Name: High-throughput meting van darm transittijd met behulp van larvale zebravis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Leer een high-throughput methode om darmtransittijd te meten bij larven van Danio rerio met fluorescerend gelabeld voedsel. Deze techniek vervangt traditionele microscopie en versnelt onderzoek naar gastro-intestinale biologie en geneesmiddelwerking.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Simon Cassar van carpetbones.com ontworpen en gemaakt in de geanimeerde afbeelding gebruikt om aan te tonen van de procedure in het leven van de GI transit assay.

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van AbbVie.Abbvie opereert onder de nationale instituten van gezondheid gids voor zorg en gebruik van proefdieren in een faciliteit geaccrediteerd door de Association for de beoordeling en de accreditatie van proefdier zorg (AAALAC). Geen veterinairrechtelijke zorgen werden waargenomen in deze studies.
1. het kweken van volwassen zebravis en het verzamelen van de embryo's
<ol><li>Huis en RAS volwassen zebrafish met behulp van algemene fokkerij en fokken van praktijken. Bijvoorbeeld, zie Westerfield10.</li>
	<li>Bereiden van embryo medium door ontbinding gedehydrateerde zeezout (Zie Tabel van materialen) met gedeïoniseerd water met een concentratie van 60 mg/L.</li>
	<li>Verzamel bevruchte eieren uit de volwassen fokken zaal, spoel goed met embryo medium en huis van embryo's in ongeveer 50 mL voor embryo medium in petrischalen 10 cm (50 embryo's per schotel) bij 28 ± 1 ° C op een 14:10 h licht: donker cyclus.</li>
	<li>Verwijderen niet-overlevende embryo's na 24 h en supplement met embryo's overleven, zodat elk gerecht 50 embryo's per schotel bevat.</li>
</ol>2. het trainen van larven te voeden met behulp van niet-gekleurd voedsel
<ol><li>Op de 4th dag na bevruchting (4 dpf), de larven te voeden in elke petrischaal 2 mg poeder larvale vis eten (Zie Tabel van materialen) door de beregening van het voedsel op de top van het water.</li>
	<li>De larven kunnen 3-4 h te voeden en ze vervolgens overbrengen naar een schoon (geen voedsel) Petri schotel met ongeveer 50 mL verse embryo medium.<ol>
<li>Om te helpen bij de overdracht als weinig voedsel mogelijk, spoel elke larve in een petrischaal met ongeveer 50 mL verse embryo medium voordat de definitieve overdracht aan de nieuwe schotel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herhaal voederen en spoelen van de larven op 5 dpf en 6 dpf.</li>
</ol>3. voorbereiding van de fluorescerende levensmiddelen op de 6 dpf en diervoeders tot larven op de 7 dpf
<ol><li>Bereiden van voedsel met een fluorescerende label (hierna te noemen fluorescerende voedsel, volgens de methoden van veld et al. 3). kort mengen 300 µL van TL label (Zie Tabel of Materials), 100 ÂµL van gedeïoniseerd water en 200 mg poeder larvale voedsel op een horlogeglas van 10 cm.</li>
	<li>Verspreid de resulterende plakken in een dunne laag op het horlogeglas. Laat de lijm drogen bij kamertemperatuur in het donker voor > 8 h.</li>
	<li>Schraap de gedroogde mengsel uit het horlogeglas, crush poeder en bewaren bij kamertemperatuur in het donker. De fluorescerende voedsel is nu klaar om te worden toegediend aan de larven.</li>
	<li>Op de 7 dpf, feed van het fluorescerende voedsel naar larven op dezelfde wijze als gedaan voor vorige voedingen, die is voorzien in 2 mg fluorescerende voedsel per schotel (Zie stappen 2.1 – 2.2.1). Opmerking: Zorg ervoor dat het voedsel fijn grond tot een poeder is. Wrijven fluorescerende voedsel dat is verpakt in papier tussen duim en wijsvinger wegen is een handige methode om fijn grond eten.</li>
</ol>4. bereid geconcentreerde dosering oplossingen van Test verbindingen
<ol><li>Los elke teststof op embryo middellange tot een concentratie die is 2 x de dosis van de doelgroep. Als u wilt testen van een dosisbereik, bereiden meerdere geconcentreerde dosering oplossingen van de juiste concentraties voor de gewenste doses.</li>
	<li>Bereiden genoeg van elke geconcentreerde dosering oplossing zodat 24 larven kunnen worden behandeld. Elke larve vergt 100 µL dosering oplossing (het eindvolume per putje is 200 µL), dus op de minst dosis van 2,4 mL oplossing nodig is voor elke behandelde groep; 2,5 mL zou een passende omvang.</li>
	<li>Als een oplosmiddel (dat wil zeggen, dimethylsulfoxide) werd gebruikt voor de eerste solubilizing van de teststof, bereiden de juiste voertuig controle dosis (dat wil zeggen, dezelfde hoeveelheid oplosmiddel als de samengestelde behandeling maar dan zonder de compound). En, zoals ook is gebeurd voor elke samengestelde-testgroep, bereid genoeg voertuig-oplossing voor de behandeling van 24 larven.</li>
</ol>5. overdracht larven een 96-wells-plaat en behandelingen toepassen
<ol><li>Nadat de larven hebben gekregen te voeden met fluorescerende voedsel voor 2 h, kunt een overdracht pipet verplaatsen naar een spoeldouche schotel, zoals ook is gebeurd na de voeding op voorafgaande dagen.</li>
	<li>Na elke larve is gespoeld, trekken samen met 100 µL embryo medium, en het verplaatsen in een putje van een 96-Wells polystyreen conische-multi goed bodemplaat (Zie Tabel of Materials), verstrekking van het volledige 100 µL embryo medium in de put met de larve.</li>
	<li>Zodra het vereiste aantal larven zijn overgedragen aan de 96-well-plate, voeg 100 µL van de 2 × geconcentreerd doseren oplossingen aan elk putje. Opmerking: Het gebruik van een 12-kanaals meerkanaalspipet vergemakkelijkt de snelle doseren van de larven (12-op-een-time). Om te voorkomen dat per ongeluk de verkeerde behandeling toevoegen, houd de gaten die larven hebben zijn gedoseerd met welke behandeling en wijzig uiteinden van de pipet tussen behandelingen.</li>
</ol>6. maatregel eerste en volgende fluorescentie van elk putje
<ol><li>Na het toevoegen van plaats de oplossingen van de dosis, de 96-well-plate in een spectrofotometer plaat staat spannend en opsporing van de emissies van het fluorescerende label. Opmerking: Voor de geel-groene label gebruikt (Zie de Tabel van materialen), de juiste golflengten van licht zijn spannend op 505 nm en opsporen op 515 nm.</li>
	<li>De fluorescentie van de 96-well-plate van de bodem 5 keer in de onmiddellijke opvolging leest zonder schudden van de plaat. De minimumwaarde van de 5 lezingen uit elk putje als de eerste fluorescentie uit de put gebruiken. Opmerking: De reden dat 5 lezingen worden genomen wanneer de plaat wordt gelezen is dat larven soms in het pad van het licht excitatie zwemmen en het eten in hun darmen stoot een groot signaal dat niet representatief voor de vrijgegeven ontlasting. Inname van het minimum van de 5 leest kan helpen om te voorkomen dat met behulp van kunstmatig hoog metingen van VN-cabotageritten voedsel.</li>
	<li>Lees de fluorescentie van de 96-well-plate (zoals ook is gebeurd voor de eerste lezing) elke 20 minuten voor de eerste 2 uur na dosering, elke 30 min voor uren 3 en 4 na toediening, en klik vervolgens eenmaal elk uur urenlang 5, 6, 7 en 8 na toediening.<ol>
<li>Neem voorzichtigheid op niet storen (door schudden van de 96-well-plate) verrekend fecale materie tussen leest en Incubeer de larven bij 28 ± 1 ° C tussen leest.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubeer de larven dan 's nachts bij 28 ± 1 ° C en de fluorescentie van de 96-well-plate leest de volgende ochtend rond dezelfde tijd dat de larven eergisteren werden toegediend. Gebruik deze meting als de 24 h na dosis fluorescentie.</li>
</ol>7. het analyseren van de gegevens
Opmerking: Hier berekenen wij accumulatie per putje en groep gemiddelden voor elk punt van de tijd.
<ol><li>Als u wilt berekenen accumulatie per putje, met behulp van slechts minimale waarden van elk van de 5 leest, aftrekken de beginwaarde van de puntenwaarde van elke keer. Deze berekening uitvoeren voor de beginwaarde evenals (dit resulteert in een initiële accumulatie van nul voor elk putje).<ol>
<li>Als de accumulatie in een put op het tijdstip van de 24 h minder dan 150 relatieve fluorescerende eenheden is, uitsluiten dat goed verdere analyse; Deze lage waarden zijn waarschijnlijk als gevolg van lage of geen inname van het fluorescerende voedsel door de larven tijdens het voeden, en die larven zijn dus niet goed onderwerpen voor het meten van de transittijd.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voor elk punt van de tijd, de gemiddelde accumulatie voor putten met mede behandelde larven, alsmede de standaardfout van deze gemiddelden te berekenen.</li>
	<li>De gemiddelde accumulatie op de y-as ten opzichte van de tijd op de x-as voor alle behandelde groepen uitzetten en vergelijken van de oppervlakten die curven (AUCs). Opmerking: Behandelingen die aanzienlijk vertragen of versnellen transittijd zal hebben AUCs aanzienlijk kleiner of groter, respectievelijk, dan de voertuig-testgroep.</li>
</ol>

<ol><li>Berghmans, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+based+assays+for+the+assessment+of+cardiac%2C+visual%2C+and+gut+function+-+Potential+safety+screens+for+early+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Zebrafish based assays for the assessment of cardiac, visual, and gut function - Potential safety screens for early drug discovery.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 58 (1), 59-68 (2008).</li>
<li>Field, H. A., Kelley, K. A., Martell, L., Goldstein, A. M., Serluca, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gastrointestinal+physiology+using+a+novel+intestinal+transit+assay+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterology+and+Motility%22%5BJournal%5D)">Analysis of gastrointestinal physiology using a novel intestinal transit assay in zebrafish.</a> Neurogastroenterology and Motility. 21, 304-312 (2009).</li>
<li>Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S., Paule, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+model+in+drug+safety+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Zebrafish model in drug safety assessment.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496, 498-503 (2013).</li>
<li>Shepherd, I., Eisen, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21550442">Development of the zebrafish enteric nervous system.</a> Methods in Cell Biology. 101, 143-160 (2011).</li>
<li>Holmberg, A., Olsson, C., Holmgren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+endogenous+and+exogenous+nitric+oxide+on+gut+motility+in+zebrafish+Danio+rerio+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The effects of endogenous and exogenous nitric oxide on gut motility in zebrafish Danio rerio embryos and larvae.</a> The Journal of Experimental Biology. 209, 2472-2479 (2006).</li>
<li>Olsson, C., Holmber, A., Holmgren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+enteric+and+vagal+innervation+of+the+zebrafish+%28Danio+rerio%29+gut%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Development of enteric and vagal innervation of the zebrafish (Danio rerio) gut.</a> The Journal of Comparative Neurology. 508, 756-770 (2008).</li>
<li>Fleming, A., Jankowski, J., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+gut+function+and+disease+changes+in+a+zebrafish+larvae+model+of+inflammatory+bowel+disease%3A+A+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Disease%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of gut function and disease changes in a zebrafish larvae model of inflammatory bowel disease: A feasibility study.</a> Inflammatory Bowel Disease. 16 (7), 1162-1172 (2010).</li>
<li>Cook, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+learned+from+the+fate+of+AstraZeneca%27s+drug+pipeline%3A+A+five-dimensional+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Lessons learned from the fate of AstraZeneca's drug pipeline: A five-dimensional framework.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 419-431 (2014).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book.+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+Rerio%29%22">The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio)</a>. , University of Oregon Press. Eugene, OR, USA. (2000).</li>
<li>Cassar, S., Huang, X., Cole, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+predicting+drug+effects+on+gut+transit+time+using+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacolical+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for predicting drug effects on gut transit time using larval zebrafish.</a> Journal of Pharmacolical and Toxicological Methods. 76, 72-75 (2015).</li>
<li>McKim, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+tiered+approach+to+in+vitro+predictive+toxicity+screening%3A+A+focus+on+assays+with+in+vivo+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Combinatorial+Chemistry+and+High+Throughput+Screening%22%5BJournal%5D)">Building a tiered approach to in vitro predictive toxicity screening: A focus on assays with in vivo relevance.</a> Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 13 (2), 188-206 (2010).</li>
<li>Bruni, G., Lakhani, P., Kokel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+novel+neuroactive+drugs+through+high-throughput+behavior-based+chemical+screening+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Discovering novel neuroactive drugs through high-throughput behavior-based chemical screening in the zebrafish.</a> Frontiers in Pharmacology. 5, 153(2014).</li>
<li>Mandrell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+zebrafish+chorion+removal+and+single+embryo+placement%3A+optimizing+throughput+of+zebrafish+developmental+toxicity+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens.</a> Journal of Laboratory Automation. 17, 66-74 (2012).</li>
</ol>

Ontwerp, studie gedrag, en financiële steun voor dit onderzoek werden verstrekt door AbbVie. AbbVie deelgenomen aan de interpretatie van gegevens, beoordeling en goedkeuring van het manuscript. S. Cassar, X. Huang en T. Cole zijn werknemers van AbbVie en hebben geen extra conflicten van belang om te vermelden.

De roman spectrofotometrie methode voor het meten van de zebravis larven GI transittijd, hier gepresenteerd is een efficiënte test die behandeling effecten op zoogdieren GI-functie kan voorspellen. Hoewel de bepaling lage gevoeligheid heeft, heeft hoge positieve predictief, die aanvaardbaar is voor de eerste fase testen werkzaam voor het aantal kandidaat-behandelingen op basis van toxiciteit12schil. Deze methode is gemakkelijker uit te voeren, heeft een hogere doorvoersnelheid, en gebruikt minder stappen dan fluorescent microscopie hanteren dier.
Er zijn technische problemen die inherent zijn aan deze methode. Het vangen van individuele larven nadat de fluorescerende voedsel voeden en hen overbrengen naar individuele wells is uitdagend aanvankelijk. Echter, met de praktijk een geschoolde technicus kan vullen een 96-wells-plaat in minder dan 15 min. Als er op een gegeven tijdstip, is de plaat per ongeluk geschud en de fecale materie onrustig vanaf de onderkant van de putten vóór lezing, verschijnt de accumulatie te verminderen. Dit kan vermeden worden door het verplaatsen van de plate(s) zorgvuldig, zonder schudden. In onze ervaring, deed de normale beweging, waaronder die van de plaat spectrofotometer gemotoriseerde lade, de bepaling niet storen. Plaat lezers uitgerust met een verwarmingselement (dat wil zeggen, de plaat hoeft niet te worden teruggegeven aan incubator tussen metingen), en gelegen in de buurt van de test lab Bank kan optimaliseren voor lagere kans op verstoring, maar dit was niet nodig in onze ervaring.
Vroege pogingen om de methode bevatte geen voeding op de dagen voorafgaande aan de test. Zonder deze 'praktijk' voedingen verbruikt lager aantal larven voldoende TL voedsel tijdens de termijn voor toepassing van de behandeling. In deze pogingen, variatie binnen behandelgroepen was groter en meer gegevens was onbruikbaar als gevolg van lage/geen signaal accumulatie na verloop van tijd. Zelfs met het praktijk voeden, sommige larven niet voldoende hoeveelheden van het fluorescerende voedsel consumeren, met uitzondering van gegevens uit deze larven vermindert variatie binnen groepen en verhoogt het vermogen behandeling effecten te kunnen identificeren. Beginnen met grotere maten van de groep (dat wil zeggen, 24 versus 12) voorziet in voldoende aantal larven bij te dragen nuttige gegevens voor de analyse.
De fluorescentie microscopie blijkt dat voedsel transit bijna voltooid door 24 h in atropine-behandelde larven (niet afgebeeld), was echter de microplate-gegevens vanaf het punt van de laatste tijd lagere laatste signaal in de groep van atropine weerspiegelen, in vergelijking met voertuig groep. Omgekeerd, hogere definitieve microplate fluorescentie werd geassocieerd met behandelingen die transittijd versnelde, hoewel de larven voertuig-behandeld hebben blijkbaar hun GI tract vóór de punt van de laatste keer afgezegd. Op basis van de willekeurige toewijzing aan behandeling van larven fluorescerende voedsel gevoed, veronderstellen wij gelijk verbruik van het fluorescerende eten, gemiddeld onder behandelgroepen. Gezien dit, en gebaseerd op de hierboven beschreven patronen, fluorescentie van fecale materie neemt af met de tijd doorgebracht in het larvale GI darmstelsel of snellere doorvoer wordt toegevoegd fluorescentie aan de ontlasting een of andere manier. De werkelijke oorzaak is onbekend en niet heeft is ondervraagd, maar nog steeds de bepaling is in staat om meten en vergelijken van transittijd onder groepen.
De werkgelegenheid van deze methode voor het opsporen van de toxische effecten van de GI van klein molecuul verbindingen is één toepassing. Andere mogelijke toepassingen zijn ziekte modellering (b.v., Prikkelbare darmsyndroom) en roman therapie ontdekking voor dergelijke ziekten, of voor het ontdekken van pro-kinetische verbindingen. Bovendien kan gekoppeld aan transgene modellen, deze methode worden gebruikt om te ondervragen van de rol van genen in normale GI doorvoer, evenals transit aandoeningen, waaronder darmen neuron-deficiëntie. De larve van de zebravis biedt een hele organisme platform op een schaal die die benadert van het kweken van de cel, maar aangezien er meerdere weefsels en talloze celtypes werking samen in de zebravis, systemen biologie vragen kunnen worden gesteld en beantwoord met behulp van deze model.
Met de vooruitgang in technologie en nieuwe toepassingen ervan, zal efficiëntie bij de uitvoering van de zebravis toxiciteitstesten blijven verbeteren. Larvale zebrafish behandeling methoden en vitrotests blijven verbeteren in termen van hogere doorvoer13,14. De nieuwe methode gepresenteerd hier is een voorbeeld van een verbetering die zebrafish studies meer impactful kan maken.

Zebrafish (Danio rerio) worden gebruikt voor model gewervelde biologie en voorspellen van drug toxiciteit en/of werkzaamheid; nieuwe toepassingen in deze velden komen elk jaar. De voordelen van zebravis over zoogdieren modellen zijn hun vruchtbaarheid, kleine grootte en transparantie door middel van de organogenese. Zebravis worden gebruikt om te voorspellen drug kandidaat-acute toxiciteit, alsmede evalueren van samengestelde impact op orgaanfunctie, bijvoorbeeld cardiale, oogbeschadigingen en/of, gastro-intestinale (GI)1,2. Zebravis ontwikkeling en fysiologie zijn vergelijkbaar met die van zoogdieren in vele manieren3 en 80% van de genen die gekoppeld aan ziekten bij de mens zijn hebben een zebravis homolog4.
Het darmstelsel van de GI van zebravis heeft soortgelijke fysiologie aan de zoogdieren GI tractus maar heeft een eenvoudiger het platform5. Zebravis hebben geen maag; de voorste intestinale lamp fungeert als een voedsel-depot. Genexpressie in zebrafish darm heeft veel overeenkomsten met die van de zoogdier-5. Zoals zoogdieren, de darmen zenuwstelsel van zebravis besturingselementen de beweeglijkheid van de darm en intestinale innervatie arm komt overeen met die van andere gewervelde dieren6,7. Op basis van deze overeenkomsten, functiestoornissen van de menselijke darm grondig zijn bestudeerd zebrafish, met behulp van de methoden die zijn afgeleid van zoogdieren modellen8.
GI intolerantie tijdens klinische testen van drugkandidaten is gebruikelijk en kan een ernstige bedreiging voor de menselijke gezondheid. Een overzicht van programma's in een groot farmaceutisch bedrijf tijdens 2005 – 2010 onthuld GI veiligheid als de belangrijkste oorzaak voor 9% van de klinische studie opzeggingen9. GI-toxiciteitstests in preklinische zoogdieren modellen kunnen duur zijn in termen van tijd, samengestelde en arbeid. Een voorspellende high-throughput assay voor GI doorvoer kan bieden flexibiliteit samengestelde toxiciteit, en leveren van 3V effect. Een nieuwe methode voor het aanbieden van een dergelijke bepaling wordt gepresenteerd door het protocol hierin beschreven. Dit high-throughput assay kon worden ingezet in het begin van geneesmiddelenontwikkeling te prioriteren van kandidaten, en bijdragen tot de vermindering van de veiligheid van de GI testen in grotere soorten.

<table><tbody><tr><td>Wild type zebrafish broedpaar</td><td>Verschillende bronnen - bijvoorbeeld ZIRC (Zebrafish International Resource Center)</td><td>ZL-1</td><td>Volwassen wild type zebrafish van de AB-lijn</td></tr><tr><td>1.7 L Broedtank - Beach Style Design</td><td>Tecniplast</td><td>1.7L SLOPED</td><td>Broedtank</td></tr><tr><td>Instant Ocean zee-zout</td><td>Intant Ocean</td><td>SS15-10</td><td>Gedehydrateerd zee-zout</td></tr><tr><td>First Bites larfvoer</td><td>Hikari</td><td>20095</td><td>Poedervormig larfvoer</td></tr><tr><td>Geel-groene (505/515) Fluospheres</td><td>Invitrogen</td><td>F8827</td><td>Fluorescent label</td></tr><tr><td>V-vormige 96-wells polystyreen microplaat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>249570</td><td>Multiwell microplaat met V-vormige bodem in elke well</td></tr><tr><td>Atropine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0132</td><td></td></tr><tr><td>Amitriptyline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8404</td><td></td></tr><tr><td>Tegaserod</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SML1504</td><td></td></tr><tr><td>Metoclopramide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0763</td><td></td></tr><tr><td>Erythromycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5389</td><td></td></tr><tr><td>Spectramax M2e microplaat lezer</td><td>Molecular Devices</td><td>Spectramax M2e</td><td>Een multi-well plate spectrofotometer die in staat is tot fluorescente excitatie en emissiedetectie.</td></tr><tr><td>SoftMax Pro</td><td>Molecular Devices</td><td>SoftMax Pro</td><td>Software voor spectrofotometer data-acquisitie</td></tr></tbody></table>

high-throughput meting van darm transittijd met behulp van larvale zebravis

High-throughput Measurement of Gut Transit Time Using Larval Zebrafish

Zebravis worden gebruikt als alternatieve modelorganismen voor het testen van de veiligheid van de drug. Het maag-darmkanaal (GI) van de zebravis heeft genetische, neuronale en farmacologische overeenkomsten met die van de zoogdieren. GI intolerantie tijdens klinische testen van drugkandidaten is gebruikelijk en kan een ernstige bedreiging voor de menselijke gezondheid. GI-toxiciteitstests in preklinische zoogdieren modellen kunnen duur zijn in termen van tijd, teststof en arbeid. De methode van de high-throughput hier gepresenteerd kan worden gebruikt om te voorspellen GI veiligheidskwesties. Ten opzichte van zoogdieren modellen, zorgt deze methode voor meer doelmatige beoordeling van de samengestelde gevolgen test voor GI transit tijdens het gebruik van kleine hoeveelheden van stof. Bij deze methode wordt de larvale zebrafish (7 dagen post bevruchting) levensmiddelen die bevatten een fluorescerend label worden gevoed. Na het voederen van dieren, is elke larvale vissen geplaatst in een putje van een plaat met 96-conische-bodem-goed en gedoseerd met teststof (opgelost in water) of het voertuig. Gut doorvoer treedt op, ontlasting hoopt zich op de bodem van de putten en de prijs waartegen dit gebeurt wordt gecontroleerd door het meten van de fluorescentie van de bodem van de put herhaaldelijk in de tijd met behulp van een plaat spectrofotometer. De fluorescentie van larven in een groep gegeven behandeling zijn gemiddeld en deze waarden zijn opgenomen in een grafiek samen met de standaardfout, voor elke meting keer, een gemiddelde doorvoer van levensmiddelen die na verloop van tijd curve oplevert. Effecten op de darm transittijd worden geïdentificeerd door het oppervlak onder de kromme voor elke groep van de behandeling met die van de voertuig-testgroep vergelijken. Deze methode wijzigingen gedetecteerd in zebrafish GI transittijd geïnduceerd door drugs met bekende klinische GI effecten; het kan worden gebruikt om te ondervragen tientallen behandelingen voor GI effecten per dag. Als zodanig, kunnen veiliger stoffen worden snel geprioriteerd voor het testen van de zoogdieren, die ontdekking en bieden 3V vooruitgang versnelt.

Deze methode, die plaat gebaseerde spectrofotometrie gebruikt te beoordelen GI doorvoer, kan worden gebruikt als een vervanging van de high-throughput van fluorescent microscopie, die is een lagere doorvoer-methode voor de beoordeling van de dezelfde functie (Figuur 1). Voor het genereren van de gegevens in Figuur 1, identiek behandelde vis werden geanalyseerd voor GI doorgang met behulp van fluorescentie microscopie (representatieve afbeeldingen wordt weergegeven) of spectrofotometrie op 4 punten van de tijd, 0, 4, 8 en 24 uur na toediening; vergelijking van de gegevens van die experimenten gaf sterk gecorreleerde resultaten (lineaire regressie van gegevens r2 = 0.95). De lineaire regressie heeft een negatieve helling omdat microscopie het ingehouden fluorescentie-signaal maatregelen en spectrofotometrie het cabotageritten signaal.
De effecten van stoffen met uiteenlopende mechanismen, met gevestigde GI activiteit bij de mens, kunnen worden opgespoord in zebrafish met behulp van de spectrofotometrie assay (Figuur 2). Vergeleken met de voertuig-behandelde controles, atropine (4.2 µM) en amitriptyline (5 µM) vertraagd GI doorvoer, terwijl tegaserod (3.3 µM) en metoclopramide (33 µM) versneld transittijd. Erytromycine (14 µM), transittijd een versnelling verwacht had geen effect gemeten volgens deze methode. Behandeling groep maten waren 24 voordat verwijderen gegevens uit larven met geen of zeer lage signaal. De AUC voor de gemiddelde signaal per tijdstip werd vergeleken tussen stof-behandeld en voertuig-behandelde groepen met behulp van Tukey van eerlijk Significant verschil voor type-1-foutcontrole inschakelt. Effecten werden beschouwd als belangrijke alleen wanneer p ≤ 0,05. De concentraties gebruikt voor de bovenstaande behandelingen waren de maximale doseringen getolereerd, bepaald in een voorafgaande experiment en gedefinieerd als de hoogste dosis waarbij geen waarneembare schadelijk effect door bruto observatie.
De bepaling van de Spectrofotometrie kan meten dosis-afhankelijke effecten van verbindingen. Figuur 3 bevat gegevens die aantonen dat atropine GI transit dosis-dependently in zebrafish larven vertraagt. De laagste dosis van atropine getest, 0.042 µM, hadden geen significant effect, terwijl de twee hogere concentraties had aanzienlijke invloed, 0.42 µM met minder van een effect dan 4.2 µM.
Een nieuwe bepaling kan worden beoordeeld door het testen van positieve en negatieve controles, dat wil zeggen verbindingen die bekend is dat ze actieve en inactieve respectievelijk in het target-systeem (in dit geval het target-systeem is de zoogdieren GI doorvoer). Voor de bepaling van de spectrofotometrie, werden 18 actieve (positief) en 6 inactief (negatieve) besturingselementen getest. De bepaling van de spectrofotometrie is gebaseerd op deze experimenten, en heeft een hoge positieve predictieve waarde (90,9%), maar de lage gevoeligheid (55,6%) en de negatief voorspellende waarde (38,5%). Deze waarden zijn afgeleid van de gegevens in tabel 1. Zij weerspiegelen, in de praktijk, dat als de zebravis transittijd is beïnvloed door een behandeling, zoogdieren transit dreigt te worden beïnvloed. Als er geen effect op de zebravis transittijd is, is dit echter niet voorspellende van zoogdieren effect.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58497/58497fig1.jpg"> Figuur 1: fluorescerende voedsel doorvoer wordt gedetecteerd als een verlies van signaal van microscopische beeldvorming en een bijbehorende winst in signaal door plaat gebaseerde spectrofotometrie. (A) representatieve microscopische beelden uit analyse van atropine (4.2 µM) effect op de GI transittijd. (B) gemiddelde signaal gekwantificeerd van microscopische beelden is zeer (negatief) gecorreleerd met signaal van vernietigde fecale materie (spectrofotometrie) van identiek behandelde vis. Gegevens van atropine-behandelde vis zijn in het rood. Deze figuur gekopieerd met toestemming van Cassar et al. 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58497/58497fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58497/58497fig2.jpg"> Figuur 2 : Analyseren van fluorescent signaal accumulatie na verloop van tijd van een multi goed plaat kunt identificatie van behandelingen die de snelheid van de doorvoer van de GI wijzigen. Sterretje (*) geeft aan afwijkt AUC dan voertuig-behandelde vis. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde signaal voor larven in de behandelde groep per tijdstip. Dit cijfer heeft opnieuw zijn gebruikt met toestemming van Cassar et al. 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58497/58497fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58497/58497fig3.jpg"> Figuur 3 : Atropine dosis-dependently vertraagt zebrafish darm transittijd, zoals blijkt uit fluorescerende spectrofotometrie van fecale accumulatie mettertijd. Sterretje (*) geeft aan afwijkt AUC dan voertuig-behandelde vis. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde signaal voor larven in de behandelde groep per tijdstip. Dit cijfer wordt hergebruikt met toestemming van Cassar et al. 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58497/58497fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/58497/58497table1.jpg"> Tabel 1: GI activiteit van 24 stoffen in zoogdieren en vissen. Deze tabel wordt gebruikt met toestemming van Cassar et al. 11.

Het doel van dit protocol is voor het meten van de transittijd van fluorescently geëtiketteerde voedsel door de darm van larvale zebrafish in een hoge doorvoersnelheid mode.

High-throughput meting van darm transittijd met behulp van larvale zebravis

Zebrafish are used as alternative model organisms for drug safety testing. The gastrointestinal (GI) tract of zebrafish has genetic, neuronal, and ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen met betrekking tot gastro-intestinale biologie, zoals hoe veranderingen in genexpressie of milieu-uitdagingen de darmfunctie veranderen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het minder tijd kost en gemakkelijker uit te voeren is dan traditionele methoden voor het meten van darmdoorvoer. Op de dag van de test worden larven gevoed met voedsel met een fluorescerend etiket, en als ze dat voedsel eten, zal het etiket zich ophopen in hun darmen.Na het voeden worden ze gespoeld, gescheiden van niet-opgegeten voedsel en wordt elke larve overgebracht naar een put van een meerputtend bord. De put heeft een kegelvormige bodem, zodat wanneer fecale materie wordt ongeldig verklaard, het valt in het midden van de put. Vergeet niet dat er veel larven in de multi-well plaat zitten die gelijktijdig kunnen worden gecontroleerd met behulp van een plaatspectrofotometer, die de hoeveelheid vervallen fecale materie meet.En naarmate er meer in de loop van de tijd wordt ongeldig verklaard, neemt het signaal dienovereenkomstig toe. Op deze manier hebben we een hoge doorvoermethode voor het meten van darmdoorvoer. Op de vierde dag na de bevruchting, strooi twee milligram poedervorm larve vis voedsel op de top van het water in elke petrischaal om de larven te voeden.Laat de larven vier uur te voeden. Breng na het voeden alle larven over op een grote spoelschaal met vers embryomedium. Met behulp van een 50 milliliter serologische pipet, voorzichtig vacuüm zo veel van de overgebleven voedsel mogelijk, voorzichtig niet om eventuele larven te vangen.Breng larven over naar een nieuw petrischaaltje met 50 milliliter vers embryomedium. Herhaal het voer-, spoel- en overdrachtsproces gedurende twee extra dagen. Op de zesde dag na de bevruchting, beginnen met de voorbereiding van de fluorescerende voedsel door het toevoegen van 200 milligram gedroogd voedsel aan een 10 centimeter horloge glas.Voeg 300 microliter fluorescerend etiket en 100 microliter gedeïsiseerd water toe en meng kort. Verdeel de resulterende pasta in een dunne laag op het horlogeglas en laat het minstens acht uur drogen bij kamertemperatuur, in het donker. Schraap hierna het gedroogde mengsel van het horlogeglas.Plet tot een poeder en bewaar het op kamertemperatuur, in het donker. Voer op de zevende dag na de bevruchting het fluorescerende voedsel aan de larven door er twee milligram van te besprenkelen bovenop het water in elke petrischaal. Laat de larven twee uur voeden.Bereid ondertussen de geconcentreerde doseeroplossingen voor door elke testverbinding in embryomedium op te lossen tot een concentratie die twee keer de doeldosis is met een eindvolume van ten minste 2,5 milliliter. Gebruik aan het einde van de voederperiode een transferpipet om ze naar een grote spoelschaal te verplaatsen. Spoel alle larven die eerder beschreven zijn met strenger stofzuigen.Het is belangrijk om zoveel mogelijk van de overgebleven fluorescerende voedsel te verwijderen tijdens de laatste spoeling om de mogelijkheid dat het per ongeluk wordt overgebracht naar de 96-put plaat te verminderen. Nadat elke larve is gespoeld, gebruikt u een pipet om het samen met 100 microliters embryomedium uit de spoelschaal te halen. Doe de larve en de gehele 100 microliter van medium in een put van een 96-bron polystyreen, conische bodem, multi-well plaat.Zodra alle larven zijn overgedragen, voeg 100 microliter van de voorbereide doseeroplossingen toe aan de juiste putten. Nadat alle doseeroplossingen zijn toegevoegd, laadt u de plaat in een plaatspectrofotometer. Meet de fluorescentie van de plaat vanaf de bodem, vijf keer achter elkaar, zonder de plaat te schudden.De laagste meting van elke put zal worden aangewezen als de eerste fluorescentie tijdens de data-analyse. Broed de plaat uit op ongeveer 28 graden Celsius. Herhaal het meetproces, het lezen van de fluorescentie om de 20 minuten voor de eerste twee uur na het doseren, en uitbroeden tussen leest.Meet de fluorescentie om de 30 minuten voor de derde en vierde uur na het doseren en maak vervolgens per uur metingen voor uren vijf tot acht. Broed de larven 's nachts uit op 28 graden Celsius. De volgende dag, lees de fluorescentie op 24 uur na het doseren.Dit protocol maakt gebruik van op plaat gebaseerde spectrofotometrie om GI-transit te beoordelen als een vervanging met hoge doorvoer voor fluorescerende microscopie. Representatieve resultaten die deze twee methoden vergelijken, worden gegenereerd door identiek behandelde vis te analyseren gedurende een periode van 24 uur na het doseren. Zoals hier te zien, zijn de resultaten sterk gecorreleerd, met een negatieve helling omdat microscopie het behouden fluorescentiesignaal meet en spectrofotometrie het uitgezonden signaal meet.Analyse van verbindingen met uiteenlopende mechanismen toont aan dat in vergelijking met voertuig behandelde controles, atropine en amitriptyline langzame GI doorvoer. Tegaserod en metoclopramide, aan de andere kant, worden gezien om de transittijd te versnellen. Erythromycine, die naar verwachting de transittijd zou versnellen op basis van de reactie van zoogdieren, heeft in plaats daarvan geen invloed op de transittijd van zebravissen.Verdere analyse toont aan dat atropine gi-doorvoer vertraagt, afhankelijke dosis, in zebravissenlarven. De laagste geteste dosis, 042 micromolar, had geen significant effect. Terwijl de twee hogere doses worden elk gezien om aanzienlijke impact hebben.Deze methode heeft vele toepassingen, met inbegrip van het opsporen van toxische GI effecten van drugs of kandidaat-geneesmiddelen, ziekte modellering, zoals prikkelbare darm syndroom, ontdekking van nieuwe therapieën voor dergelijke ziekten, evenals de ontdekking van pro-kinetische verbindingen.

high-throughput-measurement-of-gut-transit-time-using-larval-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Zebravis een krachtig gewervelde model dat is onder-gebruikt voor metabole studies. Hier beschrijven we een snelle manier om de te...

Metabole Profiel Analyse van zebravis embryo&#39;s

Wij presenteren een nieuwe methode voor microgavage van zebravislarven met gebruik van standaardapparatuur voor embryo-microinjectie en stereomicroscopie. We tonen aan dat microgavage een veilige en efficiënte techniek is die nuttig is voor het toedienen van gecontroleerde hoeveelheden uiteenlopende materialen specifiek in het lumen van de darm van de zebravislarve.

Microgavage van zebravis Larven

De video beschrijft de vermijding en thigmotaxis-test van zebravislarven. De video onderzoekt het gedrag van zebravislarven als reactie op visuele aversieve stimulus.

Zebrafish Avoidance and Thigmotaxis Assay: een methode met hoge doorvoer om larvaal gedrag te onderzoeken als reactie op aversieve visuele stimulus

Dit artikel beschrijft de gedragsreactie van zebravissen op giftige verbindingen door de larvebeweging te monitoren. Het protocol kijkt verder naar een voorbeeld van de reactie van zebravislarven op milieuverontreinigende stoffen.

Larvale voortbewegingstest: methode met hoge doorvoer om neurobehaviorale toxiciteit van een verbinding in zebravislarven te bestuderen

Ons laboratorium ontwikkelde een nieuwe high-throughput geautomatiseerde imaging systeem dat nuttig is voor de detectie van verschillende gedragingen in 7 dagen oude zebravis larven. Het systeem kan worden gebruikt voor het detecteren van subtiele veranderingen in het gedrag na de larven zijn blootgesteld aan milieu-toxische stoffen of geneesmiddelen.

Geautomatiseerde High-throughput Behavioral Analyses in zebravis Larven

Hier beschrijven we protocollen die specifiek zijn ontworpen om morfogenetische defecten te monitoren die optreden tijdens de vroege en late fasen van embryonale verlenging van de rondworm Caenorhabditis elegans. Uiteindelijk zijn deze protocollen ontworpen om genen te identificeren die deze fasen reguleren en om hun differentiële vereisten langs de antero-posterior as van het embryo te karakteriseren.

Novel Metrics te karakteriseren Embryonale Verlenging van de nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

We beschrijven geoptimaliseerde hulpmiddelen om het hart van de zebravis in vivo te bestuderen met fluorescentiemicroscopie van lichtplaten. In het bijzonder stellen we heldere cardiale transgene lijnen voor en presenteren we nieuwe zachte inbeddings- en immobilisatietechnieken die ontwikkelings- en hartafwijkingen voorkomen. Een mogelijke data-acquisitie- en analysepijplijn aangepast aan cardiale beeldvorming wordt ook verstrekt.

Light Sheet Microscopie van snelle hartdynamica in zebravisembryo's

Optische helderheid is een groot voordeel voor celbiologisch en fysiologisch werk bij zebravissen. Robuuste methoden voor het meten van celgroei bij individuele dieren worden beschreven die nieuwe inzichten mogelijk maken in hoe de groei van skeletspieren en naburige weefsels worden geïntegreerd met de groei van het hele lichaam.

Real-time en herhaalde meting van skeletspiergroei in individuele levende zebravissen die worden blootgesteld aan veranderde elektrische activiteit

Hier beschrijven we een methode voor darmisolatie van zebravislarven 5 dagen na de bevruchting, voor single-cell RNA sequencing analyse.

Darmisolatie van zebravislarven voor eencellige RNA-sequencing

Dit protocol maakt gebruik van light-sheet beeldvorming om de contractiele functie van het hart bij zebravislarven te onderzoeken en inzicht te krijgen in de hartmechanica door middel van celtracking en interactieve analyse.

4D Light-sheet beeldvorming van hartcontractie van zebravissen

Leer een high-throughput methode om darmtransittijd te meten bij larven van Danio rerio met fluorescerend gelabeld voedsel. Deze techniek vervangt traditionele microscopie en versnelt onderzoek naar gastro-intestinale biologie en geneesmiddelwerking.

High-throughput meting van darm transittijd met behulp van larvale zebravis

Meer video's verkennen