Name: Voorbereiding van Acute ruggenmerg segmenten geheel-cel Patch-clamp opname in neuronen van de Substantia Gelatinosa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Leer whole-cell patch-clamp opname in substantia gelatinosa neuronen van acute ruggenmergsnedes. Deze methode onderzoekt intrinsieke membraaneigenschappen en synaptische transmissie voor pijnonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door subsidies van de nationale Natural Science Foundation van China (nr. 81560198, 31660289).

Alle experimentele protocollen beschreven werden goedgekeurd door de Animal ethiek Commissie van Nanchang Universiteit (Nanchang, PR China, ethische No.2017-010). Alle inspanningen werden geleverd om te minimaliseren van de stress en pijn de proefdieren. Het elektrofysiologische opnames hier uitgevoerd werden uitgevoerd bij kamertemperatuur (RT, 22-25 ° C).
1. dieren
<ol><li>Gebruik Sprague-Dawley ratten (3-5 weken oud) van beide geslachten. Huis van de dieren onder een 12u licht-donker cyclus en hen ad libitum toegang geven tot voldoende voedsel en water.</li>
</ol>2. bereiding van de oplossingen en materialen
<ol><li>Oplossingen<ol>
<li>Bereiden van kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) (in mM): 117 NaCl, 3.6 KCl, 1.2 NaH2PO4·2H2O, 2.5 CaCl2·2H2O, 1.2 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, 11 D-glucose, 0.4 ascorbinezuur en 2 natrium pyruvaat. Zie tabel 1.</li>
		<li>Bereiden van sacharose-ACSF (in mM): 240 sacharose, 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4·2H2O, 0.5 CaCl2·2H2O, 3,5 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, 0.4 ascorbinezuur en 2 natrium pyruvaat. Zie tabel 2.</li>
		<li>Bereiden van K+-gebaseerde intracellulaire oplossing (in mM): 130 K-gluconaat, 5 KCl, 10 Na2-phosphocreatine, 0.5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP en 0.3 Li-GTP. Zie tabel 3.</li>
		<li>Bereiden van Cs+-gebaseerde intracellulaire oplossing (in mM): 92 CsMeSO4, 43 CsCl, 10 Na2-phosphocreatine, 5 tetraethylammonium (thee) - Cl, 0.5 EGTA 10 HEPES, 4 Mg - ATP en 0.3 Li-GTP. Zie tabel 4. Opmerking: Alle oplossingen moeten worden voorbereid met gedestilleerd water. ACSF en sacharose-ACSF moet carbogenated (95% O2 en 5% CO2 mengsel) voorafgaand aan het gebruik om een optimale pH van ongeveer 7.4, en de osmolaliteit van deze twee oplossingen moet worden aangepast aan de 300-310 mOsm. Omdat ascorbinezuur calcium kanalen beïnvloeden kon, moet deze agent worden weggelaten als men zou willen opnemen calcium stromingen. De osmolaliteit pH van intracellulaire oplossingen moeten worden gemeten en afgestemd op 290-300 mOsm en 7.2-7.3, respectievelijk. Het is aanbevolen om de intracellulaire oplossingen filteren met filters van 0,2 µm en opslaan van de oplossingen als 1 mL aliquots bij-20 ° C. CS+ en thee worden toegepast in Cs+-gebaseerde intracellulaire oplossing naar blok kalium kanaal, dat bevorderlijk is voor het gebruik van de versterker te houden van het membraan potentiële is stabiel op 0 mV bij het opnemen van remmende postsynaptisch stromingen (IPSCs).</li>
		<li>Bereid de oplossing van de neurobiotin 488 0,05%. Los 2 mg neurobiotin 488 in 4 ml K+-gebaseerde intracellulaire oplossing en de osmolaliteit tot 290-300 mOsm aanpassen met behulp van gedestilleerd water of sacharose, indien nodig. Opmerking: 1 mM van sacharose verhoogt osmolariteit van 1 mOsm.</li>
		<li>Voorbereiden op 3% agar als een blok ruggenmerg. Los 7,5 g agar in 250 mL van het gezuiverde water in een bekerglas van glas, en gebruik vervolgens een magnetron te verwarmen tot koken en duidelijk. Swirl van de oplossing en giet het mengsel in een 17,5 x 10.5 cm x 1,8 cm plastic doos voor stolling daarna. Houd de agar bij 4 ° C vóór gebruik.</li>
		<li>4% paraformaldehyde (PFA) voorbereiden immunohistochemische verwerking. Mix 40 g PFA poeder aan ~ 800 mL verwarmd (ongeveer 60 ° C) 1 x PBS oplossing (130 mM NaCl, 7 mM nb2HPO4, 3 mM NaH2PO4). Breng langzaam de pH door toevoeging van 1 N NaOH druppels tot PFA poeder volledig is opgelost. Zodra de oplossing duidelijk geworden is, pas het totale volume aan 1 L met 1 x PBS. Passen de pH op 7,2 – 7.4 met 1 N HCl wanneer nodig, dan filteren de 4% PFA-oplossing en opslaan bij-20 ° C tot gebruik. Opmerking: PFA is giftig, dus het is nodig om te dragen maskers, handschoenen, evenals veiligheidsbril. Uitvoeren van het proces ter voorbereiding van 4% PFA binnen een geventileerde kap. PFA poeder kan volledig worden ontbonden bij een pH van ongeveer 9-10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Instrumenten
	<ol>
<li>Voor een typische elektrofysiologische systeem, gebruik een rechtop Microscoop uitgerust met infrarood differentiële interferentie contrast (IR-DIC) en de doelstelling van een hoge water-onderdompeling, een CCD/CMOS-camera, een patch-clamp-versterker, de houder van een micropipet en een micromanipulator waardoor fijnafstelling van het standpunt van de pipet. Een XY-stadium is ook nodig om het verplaatsen van de Microscoop.</li>
		<li>Koppel alle apparatuur op een vibratie isolatie tabel omgeven door een kooi van Faraday. Een video-monitor verbinden met de videocamera te observeren de neuronen en visualiseren van de micropipetten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Micropipetten
	<ol>
<li>Zorg opnemen elektroden van borosilicaatglas haarvaten met behulp van een trekker van de micropipet. De typische Pipetteer weerstand varieert van 3-6 MΩ wanneer gevuld met intracellulaire oplossing.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Agar blok
	<ol>
<li>Bereiden een 1.2 x 1,5 cm x 2,0 cm agar blok. Trim het blok in de vormen die afgebeeld in Figuur 1 zoals vereist.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. acute ruggenmerg segment voorbereiding
Opmerking: Dwarse of parasagittal segmenten van het ruggenmerg zijn bereid als eerder beschreven18,19,20.
<ol><li>Voorafgaand aan de transcardial perfusie en ruggenmerg extractie, bereiden ~ 500 mL sacharose-ACSF geëquilibreerd met 95% O2 en 5% CO2 en de ijskoude oplossing afkoelen (0-4 ° C).</li>
	<li>Alle dissectie hulpmiddelen (bijvoorbeeld ontrafeling van schaar, iris schaar, getande pincet, fijne pincet, gebogen verlostang) afkoelen op het ijs. Het diagram van de voorbereiding van acute ruggenmerg segment is afgebeeld in Figuur 1.</li>
	<li>Transcardial perfusie<ol>
<li>Na een enkele injectie (intraperitoneaal, i.p.) van urethaan (1,5 g/kg), wacht 2-3 min, en beoordelen van de diepte van de verdoving van ratten door het testen van teen of staart snuifje reacties. Zodra een chirurgische vliegtuig van de verdoving wordt onderhouden, plaats de rat op crushed ijs in de liggende positie. Opmerking: Voor de productie van diepgaande verdoving voldoende voor niet-perceptie van pijn tijdens Thoracotomie, volg uw lokale IACUC richtlijnen.</li>
		<li>Maken van een incisie (3-4 cm) via de huid van de xiphoid process aan het sleutelbeen, en breng vervolgens een dwarse snede onder het niveau van de xiphoid process.</li>
		<li>Begrijpen en de xiphoid process te verhogen met een paar gebogen pincet om het middenrif volledig bloot te stellen. Maak een dwarse incisie via het middenrif, en vervolgens doorsnijden de ribbenkast tussen het borstbeen en de ribben bilateraal te openen van de borstholte. Gebruik de gebogen verlostang te begrijpen van de xiphoid process zodat de ribbenkast is vastgesteld, en het hart voldoende wordt blootgesteld.</li>
		<li>Houd het hart met een andere gebogen pincet voorzichtig, en voeg vervolgens een naald van 22 G door het linkerventrikel aan de basis van de aortaboog.</li>
		<li>Snijd de juiste atrium met een fijne schaar onmiddellijk en start vervolgens de perfusie van ijskoud, zuurstofrijk sacharose-ACSF via een systeem van de zwaartekracht. Opmerking: Snelle en voldoende transcardial perfusie met ijskoude sacharose-ACSF kan vergemakkelijken de snelle afkoeling van het ruggenmerg, terwijl lage natrium- en calciumzout concentratie helpen kan verlichten excitatory toxiciteit en beschermen van neuronale functie. Bovendien zou wissen van rode bloedcellen gunstig zijn voor het verminderen van de achtergrondkleuring van biocytin bij het uitvoeren van een morfologische studie. De perfusie wordt beschouwd als voldoende en tevreden, zolang de vloeistof afsluiten van de juiste atrium duidelijk is en de kleur van de rat lever en poten lichtgeel is. De tip van de naald 22 G moet bot te voorkomen bezwijken van het hart en de aortaboog.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ruggenmerg dissectie en snijden<ol>
<li>Maak een longitudinale insnijding (5 cm) op de rug huid van caudal naar rostraal, dan snijden door de ribbenkast tussen de wervelkolom en ribben aan weerszijden in de Braziliaanse deelstaat perfusie.</li>
		<li>Maken een cut caudal eind van de wervelkolom, het gebruik van schaar te knippen weg omliggende weefsels en snel isoleren van de lumbosacrale segment van de wervelkolom.</li>
		<li>Het lumbosacraal segment overbrengen in een glazen schotel met ijskoude sacharose gebaseerde ACSF. Gebruiken met de ventrale zijde naar boven, fijne schaar te snijden door de Vertebrale stam bilateraal en bloot het ruggenmerg zorgvuldig. Isoleren van een 2-cm lange ruggenmerg met lumbosacrale uitbreiding (L1-S3) en het spinale gedeelte overbrengen in een andere glazen schotel gevuld met koude sacharose-ACSF.</li>
		<li>Verwijder de hersenvliezen en de pia-arachnoideavilli membraan onder een Microscoop ontleden. Knip alle ventrale en dorsale wortels weg zo snel mogelijk.</li>
		<li>Plaats het ruggenmerg op een eerder bijgesneden agar-blok. Transversale segmenten voor te bereiden, hechten de ventrale zijde van het ruggenmerg aan de agar en laten de dorsale zijde naar het blad. Ter voorbereiding van parasagittal segmenten, voegt u de ventrale zijde met lijm aan de agar in verticale richting zoals afgebeeld in Figuur 1. Vervolgens monteer het blok van de agar naar een platform voor een vibratome met secondelijm. Voorbereiden van 300 – 500 µm dwars of segmenten van de parasagittal met de snelheid van een voorschot van 0,025 mm/s en een frequentie van de trillingen van 80 Hz.</li>
		<li>Gebruik een pipet kunststof-bijgesneden overdracht van de segmenten op nylon gaas in een cupje van de opslag met continu zuurstofrijk ACSF bij 32 ° C gedurende ten minste 30 minuten voorafgaand aan de opname. Nota: zorg om te voorkomen dat schade aan het ruggenmerg, met name de dorsale hoorn, bij het verwijderen van de hersenvliezen en spinale wortels. Het ruggenmerg moet dorsal-ventrally worden gesneden. Voor de beste resultaten, moeten de segmenten bereid zijn snel (binnen 15-20 min). De dikte van een spinale segment moet niet meer dan 600 µm om te voldoen aan de zichtbaarheid van de cel. Daarnaast kan de techniek hierboven beschreven worden gebruikt om het verkrijgen van horizontale spinale segmenten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. geheel-cel Patch-clamp opnames
<ol><li>Gebruiken om het gedrag van de gehele-cel patch-clamp opnames van SG neuronen, K+-gebaseerde intracellulaire oplossing voor de meeste opname gevallen tijdens het toepassen van Cs+-gebaseerde oplossing alleen voor de opname van remmende postsynaptisch stromingen.</li>
	<li>Een segment van het ruggenmerg zachtjes naar de zaal van de opname en daarna onderhoudt met een U-vormige platina-draad verbonden met nylon draden stevig voor optimale segment stabiliteit. Gestaag perfuse van het segment met geborreld ACSF op RT via een systeem van de zwaartekracht en het tarief van de perfusie vastgesteldop 2-4 mL/min tot voldoende oxygenatie.</li>
	<li>Identificeren van de regio van SG (een doorschijnend band) met behulp van een lens met een lage resolutie Microscoop, een gezonde neuron kiezen met behulp van de hoge resolutie doelstelling als de doelcel en aanpassen naar het midden van het scherm video-monitor.</li>
	<li>Vul een micropipet met een passende omvang van K+-gebaseerd of Cs+-gebaseerde intracellulaire oplossing, zo nodig, de micropipet steek in de elektrode-houder, en ervoor te zorgen dat de intracellulaire oplossing is contact met de zilveren draad binnen de houder.</li>
	<li>Brengen van de micropipet in beeld en dompel het in de ACSF met behulp van een micromanipulator en past u vervolgens een lichte overdruk (~ 1 psi wanneer gemeten met een manometer) te dwingen de micropipet uit de buurt van alle vuil en puin.</li>
	<li>Verplaats de micropipet naar de gerichte neuron geleidelijk. Laat de overdruk zodra de pipet benadert het neuron en een heel klein kuiltje vormen op de neuronale membraan om te vormen van een gigaseal.</li>
	<li>Wijzigen van het bedrijf mogelijkheden om te-70 mV, die dicht bij de fysiologische membraanpotentiaal (RMP) van een cel rust. Vervolgens een voorbijgaande en zachte zuigkracht om de micropipet te scheuren van het membraan en maken van een juiste configuratie van het geheel-cel passen. Opmerking: Na het overbrengen van het segment in de bedwelmingsruimte opname, zorg ervoor gestage perfusie voor minstens 5 min om duidelijk het puin op het oppervlak van het segment. Het is vermeldenswaard dat de mogelijkheid om het onderscheid maken tussen gezonde en ongezonde/dode neuronen van het allergrootste belang voor de goede afdichting en stabiele opname is. Een ongezonde/dode neuron oogt erg gezwollen of gekrompen, samen met een zichtbare grote kern, terwijl een gezonde neuron wordt gekenmerkt door een 3-dimensionale (3D) vorm met een licht en soepel membraan, en zijn kern onzichtbaar is. Om de configuratie van een geheel-cel, is het essentieel om te compenseren voor snelle of langzame precisiecapaciteit stapsgewijze wanneer dat nodig is. RT, is de vloeibare kruising potentiële berekend 15.1-15,2 mV en 4.3-4.4 mV in K+-gebaseerd en Cs+-gebaseerde intracellulaire oplossing, respectievelijk. In onze studies, werden de geprotocolleerde gegevens niet gecorrigeerd voor vloeibare kruising potentieel.</li>
	<li>Opnames van intrinsieke membraan eigenschappen<ol>
<li>Passieve intrinsieke membraan eigenschappen opnemen: Record RMP onmiddellijk (binnen 20 s) na onderbreking in. Bepaal de neuronale input weerstand door het meten van de reactie van de spanning op een depolarizing huidige (10 pA, 500 ms) op RMP in current-clamp modus.</li>
		<li>Record afvuren eigenschappen: Test het afvuren patroon van elk neuron in current-clamp met een reeks van 1 s depolarizing huidige pulsen (25 – 150 pA met 25 pA increment) op RMP. Het meten van de drempel, amplitude en halve-breedte van een enkele actiepotentiaal off line.</li>
		<li>Subthreshold huidige opnemen: om te beoordelen van de somatische subthreshold stromingen, houden het membraan potentiële -50 mV in spanning-clamp modus. Vervolgens het toepassen van een reeks hyperpolarizing spanning pulsen van 1 s duur van -60 mV tot-120 mV, met een 10-mV-verlagende.</li>
		<li>Opnemen van excitatory postsynaptisch stromingen (EPSCs): EPSCs van de Record met de K+-gebaseerde intracellulaire oplossing in spanning-clamp-modus op een bedrijf potentieel van-70 mV.</li>
		<li>Record IPSCs: Toepassing Cs+-gebaseerde intracellulaire oplossing voor het opnemen van IPSCs. Zodra de configuratie geheel-cel wordt gevestigd, houden het membraan potentiële-70 mV voor ~ 5 min en wijzig vervolgens het bedrijf potentiële op 0 mV geleidelijk. Wacht een paar minuten voor stabilisatie, en dan beginnen met het opnemen van de IPSC-gebeurtenissen. Opmerking: Alleen neuronen met een RMP van minder dan-50 mV en tonen overschrijding moeten worden geselecteerd voor verdere studie. De serie weerstanden in onze studie zijn meestal 10-30 MΩ, en een opname moet worden uitgesloten zodra de serie weerstand met meer dan 20 verandert %. EPSCs kon worden bevestigd met de toepassing van een bad van 50 µM APV en 20 µM CNQX, terwijl IPSCs kon worden bevestigd met 10 µM bicuculline en 1 µM strychnine.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. morfologische studie
<ol><li>Gebruik voor morfologische experimenten, een K+-gebaseerde intracellulaire oplossing met 0,05% neurobiotin 488.</li>
	<li>Na het handhaven van een stabiele elektrofysiologische opnemen gedurende ten minste 20 minuten, Verwijder langzaam de micropipet in de opwaartse richting om de celmembraan te verzegelen en het ruggenmerg segment overbrengen in een container gevuld met 4% PFA. Bevestigen van de segmenten in 4% PFA RT voor 1 h en vervolgens bij 4° C's nachts.</li>
	<li>Spoel de plakjes in PBS, en hen vervolgens onderdompelen in 50% ethanol voor 30 min. Na de andere drie wast in PBS, monteren van de segmenten in hun oorspronkelijke dikte op dia's met een montage-medium.</li>
	<li>Gebruik een confocal microscoop (Zie Tabel of Materials) voor Beeldacquisitie en neuronale 3D reconstructie. Scan neuronen door een 20 X lens met een z-stapel 1,5 µm.</li>
</ol>

<ol><li>Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+circuitry+for+pain+processing+in+the+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).</li>
<li>Yoshimura, M., Nishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blind+patch-clamp+recordings+from+substantia+gelatinosa+neurons+in+adult+rat+spinal+cord+slices%3A+pharmacological+properties+of+synaptic+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Blind patch-clamp recordings from substantia gelatinosa neurons in adult rat spinal cord slices: pharmacological properties of synaptic currents.</a> Neuroscience. 53 (2), 519-526 (1993).</li>
<li>Maxwell, D. J., Belle, M. D., Cheunsuang, O., Stewart, A., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+inhibitory+and+excitatory+interneurons+in+superficial+laminae+of+the+rat+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology.+584+%28Pt%22%5BJournal%5D)">Morphology of inhibitory and excitatory interneurons in superficial laminae of the rat dorsal horn.</a> The Journal of Physiology. 584 (Pt. 2, 521-533 (2007).</li>
<li>Grudt, T. J., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlations+between+neuronal+morphology+and+electrophysiological+features+in+the+rodent+superficial+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Correlations between neuronal morphology and electrophysiological features in the rodent superficial dorsal horn.</a> The Journal of Physiology. 540 (Pt 1), 189-207 (2002).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+feed-forward+spinal+cord+glycinergic+neural+circuit+gates+mechanical+allodynia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">A feed-forward spinal cord glycinergic neural circuit gates mechanical allodynia.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (9), 4050-4062 (2013).</li>
<li>Zheng, J., Lu, Y., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+neurones+of+the+spinal+substantia+gelatinosa+mediate+interaction+of+signals+from+primary+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Inhibitory neurones of the spinal substantia gelatinosa mediate interaction of signals from primary afferents.</a> The Journal of Physiology. 588 (Pt 12), 2065-2075 (2010).</li>
<li>Balasubramanyan, S., Stemkowski, P. L., Stebbing, M. J., Smith, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sciatic+chronic+constriction+injury+produces+cell-type-specific+changes+in+the+electrophysiological+properties+of+rat+substantia+gelatinosa+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Sciatic chronic constriction injury produces cell-type-specific changes in the electrophysiological properties of rat substantia gelatinosa neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96 (2), 579-590 (2006).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+signal-regulated+kinase+%28ERK%29+activation+is+required+for+itch+sensation+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Extracellular signal-regulated kinase (ERK) activation is required for itch sensation in the spinal cord.</a> Molecular Brain. 7, 25(2014).</li>
<li>Kopach, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+alters+trafficking+of+extrasynaptic+AMPA+receptors+in+tonically+firing+lamina+II+neurons+of+the+rat+spinal+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Inflammation alters trafficking of extrasynaptic AMPA receptors in tonically firing lamina II neurons of the rat spinal dorsal horn.</a> Pain. 152 (4), 912-923 (2011).</li>
<li>Takasu, K., Ono, H., Tanabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+cation+channels+at+primary+afferent+terminals+contribute+to+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Spinal hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channels at primary afferent terminals contribute to chronic pain.</a> Pain. 151 (1), 87-96 (2010).</li>
<li>Iura, A., Takahashi, A., Hakata, S., Mashimo, T., Fujino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductions+in+tonic+GABAergic+current+in+substantia+gelatinosa+neurons+and+GABAA+receptor+delta+subunit+expression+after+chronic+constriction+injury+of+the+sciatic+nerve+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Reductions in tonic GABAergic current in substantia gelatinosa neurons and GABAA receptor delta subunit expression after chronic constriction injury of the sciatic nerve in mice.</a> European Journal of Pain. 20 (10), 1678-1688 (2016).</li>
<li>Alles, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve+injury+increases+contribution+of+L-type+calcium+channels+to+synaptic+transmission+in+spinal+lamina+II%3A+Role+of+alpha2delta-1+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pain%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve injury increases contribution of L-type calcium channels to synaptic transmission in spinal lamina II: Role of alpha2delta-1 subunits.</a> Molecular Pain. 14, 1-12 (2018).</li>
<li>Santos, S. F., Rebelo, S., Derkach, V. A., Safronov, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+interneurons+dominate+sensory+processing+in+the+spinal+substantia+gelatinosa+of+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Excitatory interneurons dominate sensory processing in the spinal substantia gelatinosa of rat.</a> The Journal of Physiology. 581 (Pt 1), 241-254 (2007).</li>
<li>Lu, Y., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+organization+of+excitatory+circuits+between+neurons+of+the+spinal+superficial+dorsal+horn+%28laminae+I+and+II%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modular organization of excitatory circuits between neurons of the spinal superficial dorsal horn (laminae I and II).</a> The Journal of Neuroscience. 25 (15), 3900-3907 (2005).</li>
<li>Hantman, A. W., van den Pol, A. N., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+physiological+features+of+a+set+of+spinal+substantia+gelatinosa+neurons+defined+by+green+fluorescent+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Morphological and physiological features of a set of spinal substantia gelatinosa neurons defined by green fluorescent protein expression.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (4), 836-842 (2004).</li>
<li>Yasaka, T., Tiong, S. Y., Hughes, D. I., Riddell, J. S., Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Populations+of+inhibitory+and+excitatory+interneurons+in+lamina+II+of+the+adult+rat+spinal+dorsal+horn+revealed+by+a+combined+electrophysiological+and+anatomical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Populations of inhibitory and excitatory interneurons in lamina II of the adult rat spinal dorsal horn revealed by a combined electrophysiological and anatomical approach.</a> Pain. 151 (2), 475-488 (2010).</li>
<li>Yin, H., Park, S. A., Han, S. K., Park, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+5-hydroxytryptamine+on+substantia+gelatinosa+neurons+of+the+trigeminal+subnucleus+caudalis+in+immature+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of 5-hydroxytryptamine on substantia gelatinosa neurons of the trigeminal subnucleus caudalis in immature mice.</a> Brain Research. 1368, 91-101 (2011).</li>
<li>Hu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lidocaine+Inhibits+HCN+Currents+in+Rat+Spinal+Substantia+Gelatinosa+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesia+and+Analgesia%22%5BJournal%5D)">Lidocaine Inhibits HCN Currents in Rat Spinal Substantia Gelatinosa Neurons.</a> Anesthesia and Analgesia. 122 (4), 1048-1059 (2016).</li>
<li>Peng, H. Z., Ma, L. X., Lv, M. H., Hu, T., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minocycline+enhances+inhibitory+transmission+to+substantia+gelatinosa+neurons+of+the+rat+spinal+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Minocycline enhances inhibitory transmission to substantia gelatinosa neurons of the rat spinal dorsal horn.</a> Neuroscience. 319, 183-193 (2016).</li>
<li>Peng, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+presynaptic+HCN+channels+to+excitatory+inputs+of+spinal+substantia+gelatinosa+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Contribution of presynaptic HCN channels to excitatory inputs of spinal substantia gelatinosa neurons.</a> Neuroscience. 358, 146-157 (2017).</li>
<li>Liu, N., Zhang, D., Zhu, M., Luo, S., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minocycline+inhibits+hyperpolarization-activated+currents+in+rat+substantia+gelatinosa+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Minocycline inhibits hyperpolarization-activated currents in rat substantia gelatinosa neurons.</a> Neuropharmacology. 95, 110-120 (2015).</li>
<li>Brown, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+whole-cell+recording+from+visually+preselected+neurons+of+perirhinal+cortex+in+brain+slices+from+young+and+aging+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats.</a> Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).</li>
<li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> The Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li>
<li>Rice, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+ascorbate+in+the+preparation+and+maintenance+of+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of ascorbate in the preparation and maintenance of brain slices.</a> Methods. 18 (2), 144-149 (1999).</li>
<li>Takasu, K., Ogawa, K., Minami, K., Shinohara, S., Kato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury-specific+functional+alteration+of+N-type+voltage-gated+calcium+channels+in+synaptic+transmission+of+primary+afferent+C-fibers+in+the+rat+spinal+superficial+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Injury-specific functional alteration of N-type voltage-gated calcium channels in synaptic transmission of primary afferent C-fibers in the rat spinal superficial dorsal horn.</a> European Journal of Pharmacology. 772, 11-21 (2016).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+synaptic+transmission+in+the+spinal+substantia+gelatinosa+is+under+an+inhibitory+tone+of+endogenous+adenosine%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Excitatory synaptic transmission in the spinal substantia gelatinosa is under an inhibitory tone of endogenous adenosine.</a> Neuroscience Letters. 477 (1), 28-32 (2010).</li>
<li>Funai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+dexmedetomidine+augments+inhibitory+synaptic+transmission+in+the+superficial+dorsal+horn+through+activation+of+descending+noradrenergic+control%3A+an+in+vivo+patch-clamp+analysis+of+analgesic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Systemic dexmedetomidine augments inhibitory synaptic transmission in the superficial dorsal horn through activation of descending noradrenergic control: an in vivo patch-clamp analysis of analgesic mechanisms.</a> Pain. 155 (3), 617-628 (2014).</li>
<li>Yamasaki, H., Funai, Y., Funao, T., Mori, T., Nishikawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+tramadol+on+substantia+gelatinosa+neurons+in+the+rat+spinal+cord%3A+an+in+vivo+patch-clamp+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effects of tramadol on substantia gelatinosa neurons in the rat spinal cord: an in vivo patch-clamp analysis.</a> PLoS One. 10 (5), e0125147(2015).</li>
<li>Furue, H., Narikawa, K., Kumamoto, E., Yoshimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsiveness+of+rat+substantia+gelatinosa+neurones+to+mechanical+but+not+thermal+stimuli+revealed+by+in+vivo+patch-clamp+recording%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Responsiveness of rat substantia gelatinosa neurones to mechanical but not thermal stimuli revealed by in vivo patch-clamp recording.</a> The Journal of Physiology. 521 (Pt 2), 529-535 (1999).</li>
<li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+brain+slice+methods+for+adult+and+aging+animals%3A+application+of+targeted+patch+clamp+analysis+and+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics.</a> Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).</li>
<li>Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Acute+Brain+Slices+Using+an+Optimized+N-Methyl-D-glucamine+Protective+Recovery+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e53825(2018).</li>
<li>Li, J., Baccei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+Tissue+Damage+Promotes+Spike+Timing-Dependent+Synaptic+Long-Term+Potentiation+in+Adult+Spinal+Projection+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neonatal Tissue Damage Promotes Spike Timing-Dependent Synaptic Long-Term Potentiation in Adult Spinal Projection Neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (19), 5405-5416 (2016).</li>
<li>Ford, N. C., Ren, D., Baccei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NALCN+channels+enhance+the+intrinsic+excitability+of+spinal+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">NALCN channels enhance the intrinsic excitability of spinal projection neurons.</a> Pain. , (2018).</li>
<li>Cui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+synaptic+transmission+from+primary+afferents+to+spinal+substantia+gelatinosa+neurons+by+group+III+mGluRs+in+GAD65-EGFP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Modulation of synaptic transmission from primary afferents to spinal substantia gelatinosa neurons by group III mGluRs in GAD65-EGFP transgenic mice.</a> Journal of Neurophysiology. 105 (3), 1102-1111 (2011).</li>
<li>Yang, K., Ma, R., Wang, Q., Jiang, P., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optoactivation+of+parvalbumin+neurons+in+the+spinal+dorsal+horn+evokes+GABA+release+that+is+regulated+by+presynaptic+GABAB+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Optoactivation of parvalbumin neurons in the spinal dorsal horn evokes GABA release that is regulated by presynaptic GABAB receptors.</a> Neuroscience Letters. , 55-59 (2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Deze gegevens van het protocol van de stappen voor het voorbereiden van ruggenmerg segmenten, die we met succes gebruikt hebben bij het uitvoeren van geheel-cel patch-clamp experimenten op SG neuronen18,19,20,21. Door de uitvoering van deze methode, die we onlangs gemeld dat minocycline, een tweede generatie van tetracycline, kunnen sterk remmende synaptische transmissie versterken via een pres...

De substantia gelatinosa (SG, lamina II van de spinale dorsale hoorn) is een ontegenzeggelijk belangrijk relay center voor het verzenden en regulering van de zintuiglijke informatie. Het is samengesteld uit excitatory en remmende interneuronen, die ingangen van de primaire afferent vezels, lokale interneuronen en de endogene aflopende remmende systeem1ontvangen. In de afgelopen decennia, hebt de ontwikkeling van acuut ruggenmerg segment voorbereiding en de komst van geheel-cel patch-clamp opname ingeschakeld diverse studies over de intrinsieke elektrofysiologische en morfologische eigenschappen van SG neuronen2, 3 , 4 evenals studies van het lokale circuit in SG5,6. Bovendien, met behulp van de in vitro -voorbereiding van het ruggenmerg-segment, onderzoekers kunnen het interpreteren van de veranderingen in neuronale excitabilities7,8, de functie van ion kanalen9,10, en Synaptic activiteiten11,12 onder verscheidene pathologische condities. Deze studies hebben verdiept ons begrip van de rol die SG neuronen in de ontwikkeling spelen en het onderhoud van chronische pijn en neuropatische jeuk.
In wezen, is de belangrijkste voorwaarde om een duidelijke visualisatie van neuronale soma en ideale geheel-cel patchen acute ruggenmerg segmenten gebruiken om de uitstekende kwaliteit van segmenten zodat gezond en analoge neuronen kunnen worden verkregen. Echter, voorbereiding van ruggenmerg segmenten omvat verschillende stappen, zoals het uitvoeren van een ventrale laminectomie en het verwijderen van de pia-arachnoideavilli membraan, dat obstakels bij het verkrijgen van gezonde segmenten kan worden. Hoewel het is niet makkelijk te bereiden segmenten van het ruggenmerg, heeft optreden opnames in vitro op segmenten van het ruggenmerg verschillende voordelen. Vergeleken met cel cultuur preparaten, kunnen ruggenmerg segmenten gedeeltelijk behouden die inherent zijn aan synaptic verbindingen die in staat zijn een fysiologisch relevante. Bovendien kan geheel-cel patch-clamp opname via ruggenmerg segmenten worden gecombineerd met andere technieken, zoals dubbele patch klem13,14, morfologische studies15,16 en eencellige RT-PCR 17. dus, deze techniek biedt meer informatie over het karakteriseren van de anatomische en genetische diversiteit binnen een bepaald geografisch gebied en zorgt voor onderzoek van de samenstelling van lokale circuits.
Hier, voorzien wij een basisnetwerkdiagram en een gedetailleerd beschrijving van onze methode voor de voorbereiding van acute ruggenmerg segmenten en het verwerven van geheel-cel patch-clamp opnames van SG neuronen.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>Gebruikt voor de bereiding van ACSF en PBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>60130</td><td>Gebruikt voor de bereiding van ACSF, sucrose-ACSF en K+-gebaseerde intracellulaire oplossing</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot;2H2O</td><td>Sigma</td><td>71500</td><td>Gebruikt voor de bereiding van ACSF, sucrose-ACSF en PBS</td></tr><tr><td>CaCl2&middot;2H2O</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td>Gebruikt voor de bereiding van ACSF en sucrose-ACSF</td></tr><tr><td>MgCl2&middot;6H2O</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td>Gebruikt voor de bereiding van ACSF en sucrose-ACSF</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Gebruikt voor de bereiding van ACSF en sucrose-ACSF</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>Gebruikt voor de bereiding van ACSF</td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Sigma</td><td>P5280</td><td>Gebruikt voor de bereiding van ACSF en sucrose-ACSF</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma</td><td>A7631</td><td>Gebruikt voor de bereiding van ACSF en sucrose-ACSF</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td>Gebruikt voor de bereiding van sucrose-ACSF</td></tr><tr><td>K-gluconate</td><td>Wako</td><td>169-11835</td><td>Gebruikt voor de bereiding van K+-gebaseerde intracellulaire oplossing</td></tr><tr><td>Na2-Phosphocreatine</td><td>Sigma</td><td>P1937</td><td>Gebruikt voor de bereiding van intracellulaire oplossing</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td>Gebruikt voor de bereiding van intracellulaire oplossing</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>Gebruikt voor de bereiding van intracellulaire oplossing</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td>Gebruikt voor de bereiding van intracellulaire oplossing</td></tr><tr><td>Li-GTP</td><td>Sigma</td><td>G5884</td><td>Gebruikt voor de bereiding van intracellulaire oplossing</td></tr><tr><td>CsMeSO4</td><td>Sigma</td><td>C1426</td><td>Gebruikt voor de bereiding van Cs+-gebaseerde intracellulaire oplossing</td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Sigma</td><td>C3011</td><td>Gebruikt voor de bereiding van Cs+-gebaseerde intracellulaire oplossing</td></tr><tr><td>TEA-Cl</td><td>Sigma</td><td>T2265</td><td>Gebruikt voor de bereiding van Cs+-gebaseerde intracellulaire oplossing</td></tr><tr><td>Neurobiotin 488</td><td>Vector</td><td>SP-1145</td><td>0,05% neurobiotin 488 kan worden gebruikt voor morfologische studies</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A7002</td><td>3% agarblok werd gebruikt in ons protocol</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>4% paraformaldehyde werd gebruikt voor immunohistochemische verwerking</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Hengxing Chemical Reagents</td><td></td><td>Gebruikt voor de bereiding van PBS</td></tr><tr><td>Mount Coverslipping Medium</td><td>Polyscience</td><td>18606</td><td></td></tr><tr><td>Urethan</td><td>National Institute for Food and Drug Control</td><td>30191228</td><td>1,5 g/kg, i.p.</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-4</td><td>1,5 mm OD, 1,12 mm ID</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td>Gebruikt voor de bereiding van micropipetten</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>Vibration isolation table</td><td>Technical Manufacturing Corporation</td><td>63544</td><td></td></tr><tr><td>Infrared CCD camera</td><td>Dage-MIT</td><td>IR-1000</td><td></td></tr><tr><td>Patch-clamp amplifier</td><td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>X-Y stage</td><td>Burleigh</td><td>GIBRALTAR X-Y</td><td></td></tr><tr><td>Upright microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Osmometer</td><td>Advanced</td><td>FISKE 210</td><td></td></tr><tr><td>PH meter</td><td>Mettler Toledo</td><td>FE20</td><td></td></tr><tr><td>Confocol microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM 700</td><td></td></tr></tbody></table>

voorbereiding van acute ruggenmerg segmenten geheel-cel patch-clamp opname in neuronen van de substantia gelatinosa

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Recente studies van de gehele-cel patch-clamp van neuronen van de substantia gelatinosa (SG) hebben een grote hoeveelheid informatie over de spinale mechanismen die ten grondslag liggen aan zintuiglijke transmissie, Nociceptieve regulering en chronische pijn of jeuk ontwikkeling gegeven. Implementaties van elektrofysiologische opnamen samen met morfologische studies op basis van het nut van acute ruggenmerg segmenten hebben verder verbeterd ons begrip van neuronale eigenschappen en de samenstelling van lokale circuits in SG. Hier presenteren we een gedetailleerde en praktische gids voor de bereiding van segmenten van het ruggenmerg en Toon representatieve geheel-cel opnemen en morfologische resultaten. Dit protocol staat ideale neuronale behoud en in vivo voorwaarden tot op zekere hoogte kan nabootsen. Kortom, de mogelijkheid om het verkrijgen van een in vitro -voorbereiding van de segmenten van het ruggenmerg stabiele stroom en spanning-kogelklem opnames maakt en dus grondig onderzoek naar de eigenschappen van het intrinsieke membraan, lokale circuits kunnen vergemakkelijken en neuronale structuur met behulp van uiteenlopende experimentele benaderingen.

Acute ruggenmerg segmenten opgesteld volgens het schema in Figuur 1afgebeeld. Na snijden en herstel, werd een segment van het ruggenmerg overgeplaatst naar de kamer van de opname. Gezonde neuronen werden geïdentificeerd op basis van soma uiterlijk met behulp van IR-DIC microscopie. Vervolgens werden de mogelijkheden van de actie van SG neuronen ontlokte door een reeks van depolarizing huidige pulsen (1 s duur) wanneer neuronen RMP werden gehouden. Zoals aange...

Hier beschrijven we de essentiële stappen voor geheel-cel patch-clamp opnamen gemaakt van substantia gelatinosa (SG) neuronen in het ruggenmerg in vitro segment. Met deze methode kunt de eigenschappen van het intrinsieke membraan, synaptische transmissie en morfologische karakterisering van SG neuronen worden bestudeerd.

Voorbereiding van Acute ruggenmerg segmenten geheel-cel Patch-clamp opname in neuronen van de Substantia Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Deze methode kan helpen verduidelijken van de spinale mechanismen die ten grondslag liggen aan sensorische transmissie, nociceptieve regelgeving en chronische pijn of pijn ontwikkeling Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het kan toestaan dat ideale neuronale bewaring en het kan nabootsen in vivo voorwaarden tot op zekere hoogte. Begin met het opnemen van het opnemen van elektroden van borosilicaat glazen microcapillaries met behulp van een haarvatentrekker. Vul vervolgens een mal met gesmolten agar om een 1,2 centimeter bij 1,5 centimeter bij 2,0 centimeter agar blok voor te bereiden.Knip het blok bij om een centraal kanaal te hebben als u dwarse secties plant. Of een kanaalvlees met de rand van het blok voor parasagittale secties. Voorafgaand aan transcardiale overvloed en spinale extractie, bereiden 500 milliliter sucrose gebaseerde ACSF.Koel de oplossing af voor ijskoud en equilibrate met 95%O2 en 5% CO2. Koel alle dissectiegereedschappen op ijs. Maak een longitudinale incisie van vijf centimeter op de rughuid van caudal tot rostral.Vervolgens, snijd door de ribbenkast tussen de wervelkolom en ribben aan weerszijden. Gebruik een schaar om een snee te maken aan het staarteinde van de wervelkolom. Snijd vervolgens de omliggende weefsels weg en isoleer snel het lumbosacrale segment van de wervelkolom.Breng het lumbosacrale segment over op een glazen schaal met ijskoude sucrosegebaseerde ACSF. Met de ventrale kant naar boven, gebruik fijne schaar te snijden door de wervelpeddicle bilateraal en bloot het ruggenmerg zorgvuldig. Isoleer een twee centimeter lang deel van het ruggenmerg met de lumbosacrale vergroting en breng de spinale sectie in een andere glazen schotel gevuld met koude sacharose ACSF.Werk onder een dissectiemicroscoop om de hersenvliezen en het pia-arachnoïdale membraan te verwijderen. Snijd alle ventrale en rugwortels zo snel mogelijk weg. Zorg ervoor dat het letsel aan het ruggenmerg, vooral de rughoorn bij het verwijderen van de hersenvliezen en de ruggenwortels, vermijdt.Plaats het ruggenmerg op het eerder bijgesneden agarblok. Om dwarse plakjes voor te bereiden, bevestigt u de ventrale kant van het ruggenmerg aan de agar met de rugzijde naar het blad. Om parasagittale plakjes te bereiden, bevestigt u de ventrale kant met superlijm in een verticale richting aan de agar.Monteer vervolgens het agarblok op een platform van een vibratome met superlijm. En bereid 300 tot 500 micron dwars- of parasagittale plakjes voor met een geavanceerde snelheid van 0,025 millimeter per seconde en een trillingsfrequentie van 80 Hertz. Het ruggenmerg moet dorso-ventrally worden gesneden.Voor de beste resultaten moet het segment binnen 15 tot 20 minuten worden bereid. De dikte van het ruggenmergsegment mag niet meer dan 600 micron zijn om de zichtbaarheid van de cel te bevredigen. Gebruik een plastic bijgesneden pipet om de plakjes over te brengen op nylon gaas in een opslagkamer met continu zuurstofrijk ACSF op 32 graden Celsius.Voor het uitvoeren van hele-cel patch klem opnames van substantia gelatinosa of SG neuronen, gebruik kaliumion gebaseerde intracellulaire oplossingen voor de opname, terwijl de toepassing van cesium gebaseerde oplossing alleen voor de registratie van remmende post-synaptische stromen. Verplaats het dwarslaesiedeel voorzichtig naar de opnamekamer. En stabiliseer het dan stevig met een U-vormige platina draad met nylon draden voor optimale slice stabiliteit.Maak het segment gestaag over te maken met bubbled ACSF bij kamertemperatuur en stel de overfusiesnelheid in op twee tot vier milliliter per minuut om voldoende oxygenatie te bereiken. Dan, met behulp van een lage resolutie microscoop lens, identificeren van het gebied van SG neuronen als een doorschijnende band. Kies een gezond neuron, gekenmerkt door een driedimensionale vorm met een helder en glad membraan als doelcel met behulp van de doelstelling met hoge resolutie en pas het aan het midden van het scherm van de videomonitor aan.Vul een micropipet met een passend volume van kaliumionen op basis van of cesium ion gebaseerde intracellulaire oplossing. Steek vervolgens de micropipet in de elektrodehouder en zorg ervoor dat de intracellulaire oplossing contact maakt met de zilverdraad in de houder. Breng de micropipet scherp en gebruik de micromanipulator om deze onder te dompelen in de ACSF.Breng een milde positieve druk aan om vuil en vuil weg te dringen. Beweeg de micropipet geleidelijk naar het beoogde neuron. Zodra de pipet nadert het neuron en een zeer klein kuiltje vormen op het neuronale membraan, laat de positieve druk om een gigaseal te vormen.Verander het bedrijf potentieel tot min 70 millivolt, die dicht bij de fysiologische rust membraan potentieel van een cel. Breng vervolgens een tijdelijke en zachte zuigkracht aan op de micropipet om het membraan te scheuren en een goede hele celconfiguratie te creëren. Record bakken eigenschappen door het testen van het afvuren patroon van elk neuron in de huidige klem met een reeks van een seconde depolariseren huidige pulsen van 25 tot 150 picoamps met 25 picoamp stappen bij rust membraan potentieel.Om somatische subthreshold stromen te registreren, houd het membraanpotentieel op min 50 millivolt in spanningsklemwijze en breng u vervolgens een reeks hyperpolaire spanningspulsen van een seconde van min 60 millivolt tot min 120 millivolt aan met een afname van 10 millivolt. Neem excitatory post-synaptische stromen op met de op kaliumion gebaseerde intracellulaire oplossing in spanningsklemmodus bij een houdpotentieel van min 70 millivolts. Leg IPSC's vast met behulp van caesium ionen gebaseerde intracellulaire oplossing voor het opnemen van IPSC's.Na het houden van het membraanpotentieel op min 70 millivolt gedurende ongeveer vijf minuten, geleidelijk veranderen van het bedrijf potentieel tot nul millivolt. Wacht een paar minuten op stabilisatie en begin vervolgens met het opnemen van de IPSC-gebeurtenissen. Het afvuren van patronen bepaald door het injecteren van een reeks van een seconde depolariseren de huidige pulsen in een SG neuron bij rust membraan potentieel kan worden geclassificeerd als tonic-vuren, vertraagd-vuren, gap-firing, initial-burst, phasic-bursting, single-spike en terughoudend-vuren.Dit beeld toont het roepende protocol voor subthreshold stromen in voltageklem. Deze representatieve sporen tonen de reactie op hyperpolariserende huidige injectie geclassificeerd als IH, IA en IT. Dit is een representatief spoor van SEPSC's geregistreerd van SG neuronen op min 70 millivolt in de afwezigheid en aanwezigheid van 50 micromolar APV en 20 micromolar CNQX. Dit spoor toont de geregistreerde SEPC's vóór de toevoeging van APV en CNQX op een uitgebreide tijdschaal.Na deze procedure zijn de methoden zoals gepaarde patch klem opnames of optogenetica kan worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het karakteriseren van specifieke neuronale microcircuits in substantia gelatinosa.

preparation-acute-spinal-cord-slices-for-whole-cell-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates a technique for patch-clamp recording from the dendritic membrane surface. This helps to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels in dopaminergic neurons.

Patch-Clamp Recordings from the Dendrite of a Dopaminergic Neuron in a Brain Slice

This video demonstrates the procedure for performing electrophysiological recordings in substantia gelatinosa (SG) neurons of spinal cord slices, using whole-cell patch-clamp techniques to analyze neuron firing patterns. This method allows the study of neural responses to stimuli in SG neurons of the spinal cord.

Whole-Cell Patch Clamp Recording in a Substantia Gelatinosa Neuron of a Spinal Cord Slice

Het opnemen van Ca2+ stromen op het presynaptische afgiftevlak van het membraan is essentieel voor een nauwkeurig begrip van Ca2+-intrede en neurotransmitterafgifte. We presenteren een acute dissociatie van het rugsmerg van de kaakhaai die functionele geïsoleerde reticulospinale axonen oplevert, waardoor opname direct vanaf het afgiftevlak van het membraan van individuele presynaptische terminalen mogelijk is.

Acute Dissociatie van Lamprey Reticulospinal Axonen naar Opnemen inschakelen van de Release Gezicht Membraan van individuele functionele Presynaptische Terminals

Patch-clamp opnames en gelijktijdige intracellulaire biocytinevulling van synaptisch gekoppelde neuronen in acute herfsneden maken een gecorreleerde analyse van hun structurele en functionele eigenschappen mogelijk. Het doel van dit protocol is om de essentiële technische stappen van elektrofysiologisch opnemen van neuronale microcircuits en hun daaropvolgende morfologische analyse te beschrijven.

Elektrofysiologische en morfologische analyse van neuronale Microschake in Acute Brain Slices Met behulp Paired Patch-Clamp Recordings

Hier wordt een procedure gepresenteerd om selectief een neuronaal eiwit te activeren met een korte lichtpuls door genetisch een foto-reactieve onnatuurlijke aminozuur te coderen in een doelneuronaal eiwit dat tot expressie wordt gebracht in neuronen in cultuur of in vivo.

Optische controle van een neuronaal proteïne met behulp van een genetisch gecodeerde Onnatuurlijke aminozuren in neuronen

Dit protocol laat zien op de uitvoering van een geoptimaliseerde N-methyl-D-glucamine (NMDG) beschermende herstelmethode van hersenen segment voorbereiding. Een formulering van één medium wordt gebruikt om op betrouwbare wijze het verkrijgen van gezonde hersenen segmenten van dieren van alle leeftijden en voor diverse experimentele toepassingen.

Voorbereiding van Acute hersenen segmenten met behulp van een geoptimaliseerde N-Methyl-D-glucamine beschermende herstelmethode

Dit protocol beschrijft elementaire procedurele stappen voor het uitvoeren van whole-cell patch-clamp opnames. Deze techniek maakt het onderzoek mogelijk van het elektrisch gedrag van neuronen, en wanneer uitgevoerd in hersencoupes, kan worden nagegaan of verschillende neuronale functies van neuronen die nog geïntegreerd in goed behouden hersenen circuits.

Whole-cell patch-clamp opnamen in Brain Slices

We laten zien hoe we schuine plakjes van het ruggenmerg in jonge muizen bereiden. Deze voorbereiding maakt de stimulatie van de ventrale wortels mogelijk.

De Voorbereiding van de Oblique Spinal Cord Slices voor Ventral Root Stimulation

Subcellulaire patch-clamp opnames bieden de mogelijkheid om de functionele eigenschappen van dendrieten te onderzoeken. Deze fijne structuren zijn echter niet gemakkelijk toegankelijk vanwege hun kleine diameter. Het hier beschreven protocol is bedoeld om het verzamelen van stabiele en betrouwbare opnames van de dendrieten van dopamine neuronen in slicen in vitro te vergemakkelijken.

Subcellulaire Patch-clamp opnamen in het somatodendritische Domein van nigrale Dopamine Neuronen

We presenteren een protocol om acute plakjes te bereiden van de dorsaal-intermediaire hippocampus van muizen. We vergelijken dit transversale preparaat met coronale snijden in termen van kwaliteit van opnames en behoud van morfologische kenmerken van opgenomen neuronen.

Voorbereiding van acute plakjes van Dorsale Hippocampus voor hele celopname en neuronale reconstructie in de dentaat gyrus van volwassen muizen

Dit protocol beschrijft een methode met behulp van een patch-clamp om de elektrische reacties van motorneuronen op ruggenmergstimulatie (SCS) met een hoge spatiotemporele resolutie te bestuderen, wat onderzoekers kan helpen hun vaardigheden te verbeteren bij het scheiden van het ruggenmerg en het tegelijkertijd handhaven van de levensvatbaarheid van de cel.

De ex vivo bereiding van een doorsnede van het ruggenmerg voor de opname van de patchklem in motorneuronen met hele cellen tijdens stimulatie van het ruggenmerg

Leer whole-cell patch-clamp opname in substantia gelatinosa neuronen van acute ruggenmergsnedes. Deze methode onderzoekt intrinsieke membraaneigenschappen en synaptische transmissie voor pijnonderzoek.

Voorbereiding van Acute ruggenmerg segmenten geheel-cel Patch-clamp opname in neuronen van de Substantia Gelatinosa

Meer video's verkennen