melody valve investigational device exemption trial.</a> Circulation. 131 (22), 1960-1970 (2015).</li>
<li>Que, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen+and+fibronectin+binding+cooperate+for+valve+infection+and+invasion+in+Staphylococcus+aureus+experimental+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen and fibronectin binding cooperate for valve infection and invasion in Staphylococcus aureus experimental endocarditis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 201 (10), 1627-1635 (2005).</li>
<li>Veloso, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+adherence+to+graft+tissues+in+static+and+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Bacterial adherence to graft tissues in static and flow conditions.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (1), 325-332 (2018).</li>
<li>Liesenborghs, L., Verhamme, P., Vanassche, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus%2C+master+manipulator+of+the+human+hemostatic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus, master manipulator of the human hemostatic system.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (3), 441-454 (2018).</li>
<li>Chiu, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+increases+ICAM-1+and+decreases+VCAM-1+and+E-selectin+expressions+induced+by+tumor+necrosis+factor-%5Balpha%5D+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Artheriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Shear stress increases ICAM-1 and decreases VCAM-1 and E-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells.</a> Artheriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (1), 73-79 (2004).</li>
<li>Jockenhoevel, S., Zund, G., Hoerstrup, S. P., Schnell, A., Turina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+tissue+engineering%3A+a+new+laminar+flow+chamber+for+in+vitro+improvement+of+mechanical+tissue+properties%5BTitle%5D)+AND+%22ASAIO+Journal%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular tissue engineering: a new laminar flow chamber for in vitro improvement of mechanical tissue properties.</a> ASAIO Journal. 48 (1), 8-11 (2002).</li>
<li>Veltrop, M. H. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Species-+and+Strain-Dependent+Induction+of+Tissue+Factor+in+Human+Vascular+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Bacterial Species- and Strain-Dependent Induction of Tissue Factor in Human Vascular Endothelial Cells.</a> Infection and Immunity. 67 (11), 6130-6138 (1999).</li>
</ol>

Recente klinische waarnemingen geven speciale alertheid IE als een complicatie bij patiënten die klep vervanging van de RVOT6,13heeft ondergaan. Dysfunctie van de geïmplanteerde klep in IE is het gevolg van bacteriële interactie met de endovasculaire prothese leidt tot uitgebreide inflammatoire en procoagulatie reacties1,14. De gepresenteerde nieuwe in vitro model konden we onderzoeken als versch...

Staphylococcus aureus (S. aureus) maakt gebruik van een verscheidenheid van virulentie strategieën te omzeilen het immuunsysteem verdediging hostsysteem koloniseren van biologische of niet-biologische oppervlakken geïmplanteerd in de menselijke circulatie, hetgeen tot ernstige intravasculaire infecties zoals sepsis leidt en IE1,2,3,4,5. IE blijft een belangrijke behandeling verbonden complicatie bij patiënten na implantatie van prothetische hartkleppen terwijl individuele factoren die bijdragen aan het begin van de IEare niet nog volledig begrepen6,7. Onder stromingscondities tegenkomen bacteriën schuintrekken krachten, die ze moeten overwinnen om te voldoen aan het vaartuig muur8. Modellen, waarmee het samenspel tussen bacteriën en prothetische ventiel weefsel of endotheel onder stroom te bestuderen, zijn van belang als zij de in vivo situatie meer weerspiegelen.
Verschillende specifieke mechanismen vergemakkelijken bacteriële aanhankelijkheid naar endotheliale cellen (ECs) en naar de blootgestelde subendothelial matrix (ECM) leiden tot weefsel kolonisatie en rijping van vegetaties, essentiële eerste stappen in IE9wordt. Diverse Staphylococcus oppervlakte-eiwitten of MSCRAMMs (microbiële oppervlakte componenten herkennen adhesieve matrix moleculen) worden omschreven als bemiddelaars wrijvingscoëfficiënt naar host cellen en aan ECM eiwitten door interactie met moleculen zoals fibronectin, fibrinogeen, collageen en von Willebrand factor (VWF)8,10,11. Echter met het oog op de intra moleculaire vouwen van sommige virulentiefactoren, meestal studeerde in statische toestand, kunnen veel van deze interacties hebben verschillende relevantie in endovasculair infecties in het bloed circuleren.
Daarom presenteren we een in-house ontworpen in vitro parallel-plaat flow kamer model, waarmee de beoordelingvan bacteriële aanhankelijkheid aan verschillende onderdelen van ECM en ECs in het kader van weefsel transplantaten geïmplanteerd in de positie van de RVOT. Het algemene doel van de in dit werk beschreven methode is om te studeren van mechanismen van interactie tussen bacteriën en onderliggende endovasculair weefsels in stromingscondities, die nauw verband houden met het milieu in vivo van bloedbaan ziekteverwekkers zoals S. aureus. Deze nieuwe aanpak richt zich op de gevoeligheid van graft weefsel oppervlakken om bacteriële aanhankelijkheid aan het identificeren van mogelijke risicofactoren voor de ontwikkeling van IE.

<table><tbody><tr><td>Bovine Pericardium (BP) patch, Supple Peri-Guard Pericardium</td><td>Synovis Surgical Innovations, USA</td><td>PC-0404SN</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Jugular Vein conduits (BJV)</td><td>Contegra conduit; Medtronic Inc, USA</td><td>M333105D001</td><td></td></tr><tr><td>CH cryopreserved homograft</td><td>European Homograft Bank (EHB)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Acu-Punch</td><td>Acuderm Inc, USA</td><td>P850 (8 mm); P1050 (10 mm)</td><td></td></tr><tr><td>human Albumin</td><td>Flexbumin; Baxter, Belgium</td><td>BE171464 LOT:16G12C</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic soy broth (TSB)</td><td>Fluka, Steinheim, Germany</td><td>22092-500G</td><td></td></tr><tr><td>Heart infusion broth (BHI)</td><td>Fluka</td><td>53286-500G</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS).</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>5(6)-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide ester (CF)</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>21878-100MG-F</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump (MODEL ISM444B)</td><td>Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Germany</td><td>631942-2</td><td></td></tr><tr><td>Sonication bath</td><td>VWR Ultrasonic Cleaner; VWR, Radnor, Pa</td><td>142-6044</td><td>230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Invitrogen by ThermoFisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>InCell Analyzer 2000 (fluorescence scanner)</td><td>GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa</td><td>29027886</td><td></td></tr><tr><td>Arium Pro VF - ultrapure water - H2O MilliQ</td><td>Millipore</td><td>87206462</td><td></td></tr><tr><td>Microscopic slides - Tissue Culture Chambers (1-well)</td><td>Sarstedt</td><td>94.6140.102</td><td></td></tr><tr><td>1-well on Lumox detachable</td><td>Sarstedt</td><td>94.6150.101</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel - surgical Blades</td><td>Swann-Morton</td><td>311</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Silicone Tubing, 1/8"ID x 1/4"OD</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-95702-06</td><td>Temperature range: &ndash;80 to 200&deg;C Sterilize: With ethylene oxide, gamma irradiation, or autoclave for 30 min, 15 psi of pressure</td></tr><tr><td>PharMed BPT Tubing</td><td>Saint-Gobain</td><td>AY242012</td><td>Autoclavable 30 min at 121&deg;C</td></tr><tr><td>Tygon LMT-55 Tubing</td><td>Saint Gobain Performance Plastics&trade;</td><td>15312022</td><td></td></tr><tr><td>Thermostat</td><td>BMG BIOMEDIZINTECHNIK</td><td>300-0042</td><td>230V, 90VA, 50Hz</td></tr></tbody></table>

een in vitro model van een parallel-plaat perfusie-systeem te bestuderen van de naleving van de bacteriële om te enten van weefsels

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Verschillende ventielen leidingen en kleppen stent gemonteerde worden gebruikt voor de vervanging van de klep van rechts-ventriculaire uitstroom tractus (RVOT) bij patiënten met aangeboren hartafwijkingen. Wanneer using prothetische materialen toch, zijn deze protheses gevoelig voor bacteriële infecties en verschillende antwoorden van de gastheer.
Identificatie van bacteriële en gastheer factoren die een vitale rol in de endovasculaire hechting van micro-organismen spelen is van belang om de pathofysiologie van het intreden van infecties zoals infectieuze endocarditis (IE) beter te begrijpen en om preventieve strategieën. Daarom is de ontwikkeling van bevoegde modellen te onderzoeken van bacteriële hechting fysiologische schuintrekken omstandigheden noodzakelijk. Hier beschrijven we het gebruik van een nieuw ontworpen in vitro perfusie kamer op basis van parallelle platen waarmee dat de studie van bacteriële aanhankelijkheid aan verschillende onderdelen van graft weefsels zoals blootgesteld extracellulaire matrix, endotheliale cellen en inerte gebieden . Deze methode in combinatie met de kolonie-vormende eenheid (CFU) tellen is voldoende om te evalueren van de neiging van graft materialen naar bacteriële hechting onder stroom. Verder kan, de stroomsysteem van de kamer worden gebruikt om te onderzoeken van de rol van bloedbestanddelen in bacteriële hechting schuintrekken omstandigheden. We toonden aan dat de bron van weefsel, hun bovengrondse morfologie en bacteriesoorten specificiteit zijn niet de belangrijkste bepalende factoren in bacteriële aanhankelijkheid aan weefsels met behulp van onze in-house ontworpen in vitro perfusie model enten.

Om beter inzicht in de mechanismen achter IE ontwikkeling, dit model in staat stelt de evaluatie van bacteriële en weefsel verbonden factoren aanwezig is in de situatie in vivo van begin van de infectie.
In detail, de aanpak van nieuwe in vitro toestaat te kwantificeren van bacteriële hechting in stromingscondities aan verschillende graft weefsels door zoogdierlevercellen fluorescently geëtiketteerde b...

We beschrijven een in-house ontworpen in vitro flow kamer model, waardoor het onderzoek naar bacteriële aanhankelijkheid aan het enten van de weefsels.

Een In Vitro Model van een Parallel-plaat perfusie-systeem te bestuderen van de naleving van de bacteriële om te enten van weefsels

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de pathogenese van infectieve endocarditis, en pathobiogrammen door gebieden zoals het samenspel tussen bacteriën, bloedcellen en endotheelcellen langs het spierstelsel. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de weefseltransplantaten direct kunnen worden blootgesteld aan wederzijdse interacties met verschillende doelen, zoals bacteriën, bloedplaatjes en eiwitten in gestandaardiseerde stroomomstandigheden. De implicatie van deze techniek strekt zich uit tot onze therapie van infectieve endocarditis, omdat het belangrijke moleculaire interacties en factoren kan ontrafelen die een hoge infectiviteit van bepaalde weefsels stimuleren.Deze methode geeft inzicht in pathogenese van vegetatievorming. Het kan ook van toepassing zijn in studies onderzoeken vasculaire doorlaatbaarheid, celmobiliteit, en gencelexpressie. Om te beginnen met het protocol, plaats een eerder voorbereide weefselbiopsie 10 millimeter in diameter, en dezelfde dikte tussen een microscoop dia en een acht millimeter cirkelvormige perforatie, en een rubberen pakking met het binnenoppervlak naar boven gericht, om contact te maken met de bacteriële suspensie.Focus op de weefseltransplantatie oriëntatie terwijl geplaatst in de houder. Zorg ervoor dat het binnenoppervlak van het weefsel is al blootgesteld aan de bloedbaan gezichten tot contact opnemen met uw experimentele medium. Steek vervolgens uw houder met het weefsel in de pakkingplaat die is ingebed in het onderste metalen frame van de kamer.Bevestig het bovenste metalen frame met de bijbehorende pakkingplaat op de bodem van de kamer met de eerder ingebrachte weefselhouder. Monteer vervolgens de hele kamer met acht schroeven en schroefmoeren. Zorg ervoor dat de kamerhoogte altijd hetzelfde is over grafts met behulp van een remklauw of liniaal.Sluit vervolgens de flowkamer aan op een peristaltische pomp. Sluit vervolgens het vloeistofreservoir van 400 milliliter aan op de buizen. Doorsnede de weefsels met 100 milliliter suspensies van tien tot de zeven fluorescerende kolonievormende eenheden in fosfaat gebufferde zoutoplossing met de pure stress van drie dines per vierkante centimeter en de overeenkomstige stroomsnelheid van vier milliliter per minuut gedurende een uur met behulp van de peristieke pomp en het bacteriële reservoir.Recirculeren continu de 100 milliliter bacteriële suspensie met behulp van dezelfde collectie reservoir. Na perfusie demontage van de kamer om het transplantaat los te laten. Was het weefselstuk twee keer met vier milliliter PBS in een 12-put plaat met behulp van een orbitale shaker gedurende drie minuten.Snijd vervolgens het binnenste deel van het transplantaat met behulp van een huidbiopsie punch met een kleinere diameter. Plaats elke weefselbiopsie in een aparte buis van 14 milliliter met een milliliter steriele 0,9% natriumchloride. Maak de bacteriën 10 minuten los van het weefsel met behulp van een sonicatiebad.Bereid een enkele 14 milliliter buis met 10 milliliter steriele 0,9% natriumchloride om seriële verdunningen van de bacteriële suspensie verkregen na sonicatie te maken. Label de buis nummer twee. Bereid drie 14 milliliter buizen met 10 milliliter steriele 0,9% natriumchloride voor voor seriële verdunningen van de eerste bacteriële suspensie die naar het profusie-experiment wordt gebracht.Label de buizen nummer drie, nummer vier en nummer vijf. Vervolgens zet u drie agarplaten vast, één voor de bacteriële perfusie, een voor de controleperfusie van PBS en de derde voor de eerste bacteriële suspensie die wordt gebruikt voor perfusies. Label drie sectoren per plaat voor het weefselexperiment op de volgende manier:10-1, 10-3 en 10-4.Als u het aantal kolonievormende eenheden in de bacteriële perfusing wilt tellen, labelt u de plaat als volgt:10-1, 10-3, 10-5 en 10-7. Vortex de buizen met de weefselbiopsie gedurende 15 seconden per stuk, om seriële verdunningen te maken. Om de seriële verdunningen voor te bereiden, breng 100 microliters van buis nummer één over naar buis nummer twee en draaikolk de buis om de oplossing grondig te mengen.Verspreid 100 microliter van de inhoud van buis nummer één en nummer twee over de overeenkomstige sectoren, 10-1 en 10-3 van de agarplaat. Dan verspreid 10 microliters van buis nummer twee op sector 10 vier. Herhaal deze stap vier keer om vier afzonderlijke gezwellen te verkrijgen van elk volume van 10 microliter.Om seriële verdunningen van de oorspronkelijke cultuur voor te bereiden, eerste vortex de verdunning gedurende 15 seconden en overdracht 100 microliter bacteriële suspensie naar buis nummer drie, en meng krachtig door vortexing. Voeg 100 microliters buis nummer drie toe aan buis nummer vier en meng opnieuw. Herhaal de procedure voor buis nummer vijf van buis nummer vier.Verspreid 100 microliters van de inhoud van buizen nummer drie, nummer vier, nummer vijf, en de gelabelde initiële cultuur respectievelijk op sectoren 10-3, 10-5, 10-7, en 10-1 van de bloed agar plaat. Laat de bloedagar platen onder de laminaire kap aan de lucht drogen van de bacteriële spreads, meestal gedurende 10 minuten. Plaats daarna de platen op 37 graden Celsius voor nachtelijke incubatie.Tel na nachtelijke incubatie de bacteriële kolonies om het aantal CDU's te verkrijgen. Onder pure stress voorwaarden, soortgelijke bacteriële gehechtheid over de verschillende graft weefsels werd waargenomen voor zowel staphylococcus aureus en staphylococcus epidermidis infectie. Volgens de procedures vertoonde streptococcus sanguinis een aanzienlijke vermindering van de aanhankelijkheid aan de boviene halsaderwand, in vergelijking met de vederneusardiumpatch.Bij het vergelijken van de drie soorten bacteriën, streptococcus sanguinis presenteert aanzienlijk lagere hechting aan de boviene halsader wand ten opzichte van staphylococcus aureus en staphylococcus epidermidis. Tijdens een poging deze procedure, het is belangrijk om te onthouden te hebben voorbereid juiste weefsels van hetzelfde hoofd. Het zal zorgen voor vergelijkbare omstandigheden in alle experimentmonsters en de variabiliteit van gegevens tussen verschillende reeksen experimenten minimaliseren.Na de ontwikkeling stelt deze techniek onderzoekers in staat om de complexe wanordesystemen stap voor stap te verkennen door hun in vitro modelbenaderingen te verrijken met verschillende elementen om volledige complexiteit op te bouwen in de buurt van de medische status.

an-vitro-model-parallel-plate-perfusion-system-to-study-bacterial

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Een methode om cultuur een endotheelcel monolaag het gehele inwendige oppervlak van een 3D microfluïdische apparaat met microvasculaire grootte kanalen (&lt;30 pm) beschreven.

Endothelialized Microfluidics voor het bestuderen van microvasculaire Interacties in Hematologische ziekten

Source: Ditkowski, B., et al. An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues. J. Vis. Exp. (2019).This video demonstrates the method of using a parallel-plate flow chamber to perfuse fluorescently labeled bacteria over vascular graft tissues, enabling controlled analysis of bacterial adhesion and early pathogenesis under shear flow conditions.

In Vitro Parallel-Plate Flow Model to Study Bacterial Adhesion on a Tissue Biopsy

Source: Calatayud Arroyo, M., et al. Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates an in vitro gut host–microbe model to study bacterial viability. A co-culture of Caco-2 and HT29-MTX cells is incubated with bacteria pre-treated under simulated digestive conditions. Epithelial barrier integrity is assessed using transepithelial electrical resistance, and fractions from the medium, solubilized...

In Vitro Gut Model to Assess Bacterial Adhesion and Internalization

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

Neisseria meningitidis is een humaan specifieke ziekteverwekker die de bloedvaten infecteert. In dit protocol menselijke bloedvaten in een muis worden geïntroduceerd door enten menselijke huid op immuungecompromitteerde muizen. Bacteriën zich uitgebreid naar menselijke vaten, waardoor vasculaire beschadiging en ontwikkeling van de purpura uitslag typisch waargenomen in menselijke gevallen.

Gehumaniseerd muismodel om te studeren Bacteriële infecties Targeting microvasculature

Om de interactie van bacteriën met de bloedvaten onder afschuifspanning te bestuderen, worden een stromingskamer en een in vivo mesenteriale intravitale microscopiemodel beschreven die het mogelijk maken om de bacteriële en gastheerfactoren die bijdragen aan vasculaire adhesie te ontleden.

In vitro en in vivo model voor Bacteriële hechting aan de vaatwand Onder Flow omstandigheden te bestuderen

Leukocyten interactie gretig met vasculaire cellen en trombocyten na vaartuig muur letsel of tijdens ontsteking. Hier beschrijven we een eenvoudig laminaire flow gebaseerde assay karakteriseren de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de interacties tussen leukocyten en hun cellulaire partners.

Laminaire stroming gebaseerde testen te onderzoeken Leukocyte aanwerving op gekweekte vasculaire cellen en aanhangend bloedplaatjes

Dit protocol toont methoden om een uitgebreide in vitro cultuur van patiënt-afgeleide xenografts (PDX) mogelijk te maken. Een stap verbetert de algehele levensvatbaarheid van meercellige clusterculturen in 3D hydrogels, door eenvoudige verwijdering van niet-levensvatbare enkele cellen. Een secundaire stap toont best practices voor PDX-cultuur in een geperfundeerd microfluïdisch platform.

Verbeterde levensvatbaarheid voor Ex vivo 3D Hydrogel Culturen van patiënt-afgeleide Xenografts in een perfused microfluïdisch platform

Dit protocol presenteert de opzet en werking van een nieuw ontwikkelde, 3D-geprinte bioreactor voor de ex vivo kweek van bloedvaten in perfusie. Het systeem is ontworpen om gemakkelijk door andere gebruikers te worden overgenomen, praktisch, betaalbaar en aanpasbaar aan verschillende experimentele toepassingen, zoals basisbiologie en farmacologische studies.

Ex Vivo Perfusiecultuur van grote bloedvaten in een 3D-geprinte bioreactor

Leer een in vitro stromingskamer-model om bacteriële hechting aan weefseltransplantaten te bestuderen. Deze methode onthult moleculaire interacties die infectieuze endocarditis veroorzaken.

Een In Vitro Model van een Parallel-plaat perfusie-systeem te bestuderen van de naleving van de bacteriële om te enten van weefsels (Video) | JoVE Journal

Een In Vitro Model van een Parallel-plaat perfusie-systeem te bestuderen van de naleving van de bacteriële om te enten van weefsels

Meer video's verkennen