Kwantitatieve Polymerase Chain Reaction gebaseerde Analyses van lymfkliertest intestinale Microbiota na behandeling met mondelinge antibiotica

Dit protocol biedt een betrouwbare methode om veranderingen te kwantificeren is darmmicrobiota van muizen na orale antibiotica toediening. Dit kan helpen bij onderzoek naar cross microbiota-interacties die inzicht geven in de pathologieën geassocieerd met microbiële dysbiose zoals inflammatoire darmziekte. Het belangrijkste voordeel van deze antibiotica behandeling regimes is dat ze voorkomen dat de karakteristieke gewichtsverlies normaal geassocieerd met orale antibiotica toediening aan muizen.

Voor de behandeling van antibiotica vooraf te bereiden door middel van orale gavage bereiden een cocktail van antibiotica door het mengen van voorraad oplossingen die zijn voorbereid zoals beschreven in het tech protocol. Voor een volume millilitermix 50 microliter ampicilline, 50 microliter gentamicine, 50 microliter neomycine, 500 microliter metronidazool, 25 microliter vancomycine en 325 microliter water. Laad antibiotica mix op een een milliliter spuit, terwijl het elimineren van eventuele bubbels en bevestig een geschikte gage gavage naald.

Pak de huid stevig over de schouder van de muis en strek het hoofd en de nek om de slokdarm recht te trekken. Richt de balpunt van de voernaald langs het dak van de mond en naar de achterkant van de keelholte. Geef het vervolgens voorzichtig door in de slokdarm en injecteer de 200 microliter oplossing.

Beheer de antibioticacocktail eenmaal per dag voor de duur van het experiment. Als alternatief om antibiotica toe te dienen via het drinkwater, bereiden een cocktail van antibiotica zoals beschreven in het tech protocol. Het is belangrijk om zoetstof op te nemen in het antibioticum mengsel als dit is een cruciale factor om muizen uitdroging te voorkomen.

Vul de antibioticacocktail in een waterfles met ongeveer 100 milliliter per fles. Bescherm de fles tegen licht en plaats in een muizenkooi. Vervang de antibioticacocktail twee keer per week door verse voorraad voor de duur van het experiment.

Zorgvuldige controle van muizen gewicht en algemene gezondheidstoestand moet dagelijks worden voorgevormd gedurende de toediening van antibiotica. Weeg en label twee milliliter autoclave buizen voor monster collectie. Voor het verzamelen van verse ontlasting monsters plaats elke muis in een restrainer.

Verzamel vervolgens fecale pellets rechtstreeks uit de anus in een opvangbuis. Na het uitvoeren van euthanasie zoals beschreven in het tech protocol lag een muis karkas met de buik volledig blootgesteld en spray de buikstreek met 70%ethanol. Met behulp van gesteriliseerde tangen en scharen maken een transversale incisie in de buik om het peratenium bloot te stellen zonder beschadiging van eventuele interne weefsels.

Til het peratenium op en maak een incisie om de darmen bloot te leggen. Verwijder de darmen met de tang en schaar en plaats het in een steriel petrischaaltje. Gebruik voorzichtig tangen om de dunne darm uit de buurt van de mesenterische slagaders en vet te plagen.

Verleng de darm en plaats het op een schoon lab doekje. Met een liniaalmaat en snijd vier centimeter van het distale ileum van de dunne darm. Snijd en gooi de een centimeter darm proximale naar de cecum.

Er zal een drie centimeter deel van ileum links die zal worden gebruikt om darmbacteriën te verzamelen. Houd het ileumgedeelte over een twee milliliter steriele buis. Verzamel het darmgehalte door de darm direct te extruderen en het monster in de buis te verzamelen.

Dit monster zal bacteriën hebben van het ileumgehalte. Bereid een spuit van 20 milliliter met koud fosfaat gebufferde zoutoplossing en spoel het ileumgedeelte door de stroom door. Plaats het ileumgedeelte op een steriel petrischaaltje en open het in de lengterichting met een schaar.

Schraap de binnenkant van de ileumwand met een scalpel. Verzamel alle bacteriën op de scalpel door het te wassen met een milliliter PBS over een schone centrifugebuis. Draai op achtduizend keer G gedurende vijf minuten om de bacteriën pellet.

Na centrifugatie gooi de supernatant. Dit monster bevat bacteriën uit de ileumwand. Weeg de buizen met de monsters van ontlasting en ileum.

Trek het gewicht af van de lege buizen om het fecale gewicht in elk monster te verkrijgen. Haal bacterieel DNA uit ontlasting, ileumgehalte en ileumwandmonsters met behulp van commercieel verkrijgbaar verkrijgbaar kits. Bewaar de DNA-monsters bij min 20 graden Celsius tot gebruik.

Ontdooi de qPCR-standaard, fecale monster-DNA en qPCR-reagentia uit een commercieel verkrijgbaar kit op ijs. Verdun de standaard in steriel DNA-vrij water in een bereik van 10 tot de zeven tot 10 tot de twee kopieën per microliter. Verdun het fecale monster DNA tot de helft, een vijfde en een tiende concentraties.

Maak vervolgens een master mix reactie voor het totale aantal reacties plus een. Meng 30 microliter van de master mix en 5 microliters van de sjabloon, dat is ofwel de standaard, monster of water voor de negatieve controle. Voeg vervolgens 10 microliter van deze mix toe aan elke put in een 384 goed optische qPCR-plaat.

Voer elke reactie in drievoud uit. Verzegel de qPCR-plaat en centrifuge kort. Laad vervolgens de plaat op de qPCR-machine die is geprogrammeerd zoals vermeld in het technische protocol.

Ten slotte verkrijgen van de cyclus drempelwaarden voor de standaard en monsters voor de berekening van de 16S rDNA kopie nummers voor fecale monsters. Representatieve resultaten tonen gewichtsverlies bij muizen na toediening van antibiotica door orale gavage of via het drinkwater. Geen merkbaar gewichtsverlies wordt gedetecteerd bij muizen die antibiotica ontvangen door orale gavage.

Wanneer muizen worden behandeld met antibiotica in het drinkwater verliezen ze ongeveer 10% van hun lichaamsgewicht binnen de eerste paar dagen na de behandeling, maar herstellen daarna de normale gewichtstoename. De kwantificering van bacteriën in fecale monsters vereist het gebruik van een standaardcurve verkregen door het logaritme van het kopienummer voor de standaard ten opzichte van de C-T-waarden die in de qPCR zijn verkregen, in kaart te brengen. Binnen het lineaire bereik maakt de regressieanalysevergelijking kwantificering van de 16S rDNA overvloed binnen de fecale steekproeven mogelijk.

Zoals hier getoond voor ontlasting, dunne darm inhoud en dunne darm wandmonsters. Na vijf of 10 dagen van orale toediening van antibiotica is er een sterke afname van de dichtheid van bacteriën in ontlastingmonsters van met antibiotica behandelde muizen. Nochtans wordt de dichtheid van bacteriën in feces teruggekregen aan normale niveaus één week na antibiotische toediening wordt tegengehouden.

Zowel orale gavage als toediening van antibiotica in het drinkwater verminderen kort de fecale bacteriële belasting bij behandelde muizen. Onderzoekers die de individuele methode selecteren die beter aansluit bij de experimentele vereisten, rekening houdend met factoren zoals de duur van de behandeling. De qPCR-methode voor kwantificering van bacteriën kan worden aangepast om individuele bacteriële taxa te kwantificeren met behulp van specifieke primers.

Dit zal zowel kwantitatieve als gekwalificeerde informatie verschaffen over de grootte en samenstelling van het microbioom.