Name: Label-Free Imaging van één eiwitten uitgescheiden door levende cellen via iSCAT microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Leer label-free detectie van enkele eiwitten uitgescheiden door levende cellen via iSCAT-microscopie. Deze methode maakt real-time observatie van biologische processen op moleculair niveau mogelijk zonder fluorescentielabels.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gesteund door het Max-Planck-Gesellschaft, een hoogleraarschap aan Alexander-von-Humboldt, en de Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC 1181). Wij danken Stefanie Schaffer in Universitätsklinikum Erlangen, voor het verstrekken van Laz388 cellen en voor nuttige discussies. Wij danken Simone Ihloff en Maksim Schwab op MPL voor technische ondersteuning.

<ol><li>Hathout, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+the+study+of+the+cell+secretome%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Approaches to the study of the cell secretome.</a> Expert Review of Proteomics. 4 (2), 239-248 (2007).</li>
<li>Pandey, A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+to+study+genes+and+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proteomics to study genes and genomes.</a> Nature. 405 (6788), 837-846 (2000).</li>
<li>Makridakis, M., Vlahou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretome+proteomics+for+discovery+of+cancer+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers.</a> Journal of Proteomics. 73 (12), 2291-2305 (2010).</li>
<li>Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+spectrometry+in+proteomics%3A+a+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (4), 1017-1031 (2007).</li>
<li>MacBeath, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12454649">Protein microarrays and proteomics.</a> Nature Genetics. 32, 526-532 (2002).</li>
<li>Seder, R. A., Darrah, P. A., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+quality+in+memory+and+protection%3A+implications+for+vaccine+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (4), 247-258 (2008).</li>
<li>Moerner, W. E., Fromm, D. P. <a target="_blank" href="https://aip.scitation.org/doi/10.1063/1.1589587">Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).</li>
<li>Borisov, S. M., Wolfbeis, O. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18229952">Optical biosensors.</a> Chemical Reviews. 108 (2), 423-461 (2008).</li>
<li>Dantham, V. R., Holler, S., Barbre, C., Keng, D., Kolchenko, V., Arnold, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-Free+Detection+of+Single+Protein+Using+a+Nanoplasmonic-Photonic+Hybrid+Microcavity%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Label-Free Detection of Single Protein Using a Nanoplasmonic-Photonic Hybrid Microcavity.</a> Nano Letters. 13 (7), 3347-3351 (2013).</li>
<li>Zijlstra, P., Paulo, P. M. R., Orrit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+detection+of+single+non-absorbing+molecules+using+the+surface+plasmon+resonance+of+a+gold+nanorod%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Optical detection of single non-absorbing molecules using the surface plasmon resonance of a gold nanorod.</a> Nature Nanotechnology. 7 (6), 379-382 (2012).</li>
<li>Rickgauer, J. P., Grigorieff, N., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-protein+detection+in+crowded+molecular+environments+in+cryo-EM+images%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Single-protein detection in crowded molecular environments in cryo-EM images.</a> eLife. 6, e25648(2017).</li>
<li>Lindfors, K., Kalkbrenner, T., Stoller, P., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+Spectroscopy+of+Gold+Nanoparticles+Using+Supercontinuum+White+Light+Confocal+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Detection and Spectroscopy of Gold Nanoparticles Using Supercontinuum White Light Confocal Microscopy.</a> Physical Review Letters. 93 (3), 037401(2004).</li>
<li>Jacobsen, V., Stoller, P., Brunner, C., Vogel, V., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+optical+detection+and+tracking+of+very+small+gold+nanoparticles+at+a+water-glass+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Interferometric optical detection and tracking of very small gold nanoparticles at a water-glass interface.</a> Optics Express. 14 (1), 405(2006).</li>
<li>Piliarik, M., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+optical+sensing+of+single+unlabelled+proteins+and+super-resolution+imaging+of+their+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Direct optical sensing of single unlabelled proteins and super-resolution imaging of their binding sites.</a> Nature Communications. 5, 4495(2014).</li>
<li>Roux, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+Structure+and+Function+as+Revealed+by+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Archives+of+Allergy+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin Structure and Function as Revealed by Electron Microscopy.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 120 (2), 85-99 (1999).</li>
<li>McDonald, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Single-Cell+Secretion+Dynamics+with+Single-Protein+Sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Visualizing Single-Cell Secretion Dynamics with Single-Protein Sensitivity.</a> Nano Letters. 18 (1), 513-519 (2018).</li>
<li>Kukura, P., Ewers, H., Müller, C., Renn, A., Helenius, A., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+nanoscopic+tracking+of+the+position+and+orientation+of+a+single+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus.</a> Nature Methods. 6 (12), 923-927 (2009).</li>
<li>Ortega Arroyo, J., Cole, D., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+scattering+microscopy+and+its+combination+with+single-molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Interferometric scattering microscopy and its combination with single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Protocols. 11 (4), 617-633 (2016).</li>
<li>Spindler, S., et al. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0022-3727/49/27/274002/meta">Visualization of lipids and proteins at high spatial and temporal resolution via interferometric scattering (iSCAT) microscopy.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 49 (27), 274002(2016).</li>
<li>Lazarus, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+unique+cell+line+%28LAZ+221%29+from+human+acute+lymphocytic+%28%26%2334%3Bnull%26%2334%3B+cell%29+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of a unique cell line (LAZ 221) from human acute lymphocytic (&#34;null&#34; cell) leukemia.</a> Cancer Research. 38 (5), 1362-1367 (1978).</li>
<li>Mackensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+in+situ+amplification+of+cytotoxic+T-lymphocytes+with+antitumor+activity+in+a+human+regressive+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Evidence for in situ amplification of cytotoxic T-lymphocytes with antitumor activity in a human regressive melanoma.</a> Cancer Research. 53 (15), 3569-3573 (1993).</li>
<li>Crowley, L. C., Scott, A. P., Marfell, B. J., Boughaba, J. A., Chojnowski, G., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+cell+death+by+propidium+iodide+uptake+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), 647-651 (2016).</li>
<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/0471747599.cac012">Primary Culture.</a> Culture of Animal Cells. , (2005).</li>
<li>Dahmardeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDahmardeh%2C+M+%22Unpublished+data%22">Unpublished data</a>. , (2018).</li>
<li>Majno, G., Joris, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+oncosis%2C+and+necrosis.+An+overview+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death.</a> American Journal of Pathology. 146 (1), 3-15 (1995).</li>
<li>Bellve, K., Standley, C., Lifshitz, L., Fogarty, K. <a target="_blank" href="https://www.cell.com/biophysj/abstract/S0006-3495(13)04613-4">Design and Implementation of 3D Focus Stabilization for Fluorescence Microscopy.</a> Biophysical Journal. 106 (2), 606a(2014).</li>
<li>Liebel, M., Hugall, J. T., Van Hulst, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+Label-Free+Nanosensing+and+High-Speed+Tracking+of+Single+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive Label-Free Nanosensing and High-Speed Tracking of Single Proteins.</a> Nano Letters. 17 (2), 1277-1281 (2017).</li>
<li>Young, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+imaging+of+single+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass imaging of single biological macromolecules.</a> Science. 360 (6387), 423-427 (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een van de meest cruciale aspecten voor het verkrijgen van nuttige iSCAT gegevens is de mogelijkheid om het vinden van de juiste focal positie op het dekglaasje aan oppervlak, en, bovendien, houd deze positie voor langere tijd. Niet te doen zal resulteren in de verruimde spinnen bestemde, zwakke iSCAT signalen en drift-geassocieerde artefacten in dynamics analyses. Het blijkt dat het brandvlak vinden op een dekglaasje schoon, kaal aan oppervlak niet een gemakkelijke taak is als oppervlaktekenmerken niet zichtbaar tegen de achtergrond van de lichtbundel grote referentie zijn (Zie Figuur 4 d).
Rauwe iSCAT beelden zijn vaak verduisterd door achtergrond signalen die voortvloeien uit de wavefront onzuiverheden in de bron excitatie en iemands vermogen om te vinden van de juiste beeldvorming vliegtuig kunnen belemmeren. Actieve wavefront aftrekken is een handige manier om dit probleem te omzeilen en vervolgens controleren de iSCAT focus tijdens een meting16. Een manier om dit te bereiken is via ruimtelijke monster modulatie. Kortom, geldt een functiegenerator een blokgolf 50 Hz voor de poort van de externe controle van de piëzo-fase, wat resulteert in een ruimtelijke monster modulatie op de toegepaste frequentie (290 nm amplitude). Synchrone camera overnames worden getriggerd uit dezelfde bron, en combinatie door lock-in principes, leiden tot een wavefront-gecompenseerd afbeelding14,16. De resulterende afbeelding toont meestal de oppervlakteruwheid van het dekglaasje aan (figuur 4e). Kleine elementen na reiniging kan worden gebruikt om de Microscoop in focus nog op het glas. Parameters die worden gebruikt voor deze actieve achtergrond aftrekken stap kunnen worden gewijzigd volgens de framesnelheid, belichtingstijd of hardware.
Zoals hierboven vermeld, het gebruik van een hoge kwaliteit balk splitter in het iSCAT-setup (stap 1.2.1.) wordt aanbevolen, als artefacten zoals beeldschaduwen imaging of interferentie als gevolg van dunne vlakke beam splitters zal beïnvloeden het beeld en de meting verstoren. Figure 7 toont een vergelijking tussen een hoge kwaliteit en lage kwaliteit balk splitter. Beide raw iSCAT beelden tonen hetzelfde gebied op het dekglaasje aan met sommige overblijvende deeltjes. De zelfde iSCAT setup werd gebruikt om beide beelden te vangen, alleen de balk splitter werd uitgewisseld. Figuur 7a toont het beeld gevormd op de camera door het gebruik van een dikkere (5 mm), AR-coating, en steken balk splitter. Wegens de steken opzet, de weerkaatste lichtbundel van het achterste oppervlak van de balk splitter is anti-parallel aan de reflectie die voortvloeien uit de voorzijde en is het niet invoeren van de doelstelling. Geen inmenging artefacten optreden. Figuur 7b toont het hetzelfde gezichtsveld op monster, maar ditmaal een dunner (1 mm) vlakke balk splitter is gebruikt. De twee reflecties van de oppervlakken van voor- en achterkant van de balk splitter zijn parallelle en doorgeven aan de camera. Interferentie artefacten zijn duidelijk zichtbaar.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58486/58486fig7.jpg"> Figuur 7: vergelijking van iSCAT beelden geproduceerd met behulp van hoge - en lage-kwaliteit beam splitters. (a) afbeelding van de rauwe iSCAT Resulting door gebruik van een 5 mm dikke AR-coating en steken balk splitter. (b) Resulting rauwe iSCAT afbeelding van hetzelfde gebied door gebruik van een 1 mm dikke vlakke balk splitter. Beide beam splitters hebben dezelfde verdelende verhouding (50% reflectie, 50% overdracht). Interferentie artefacten die voortvloeien uit de reflecties van de Fresnel duidelijk in acht worden genomen in de afbeelding dat is geproduceerd met de 1 mm dik vlakke balk splitter. Schaal bars: 2 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58486/58486fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
In dit protocol beschrijven we een regeling van de verlichting van het breed-gebied voor iSCAT zoals het is snel, eenvoudig te realiseren en zorgt voor parallelle sensing over een groot gebied14. Een andere gemeenschappelijke benadering is het gebruik van akoestisch-optische leidschoepen (gedelegeerd) en het scannen van een confocal balk over de monster12,17. Deze aanpak voorkomt de noodzaak van kwalitatief hoogstaande wavefronts maar is meer experimenteel complex dan conventionele beeldvorming van het breed-gebied. Bovendien wordt de snelheid van de confocal verlichtingssterkte beperkt door die van gedelegeerd. Afhankelijk van de gewenste experimentele parameters, kunnen, beide regelingen confocal of breed-gebied verlichting in principe, worden gebruikt om detecteren één eiwitten afgescheiden van levende cellen.
Zoals besproken in het gehele protocol, is het noodzakelijk om te minimaliseren van de laterale mechanische schommelingen in de fase van het monster van de Microscoop. Zelfs nanometer afwijkingen in de positie van het monster kunnen leiden tot variaties in opeenvolgende camera frames en veroorzaken aanzienlijke omgevingsgeluid in de differentiële afbeelding. Daarom wordt aangeraden om een mechanisch stabiel Microscoop-fase en een gedempte optische tabel (stap 1.1.1.) te gebruiken en ter dekking van de installatie met optische gordijnen of panelen tijdens een experiment (stap 3.5.).
Een actieve focus stabilisatie regeling kan ook worden overwogen voor de lange termijn metingen. In deze aanpak, is een tweede laser in een totale interne reflectie (TIR) regeling opgenomen in de Microscoop en vervolgens beeld op een fotodiode Kwadrant. Wijzigingen in het systeem focus vertalen naar laterale verplaatsingen van de plek op de Kwadrant diode, die vervolgens kan worden gebruikt in een actieve terugkoppeling te controleren van de z-as van de piezo fase26TIR-laser. Langetermijneffecten van de verticale drift worden dus geëlimineerd.
Verschillende wijzigingen en uitbreidingen kunnen worden toegepast op de gepresenteerde techniek om specifieke experimentele behoeften. Commerciële Microscoop fase incubators zijn bijvoorbeeld beschikbaar die gemakkelijk in de Microscoop iSCAT voor langdurige beeldvorming van cellen kunnen worden opgenomen. Andere technieken kunnen ook worden uitgevoerd als aanvulling op iSCAT imaging, zoals confocal of TIR fluorescentie microscopies17. Aan te passen op het systeem onder studie, iSCAT secretie metingen kunnen worden verricht in een andere cel media zoals DMEM of DPBS, echter moet de pH-indicator fenol-rode worden vermeden aangezien het het experiment als gevolg van de absorptie van het laserlicht kan verstoren. Bovendien bevatten de supplementen zoals foetaal kalfsserum (FCS) of menselijke bloedplaatjes lysate (hPL) eiwitten die met de detectie van de iSCAT interfereren kunnen. Afhankelijk van de gewenste gevoeligheid van het experiment, dienen deze supplementen worden uitgesloten van de microscopie medium.
iSCAT afhankelijk van een analyt scatter licht kunnen — een eigenschap die inherent is aan alle eiwitten — en dus inherent niet-specifieke. Niettemin, is een zekere mate van specificiteit kan als iSCAT signalen schaal lineair met eiwit massa14,27,28. Dit zorgt voor de kalibratie van een systeem van de iSCAT met behulp van standaard EiwitSteekproeven, zoals bovien serumalbumine (BSA) en fibrinogeen14,27,28. In feite, zeer onlangs, jonge et al. 28 hebben uitgebreid over het werk van Piliarik & Sandoghdar14 en hebben aangetoond dat iSCAT kan worden gebruikt voor het bepalen van het molecuulgewicht van eiwitten zo klein als daar (53 kDa) met een massa resolutie van 19 kDa en een nauwkeurigheid van ongeveer 5 kDa. Verschillende conventionele benaderingen kunnen iSCAT verder aanvullen door middel van een extra niveau van specificiteit. Als een voorbeeld, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), en/of andere oppervlakte wijzigingen, eiwit bindende gebeurtenissen zodanig beperken dat alleen het doel eiwit gedetecteerde16 is.
In dit protocol beschreven we hoe iSCAT microscopie kan worden gebruikt voor het onderzoeken van cellulaire afscheidingen op het niveau van één eiwit met subsecond temporele resolutie16. De techniek is algemeen en op alle commerciële of huis-gebouwde Microscoop kan worden uitgevoerd. In tegenstelling tot één-molecuul fluorescentie benaderingen, de methode geen last van photobleaching of knipperen effecten, maar het nog steeds behaalt single-eiwit gevoeligheid. Deze eigenschappen maken iSCAT een krachtig instrument op het gebied van biosensing en microscopie. Toekomstige toepassingen zal zich richten op het ophelderen van complexe cellulaire interacties zoals immunologische reactie op een stimulus of cellulaire communicatie.

Secreted eiwitten spelen een belangrijke rol in verschillende fysiologische processen1. Hierdoor worden zij routinematig bestudeerd als een collectieve ensemble (proteomics) of als afzonderlijke entiteiten2,3. Proteomics onderzoekt traditioneel de hele set van eiwitten aanwezig zijn in een bepaald biologisch systeem door middel van bijvoorbeeld enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), stroom cytometry of massaspectrometrie4,5, 6. Aan de andere kant, zijn één eiwitten, over het algemeen gedetecteerd met behulp van een verscheidenheid van technieken die zijn gebaseerd op de fluorescentie7,8, plasmonics9,10, of cryogene elektron11 microscopies. Al deze technieken gebruik van complexe instrumenten, labelen, of beide en ontbreekt het vaak aan dynamiek informatie zoals zij alleen op lange termijn informatie over het systeem onder studie leveren.
Hier gebruiken we iSCAT12,13 microscopie aan gevoel individuele secretoire eiwitten met sub tweede temporele resolutie14. Nog belangrijker is, detecteert de techniek het zwakke verspreide signaal inherent is aan iedere eiwit12,14. De hoeveelheid licht die een kleine bioparticle verstrooit schalen met haar polarizability. Ervan uitgaande dat de vorm van een eiwit kan worden benaderd door een effectieve verstrooiing bol14,15,16, en dat verschillende eiwitten hebben zeer vergelijkbaar brekingsindices, de gemeten signaal rechtstreeks kan worden aangesloten op het molecuulgewicht (MW) van het eiwit. De empirische kalibratie van iSCAT contrast versus moleculair gewicht door referentiemetingen kan men onderscheiden van proteïnen van verschillende maten. iSCAT experimenten kunnen gemakkelijk worden aangevuld met fluorescentie microscopie17,18, immunosorbent reagentia, evenals TL of verstrooiing etiketten te maken voor een specifieke detectie van een proteïne van belang14 , 17 , 19.
In principe functioneert iSCAT door het sturen van een eiwit zwakke verstrooide licht via de interferometrische mengen met een secundaire verwijzing Golf. De gedetecteerde intensiteit (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq1.jpg">) in een iSCAT Microscoop wordt beschreven door
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq2.jpg">
waar <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq3.jpg"> is de incident intensiteit, <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq4.jpg"> is een coëfficiënt voor de bijdrage van de referentie-Golf, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq5.jpg"> betekent de kracht van de verstrooiing van de nano-object onder studie, en <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq6.jpg"> is de faseverschuiving tussen de verspreide en verwijst naar golven14. Ofwel het verzonden of gereflecteerd, rug incident licht wordt meestal gebruikt als een referentie-Golf, waar in elk geval <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq7.jpg"> rekeningen voor de transmissivity of de reflectiviteit van de monsterkamer, respectievelijk. De term <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq8.jpg"> is evenredig aan het eiwit van verstrooiing cross sectie en kan worden verwaarloosd t.o.v. de cross term. Aldus, de vaststelling van <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq9.jpg"> voor volledige destructieve interferentie, het gedetecteerde licht wordt gegeven door <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq10.jpg"> waar <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq11.jpg"> is de intensiteit van de verwijzing en <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq12.jpg"> is de intensiteit van de storing.
iSCAT microscopie biedt een uitstekende methode om te bestuderen van de biologische processen op het niveau van de single-molecuul. Als voorbeeld, onderzoeken we de Laz388 cellen — een Epstein - Barr virus (EBV) getransformeerd B-lymfocyt cel lijn20,21 — zoals ze eiwitten zoals IgG antilichamen16 afscheiden. Echter, de methode is algemeen en kan worden toegepast op een verscheidenheid van andere biologische systemen. iSCAT is inherent aspecifieke en eiwit kan detecteren of nanoparticle, of het kan worden uitgebreid met gemeenschappelijk oppervlak functionalization methoden voor de detectie van de specifieke of multiplexed. De eenvoud en de mogelijkheid om te worden gecombineerd met andere optische technieken, zoals fluorescentie microscopie, maken van iSCAT een waardevolle aanvullend instrument in de celbiologie.

<table><tbody><tr><td>Item/Device</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100x / 1.46 NA objectief</td><td>Zeiss</td><td>420792-9800-000</td><td>alpha Plan Apochromat olie-immersie</td></tr><tr><td>20x / 0.4 NA objectief</td><td>Leica</td><td>566049</td><td>N Plan</td></tr><tr><td>Piezo Stage</td><td>PI</td><td>P-517k020</td><td>3-as stage met 100x100x10&micro;m bereik</td></tr><tr><td>Diode laser (445 nm)</td><td>Lasertack</td><td>PD-01236</td><td></td></tr><tr><td>Optische/optomechanische componenten</td><td>Thorlabs/Newport</td><td>-</td><td>lenzen, spiegels, posten, bevestigingen</td></tr><tr><td>Pinhole</td><td>Thorlabs</td><td>P30H</td><td></td></tr><tr><td>LED lichtbron</td><td>Thorlabs</td><td>MCWHL5</td><td></td></tr><tr><td>Shortpass filter (580 nm)</td><td>Omega Optical</td><td>580SP</td><td>om het spectrum van de LED voor fluorescentie-excitatie aan te passen</td></tr><tr><td>Longpass filter (500 nm)</td><td>Thorlabs</td><td>FEL0500</td><td>om het spectrum van de LED voor fluorescentie-excitatie aan te passen</td></tr><tr><td>70R/30T straalvonger</td><td>Newport</td><td>20Q20BS.1</td><td></td></tr><tr><td>Economy straalvonger</td><td>Thorlabs</td><td>EBS1</td><td>gebruikt voor de vergelijking van franje-effecten</td></tr><tr><td>Wedge-plate straalvonger</td><td>Thorlabs</td><td>BSW26</td><td>gebruikt voor de vergelijking van franje-effecten</td></tr><tr><td>Shortpass dichroitische spiegel (550 nm)</td><td>Edmund Optics</td><td>66249</td><td></td></tr><tr><td>8R/92T straalvonger</td><td>Thorlabs</td><td>BP108</td><td></td></tr><tr><td>CMOS camera</td><td>Photonfocus</td><td>MV1-D1024E-160-CL</td><td>voor iSCAT-verwerving</td></tr><tr><td>CMOS camera's</td><td>Mightex</td><td>SCE-B013-U</td><td>voor bright field / fluorescentie-verwerving</td></tr><tr><td>Longpass filter (600 nm)</td><td>Thorlabs</td><td>FELH0600</td><td></td></tr><tr><td>Computer</td><td>Fujitsu Siemens&nbsp;</td><td>-</td><td>Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD</td></tr><tr><td>Verwervingssoftware</td><td>LabVIEW</td><td>-</td><td>LabVIEW 2016 Suite</td></tr><tr><td>Analysesoftware</td><td>Matlab</td><td>-</td><td>Matlab 2014 Suite</td></tr><tr><td>Plasma-reiniger</td><td>Diener</td><td>Diener pico</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Binder</td><td>Model CB</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Reagens/Materiaal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Gibco</td><td>11835063</td><td>zonder fenol rood</td></tr><tr><td>HEPES Bufferoplossing (1M)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59205C</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes</td><td>Marienfeld</td><td>107052</td><td></td></tr><tr><td>Cultuurschalen met glazen bodem</td><td>ibidi</td><td>81158</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescente microsferen</td><td>Invitrogen</td><td>F8821</td><td>gebruikt voor kalibratie</td></tr><tr><td>Immersol-immersieolie</td><td>Zeiss</td><td>444960</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumjodide kleurstof</td><td>Invitrogen</td><td>R37108</td><td></td></tr><tr><td>Kleine pipettentips</td><td>Eppendorf</td><td>30075005</td><td></td></tr><tr><td>Flexibele pipettentips</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 99.8%</td><td>Fisher Scientific</td><td>E/0650DF/15</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide, korrels</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221465</td><td>voor het bereiden van 0.2M NaOH-oplossing</td></tr></tbody></table>

label-free imaging van één eiwitten uitgescheiden door levende cellen via iscat microscopie

Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy

We tonen de interferometrische verstrooiing (iSCAT) microscopie, een methode voor het opsporen van één labelloze eiwitten uitgescheiden door individuele levende cellen in real time van. In dit protocol behandelen wij de fundamentele stappen voor het realiseren van een iSCAT-Microscoop en aanvullen met extra imaging kanalen om te controleren de levensvatbaarheid van een cel bestudeerde. Na dit gebruiken we de methode voor real-time detectie van enkele eiwitten zoals ze worden uitgescheiden van een levende cel waaruit we met een vereeuwigd B-cel-lijn (Laz388). Nodige maatregelen betreffende de voorbereiding van de Microscoop en monster alsook de analyse van de vastgelegde gegevens worden besproken. Het protocol van de video toont aan dat iSCAT microscopie biedt een eenvoudige methode om te studeren secretie op het niveau van de single-molecuul.

Een schematische voorstelling van een Microscoop iSCAT is afgebeeld in figuur 4a. Representatieve helder-veld, fluorescentie en rauwe iSCAT afbeeldingen worden weergegeven in figuur 4b, 4 cen 4 d, respectievelijk16. Figuur 4e en 4f tonen de resultaten van de achtergrond verwijderen en differentiële nabewerking; twee geadsorbeerde eiwitten zijn zichtbaar als diffractie-beperkte plekken in 4f van de figuur. Figuur 6 toont een histogram van de gedetecteerde eiwitten in de loop van de 125 s. Deze gegevens werden verkregen door toepassing van een algoritme piek-zoekende naar de opnames om te tellen de bindende gebeurtenissen en hun contrast16winkel. Een totaal van 503 eiwitten werden ontdekt.
Volgende, secreted soorten zijn geïdentificeerd ten opzichte van de referentiemetingen uitgevoerd op gezuiverde eiwit oplossingen, of via aanvullende metingen met matiemaatschappij glazen oppervlakken14,16. De iSCAT gegevens, dus visualiseren direct cellulaire secretie dynamiek op een subsecond schaal16. Als voorbeeld, hebben we eerder geconstateerd dat IgG antilichamen een belangrijke fractie van de Laz388 secretome zijn en zijn vrijgelaten uit de cel met een snelheid van ca. 100 moleculen per tweede16. Daarnaast worden andere deeltjes die verspreid over een bereik van 100 kDa - 1000 kDa uitgescheiden door de cellen16. De beschreven methode kunnen verder werknemer bijvoorbeeld te onderzoeken van de ruimtelijke gradiënt van de concentratie van afscheidingen rond een cel16, of om te bepalen van de temporele dynamiek van cellulaire lysis16.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58486/58486fig6.jpg"> Figuur 6: kwantificering van secreted eiwitten door een eencellige Laz388. Het histogram geeft gedetecteerde eiwitten in een periode van 125 s. Contrast waarden worden verzameld in 1 x 10-4 contrast bakken (blauwe staven). Een totaal van 503 individuele eiwitten werden geteld tijdens deze meting. Het experiment werd 10 keer herhaald met vergelijkbare resultaten. Dit percentage is aangepast van McDonald, M.P. et al. 16. copyright 2018 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58486/58486fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

We presenteren een protocol voor de real-time optische detectie van één labelloze eiwitten zoals ze worden uitgescheiden uit levende cellen. Dit is gebaseerd op de microscopie interferometrische verstrooiing (iSCAT), die kan worden toegepast op een verscheidenheid van verschillende biologische systemen en configuraties.

Label-Free Imaging van één eiwitten uitgescheiden door levende cellen via iSCAT microscopie

We demonstrate interferometric scattering (iSCAT) microscopy, a method capable of detecting single unlabeled proteins secreted from individual living ...

We presenteerden iSCAT voor het eerst in 2004 in het kader van detectie en spectroscopie van gouden nanodeeltjes. In de 10 jaar die volgden hebben we deze techniek verder ontwikkeld voor het opsporen en volgen van biologische nanodeeltjes zoals virussen en kleine eiwitten. De essentie van de techniek is dat elk materieel object, hoe klein ook, een eindige uitstervingsdoorsnede heeft.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de labelvrije detectie. Dit betekent dat als we gevoelig genoeg zijn, we zowat alles kunnen detecteren, zoals eiwitten of exosomen die uit één cel worden verwijderd. Het probleem dat men moet voorzichtig zijn over is hoe de verstrooiing achtergrond te behandelen.Een groot voordeel van een iSCAT microscoop is dat het volledig kan worden gebouwd en het kan worden toegevoegd aan een bestaande commerciële microscoop. Dit betekent dat het gemakkelijk kan worden gecombineerd met andere optische technieken, zoals fluorescentie, en dit is een van de redenen dat veel groepen nu ook gebruik maken van iSCAT en aanverwante technieken. Hier gebruiken we LUZ cellen als een modelsysteem om de detectie van individuele en secretoire eiwitten te tonen.Deze methode kan echter ook worden toegepast om bijna elk biologisch proces op moleculair niveau te onderzoeken. Om een stabiele microscoop te bereiken, begin met een gedempte optische tafel en een stijf massief blok voor de monsterfase. Bouw een microscoop voorbeeld fase die een hoge numerieke diafragma doelstelling en een vertaling eenheid die het mogelijk maakt voor laterale voorbeeld vertaling en verandering van focus positie voor de doelstelling bevat.Gebruik een 45 graden verticale koppeling spiegel en een 50 centimeter brandpuntsafstand singlet lens om het licht van een diode laser scherp te stellen op golflengte 445 nanometer op de achterkant brandpuntsvlak van de doelstelling. Deze wide field lens creëert een collimated beam op de voorwaartse focus van de doelstelling, die de iSCAT verlichtingsbron zal worden. Breng een druppel onderdompelingsolie aan op het doel en plaats een glazen coverslip in het monstervlak van het microscoopstadium.Dit zal resulteren in een straal die terug naar beneden reflecteert door de beeldvorming doelstelling. Om het beeldvormingspad in te stellen, introduceert u een met antireflectie gecoate beamsplitter in een hoek van 45 graden ten opzichte van de incidentstraal en ongeveer 10 centimeter na de groothoeklens. Zorg ervoor dat de antireflectiecoating naar de laserbron wijst.Let op als een dikke beamsplitter zal leiden tot aanzienlijke bundel verplaatsing, zodat de laser niet meer in het doel recht. Indien nodig, opnieuw uitlijnen van de laserstraal pad voor de beamsplitter om de juiste voortplanting door het doel te garanderen. Om ervoor te zorgen dat het monstervlak en de camera parfocal zijn, moet u beginnen met het plaatsen van een holle lens met een negatieve brandpuntsafstand van 45 centimeter op een positie vijf centimeter na de breedveldlens in het incidentbundelpad.Dit zal resulteren in een collimated bundel het invoeren van de achterkant diafragma van het doel. Als het scherm in de reflecterende arm van de interferometer is geplaatst, beweegt u het doel in de verticale richting om de grove brandpuntspositie te vinden. Het doel is in focus wanneer de bundel het raken van het scherm wordt verzameld.Verwijder zowel de negatieve brandpuntsafstand lens en het scherm wanneer grof scherpstellen is voltooid. Voeg een tweede 50 centimeter brandpuntsafstand singlet lens om het verspreide licht scherp te stellen en om het gereflecteerde licht te colliëren. Zorg ervoor dat de lens 50 centimeter van het achterste brandpuntsvlak van het doel wordt geplaatst, zodat de overgebrachte laserstraal opnieuw wordt verzameld.Om de iSCAT setup assemblage te voltooien, plaatst u de CMOS-camera op 50 centimeter afstand van de 50 centimeter brandpuntsafstandlens en plaatst u de straal direct op het midden van de chip. Als u extra beeldvormende kanalen wilt instellen, koppelt u de output van een LED-lichtbron aan een doelstelling voor lange werkafstand. Installeer mechanische componenten boven de monsterkamer die het mogelijk maken de LED-uitgang op het monster te concentreren en laterale te positioneren.Verplaats de bovenste doelstelling lateraal, zodat de bovenste breed veld doelstelling en de lagere iSCAT doelstelling zijn colinear. Dit wordt bepaald door het plaatsen van een scherm onder de lagere doelstelling en het maximaliseren van de intensiteit van de uitgezonden LED-licht op het scherm. Plaats nu een 550 nanometer shortpass dichroic spiegel om de verzonden LED-licht te splitsen van de iSCAT laser pad.Splits deze straal in twee kanalen met een acht procent reflecterende, 92 procent transmissive, beamsplitter. De 92 procent pad is de fluorescentie kanaal, en de acht procent pad wordt gebruikt voor brightfield imaging. Beeld het brightfield-kanaal op een CMOS-camera met een brandpuntsafstand van vijf centimeter achromatische doubletlens.Beeld het fluorescentiekanaal op een aparte CMOS-camera met behulp van een vijf centimeter brandpuntsafstand achromatische doublet lens. Gebruik ook een longpassfilter van 600 nanometer om het excitatielicht te blokkeren. Als u de computer en software wilt instellen, sluit u alle camera's aan op een computer.Let op de volledig geassembleerde opstelling op het iSCAT-beeld op de CMOS-camera en zorg ervoor dat deze scherp is door een reststof of vuildeeltje op de glazen afdekking te vinden. Controleer of het beeld van het deeltje een cirkelvormige symmetrische puntspreadfunctie is. De puntspreadfunctie heeft geen cirkelvormige vorm als de laserstraal onder een lichte hoek in de microscoopdoelstelling komt.Dit kan worden gecorrigeerd door een lichte aanpassing van de 45 graden spiegel om een rechte koppeling in de doelstelling te garanderen. Vergelijk de camerabeelden van het brightfield en de fluorescentiekanalen. Zorg ervoor dat beide scherp zijn en geef hetzelfde gebied weer door een fluorescerend kraal of celmonster te maken.Controleer of de positie van de iSCAT-laser ongeveer in het midden van de afbeelding staat en let op de positie ervan voor latere referentie. Om de positie en het gezichtsveld van het brightfield en het fluorescentiekanaal te veranderen, verplaatst u de camera's op de tafel met betrekking tot de scherpstellenzen. Bereid u voor op het experiment zoals beschreven in het tekstprotocol.Dit omvat de bereiding van de cellen en microscopie medium, evenals de microscoop monster cuvette. Zorg ervoor dat de laserstraal wordt geblokkeerd om te voorkomen dat de cellen direct worden blootgesteld aan het iSCAT-laserlicht. Injecteer ongeveer drie microliters van het voorbereide celmonster iets buiten het midden in de monster cuvette.Raak de pipetpunt voorzichtig aan op de coverslip en injecteer de celoplossing langzaam. Laat de cellen zich op de coverlip nestelen. Controleer het aantal cellen in de buurt van de iSCAT-laser.Als het aantal cellen te laag is, herhaalt u deze stap totdat er voldoende aantal beschikbaar is. Als de dekking van cellen te dicht is, gebruikt u een injectie van ongeveer 20 microliter extra microscopiemedium om de cellen over de coverslip te verspreiden. Met de piëzo-elektrische vertaalfase verplaatst u het voorbeeld lateraal om een cel dicht bij het gezichtsveld van iSCAT te plaatsen.Zorg ervoor dat de cel niet in het gezichtsveld van de ISCAT komt, omdat directe blootstelling aan het laserlicht van 445 nanometer schadelijk kan zijn voor de cel. Deblokkeer de iSCAT-laserstraal en zorg ervoor dat het coverslipoppervlak nog scherp is. Omsluit de isolatietafel om drift en akoestische koppeling van de omgeving te minimaliseren.Start de meting door het verwerven van beelden van de iSCAT, brightfield, en fluorescentie camera's. Controleer periodiek de levensvatbaarheid van de cel en de focus van het systeem. Hier wordt zelfgeschreven microscoopsoftware gebruikt om de camerabeelden weer te geven.Hier wordt differentiële beeldvorming in realtime uitgevoerd door opeenvolgende frames af tetrekken om eiwitbindingen zichtbaar te maken. Dit resulteert in een gefilterde afbeelding die samen met het ruwe camerabeeld op het scherm zichtbaar is. Representatieve resultaten van een cellulair afscheidingsexperiment uitgevoerd met iSCAT worden hier weergegeven.De video toont afscheidingen van een LAZ cel in de loop van twee minuten. Differentiële iSCAT-afbeeldingen aan de linkerkant visualiseren de absorptie van enkele eiwitten in de coverglass. De brightfield beelden en fluorescentie kanaal aan de rechterkant worden gebruikt om de levensvatbaarheid van de cel te controleren.Dit histogram toont de gedetecteerde eiwitten en hun contrastbereik binnen die periode van twee minuten. De gegevens werden verzameld door het analyseren van individuele bindende gebeurtenissen in elk frame van de iSCAT video gegevens met behulp van een aangepaste piek zoeken algoritme. ISCAT-microscopie is niet alleen een krachtig hulpmiddel in de biosensing, maar ook in microscopie, omdat het labelvrije detectie van nano-objecten in realtime mogelijk maakt.In het bijzonder kan het worden toegepast op een verscheidenheid van processen, zoals diffusie en transport van eiwitten. Door zijn uitstekende gevoeligheid voor lichtverstrooiing kan iSCAT elk eiwit of entiteit op het gezichtsveld detecteren. Natuurlijk betekent dit ook dat de techniek niet de specificiteit mist die fluorescentie met zich meebrengt, maar om dit probleem te omzeilen, kan men aanvullende methoden toepassen, zoals oppervlaktefunctionalisatie om specifieke eiwitten van belang te detecteren.Vergeet niet dat het werken met lasers gevaarlijk kan zijn, en de juiste oogbescherming moet altijd worden gedragen bij het monteren en aanpassen van de microscoop. Real-time detectie van secretomen is erg spannend en een grote sprong in de medische diagnostiek, die momenteel veel langere tijd vergt en is zeer verre van single eiwit gevoeligheid. Er is nog volop ruimte voor het verbeteren van de prestaties van de methode en het uitbreiden van de toepassingen.Dus we hopen dat deze video helpt andere groepen deelnemen aan deze spannende inspanning.

label-free-imaging-single-proteins-secreted-from-living-cells-via

Research

JoVE Journal

Engineering

Techniek

Deze video laat zien experimenten met daarop volgende analyse van eiwit-eiwit interacties door het gebruik van micro-oppervlakken met een patroon. De aanpak biedt de mogelijkheid om eiwit interacties op te sporen in levende cellen en combineert een hoge doorvoer-mogelijkheden met de mogelijkheid te extraheren kwantitatieve informatie.

In-vivo detectie van eiwit-eiwit interacties op de Micro-oppervlakken met een patroon

Enkel molecuul microscopie Approach die nieuwe inzichten naar nucleaire transport.

Single-molecule beeldvorming van de nucleaire transporten

This video demonstrates localized surface plasmon resonance imaging to detect protein secretions from a single cell. Using a microfluidic setup and a peptide-bound plasmonic nanostructure chip, changes in reflected light intensity at the resonance angle reveal interactions with secreted proteins from a single cell.

Localized Surface Plasmon Resonance Imaging to Detect Protein Secretions from a Single Cell

Intercellulaire communicatie kritisch om diverse fysiologische activiteiten binnen en buiten de cel. Dit document beschrijft een protocol voor het meten van de ruimtelijke en temporele karakter van enkele cel afscheidingen. Om dit te bereiken, is een multidisciplinaire aanpak waarin label-free nanoplasmonic sensing met live-cell imaging integreert.

A-Label gratis Techniek voor de ruimte en tijd Imaging van Single Cell afscheiding

Hier wordt de bereiding van eiwit-gefunctionaliseerde planaire glas-ondersteunde lipide bilayers, de bepaling van eiwitmobiliteit binnen en de meting van eiwitdichtheden getoond. Een routekaart voor het bouwen van een ruisonderdrukte Total Internal Reflection microscoop wordt geschetst, die het mogelijk maakt om enkele bilayer-residente fluorochromen met hoge ruimtelijk-temporele resolutie te visualiseren.

Single Molecule Fluorescentie Microscopie op Ondersteunde Planar dubbellagen

PI (4,5) P2 regelt diverse cellulaire functies, maar de nanoschaal organisatie in de cel plasmamembraan wordt slecht begrepen. Etikettering PI (4,5) P2 met een dubbele-color fluorescent probe gefuseerd met het Pleckstrin homologie domein beschrijven we een nieuwe benadering voor het bestuderen PI (4,5) P2 ruimtelijke verdeling in het plasmamembraan op nanometerschaal .

Single-molecule Super-resolutie beeldvorming van fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat in het plasmamembraan met Novel Fluorescerende Probes

Hier presenteren we een protocol voor Multi-Color lokalisatie van één membraaneiwitten in organellen van levende cellen. Als u wilt koppelen fluorophores, worden zelf labeling eiwitten gebruikt. Eiwitten, gelegen in verschillende membranen compartimenten van de dezelfde organel, kunnen worden gelokaliseerd met een nauwkeurigheid van ~ 18 nm.

Multi-Color lokalisatie microscopie van één membraaneiwitten in organellen van de cellen van levende zoogdieren

Van veel intrinsiek ongeordende eiwitten is aangetoond dat ze deelnemen aan de vorming van zeer dynamische biomoleculaire condensaten, een gedrag dat belangrijk is voor tal van cellulaire processen. Hier presenteren we een op beeldvorming gebaseerde methode met één molecuul voor het kwantificeren van de dynamiek waarmee eiwitten met elkaar interageren in biomoleculaire condensaten in levende cellen.

Meting van de dynamiek van eiwitinteracties in biomoleculaire condensaten

AviTag-specifieke locatie-beperkte verlichtingsversterkte biotinylatie (ALIBi) is een nieuwe optogenetisch geactiveerde methode ontwikkeld voor het labelen en affiniteitszuiveren van subcellulaire populaties van ribosomen voor downstream sequencing en proteomische analyse.

Isolatie van subcellulaire ribosoomsubpopulaties op basis van recombinante peptide-tag-specifieke locatie-beperkte verlichtingsversterkte biotinylering

Dit artikel geeft een gedetailleerde beschrijving van hoe monsters te maken voor single-eiwittracking in solid-supported lipid bilayers. Het verklaart ook een eenvoudige fluorescentiemicroscoop met enkelvoudige moleculegevoeligheid en een hoge framerate. Tot slot beschrijven we de procedure voor het extraheren van single-protein trajecten.

Tracking van enkele eiwitten in lipide-dubbellagen met behulp van fluorescentiemicroscopie

Dit protocol beschrijft single-antibody labeling (SAL) om de nanoschaal ruimtelijke organisatie van plasmamembraaneiwitten op te lossen. Door cumulatieve antilichaam-epitoopinteracties op het niveau van één molecuul te benutten, brengt membraan SAL (mSAL) lokale epitoopverdelingen in kaart terwijl het tegelijkertijd het bindingsgedrag van antilichamen in de natuurlijke cellulaire omgeving vastlegt.

Single-molecule localisatiemicroscopie van membraaneiwitten met single-antibody labeling

Leer label-free detectie van enkele eiwitten uitgescheiden door levende cellen via iSCAT-microscopie. Deze methode maakt real-time observatie van biologische processen op moleculair niveau mogelijk zonder fluorescentielabels.

Label-Free Imaging van één eiwitten uitgescheiden door levende cellen via iSCAT microscopie

Meer video's verkennen