Visualisatie in real time en analyse van chondrocyten letsel als gevolg van mechanische belasting in volledig Intact lymfkliertest kraakbeen explantaten

Deze methode maakt het mogelijk om de effecten van verschillende mechanische belastingregimes, omgevingsomstandigheden of stadia van kraakbeendegeneratie op de kwetsbaarheid van articulaire chondrocyten in situ te onderzoeken. De fysieke krachten. In tegenstelling tot andere technieken worden deze metingen in real time en in volledig intact kraakbeen uitgevoerd zonder afbreuk te doen aan de oorspronkelijke randvoorwaarden.

Een ander voordeel van deze techniek is het gebruik van een muis model, waardoor het testen van hoe specifieke genen invloed op de gevoeligheid van in situ chondrocyten in mechanische schade. Voor dissectie van het distale dijbeen, plaats de muis in de supine positie en maak een vijf millimeter huidincisie op het voorste gedeelte van de knie. Verleng de incisie helemaal rond de knie.

En trek de huid terug om het kniegewricht en de beenspieren bloot te leggen. Vanaf het proximale uiteinde van het dijbeen, gebruik een nummer elf scalpelblad om langs het bot in de distale richting te snijden. Positionering van het blad tussen de quadriceps spierpees eenheid en de voorste kant van de dijbeen schacht.

Verleng de incisie langs de knieschijf. Snijden door het midden van de patellar pees om de quadriceps spierpees eenheid te verwijderen. Vervolgens, vanaf het proximale uiteinde van het dijbeen, plaats het scalpelblad tussen de hamstringspierpeeseenheid en de achterste kant van de dijbeenschacht en snijd het langs het bot in de distale richting.

Wanneer de incisie nadert het kniegewricht, snijd door het zachte weefsel, en afwerking van de snede langs het kniegewricht. Trek de quadriceps en hamstringspieren terug om het dijbeen bloot te leggen. En snijd elke overtollige spier weg aan de zijkanten en mediale kanten van het bot.

Snijd de kuitspier aan de achterste kant van het proximale scheenbeen. En draai het been om de achterste kant van het dijbeen te visualiseren. Verwijder het overtollige weefsel rond het kniegewricht om de distale condyles van het dijbeen en het achterste oppervlak van het proximale scheenbeen bloot te leggen.

Snijd de voorste en achterste kruisbanden uit de buurt van de dijbeencondyles. En trek het scheenbeen uit de buurt van het dijbeen, het snijden van alle ligamenten om het onderbeen te scheiden van het dijbeen. Met behulp van standaard dissectie schaar, snijd door het dijbeen aan het proximale uiteinde van het bot ongeveer acht millimeter boven de tibiofemorele gewricht van de zijkant.

En gebruik de tang van de juwelier om de omliggende zachte weefsels uit het dijbeen te verwijderen. Stel vervolgens het kraakbeen bloot aan beide condyles aan het distale uiteinde van het dijbeen. Hydrateer het gewrichtsoppervlak periodiek met HBSS.

Voor dissectie van het opperarmbeen, plaats de muis in de supine positie. En gebruik micro schaar om een vijf millimeter incisie te maken op de achterste kant van de elleboog. Uitbreiding van de incisie rond de elleboog en het terugtrekken van de huid om de spieren bloot op de arm en schouder.

Vanaf het proximale uiteinde van het opperarmbeen, plaats het blad van een nummer elf scalpel tussen de triceps spierpeeseenheid en de achterste kant van het opperarmbeen. En snijd langs het bot in de distale richting. Breid de incisie naar het distale uiteinde van het opperarmbeen, door de tricepspees en trek de triceps terug naar het proximale uiteinde van het opperarmbeen totdat het opperhoofd wordt blootgesteld.

Snijd het bindweefsel rond het opperhoofd zonder het gewrichtsoppervlak aan te raken. En verwijder de ledemaat uit het lichaam. Hydrateer het gewrichtsoppervlak van de humerale kop met HBSS.

Om het opperarmbeen los te koppelen van de arm, gebruik tangen af te breken het proximale uiteinde van de ellepijp aan de achterste kant van de arm. En snijd het bindweefsel rond het distale uiteinde van het opperarmbeen, het verwijderen van overtollig weefsel op het bot. Gebruik vervolgens standaard ontleden schaar om de deltoid tuberositeit te verwijderen op de achterste kant van het opperarmbeen.

En plaats het ontleed exemplaar in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis met HBSS. Voor Calcein AM kleuring van de monsters, breng de botten in een 1,5 milliliter microcentrifuge buis met 500 microliter van 10,05 micro molaire Calcein in HBSS. En plaats de buis in een thermomixer op 37 graden Celsius bij 800 rpm, beschermd tegen licht.

Na dertig minuten, was het exemplaar in verse HBSS gedurende tien minuten. En breng het monster over op de glazen schuif van een aangepaste microscoop gemonteerde mechanische testinrichting, zodanig dat het articulaire oppervlak van de achterste femorale condyles of de humerale kop op het glas zit. Hydrateer het monster met HBSS en plaats het apparaat met het monster op een fluorescentiemicroscoopstadium.

Beeld de articulaire chondrocyten gekleurd met Calcein AM vóór de belasting toepassing onder een 4x vergroting. Pas de acquisitie-instellingen aan om de beeldkwaliteit te optimaliseren. Houd een voorgeschreven statische belasting bovenop het monster dat het gewrichtskraakbeen gedurende vijf minuten tegen het afdekglas wordt gecomprimeerd voordat u de belasting verwijdert.

Om een schokmechanische belasting toe te passen, laat een cilindrische botslichaam van bekend gewicht op het monster van een voorgeschreven hoogte, het vrijgeven van de belasting vijf seconden na de botsing. Onmiddellijk nadat een van beide ladingen is verwijderd, incubeert u het monster in vers bereide 60 micro-molaire propridiumjodide in één milliliter HBSS. Gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, dan re-beeld van de articulaire chondrocyten door fluorescentie microscopie zoals net aangetoond.

Om het gebied van gewonde en dode cellen als gevolg van het toegepaste mechanische belastingregime te kwantificeren, opent u eerst de micrografen van het gewrichtsoppervlak dat voor en na toepassing van mechanische belasting in ImageJ is verworven. Combineer de afbeeldingen in een stapel. Stel de schaal van de afbeeldingen in op basis van de beeldresolutie.

Definieer vervolgens het gebied waar de cellen Calcein negatief en PI-positief werden. Deze cellen worden beschouwd als gewond of dood. Bepaal vervolgens het gebied van gewonde dode cellen met behulp van het meetinstrument.

Ten minste zes getest toegepast de lading protocollen reproduceerbaar geïnduceerde kwantificeerbare gebieden van celletsel in femorale en humerale kraakbeen verkregen uit acht tot tien weken oude klep C muizen. In alle geteste laadprotocollen verergerden hogere belastings grootheden en hogere impactintensiteiten de ruimtelijke omvang van celletsel bij zowel femurs als humeri aanzienlijk. Tijdens het uitvoeren van de dissecties is het belangrijk om te onthouden niet in contact met het gewrichtskraakbeen met de chirurgische instrumenten, omdat dit de uitgangswaarde kan compromitteren door het vermogen van de monsters.

Het gebruik van dit spiegelmodel kan onderzoek bij artrose vergemakkelijken, omdat de ziekte gemakkelijk wordt veroorzaakt bij muizen door genetische, dieet- of chirurgische manipulaties. Ons platform biedt ook een hulpmiddel voor het ondervragen van fundamentele wetenschappelijke vragen en voor het screenen van therapeutische interventies gericht op de mechanische kwetsbaarheid van chondrocyten.