Een lus-gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP) Assay voor snelle identificatie van Bemisia tabaci

Deze methode biedt een snel en betrouwbaar diagnostisch instrument voor de identificatie van Bemisia tabaci, een invasieve insectenplaag die de productie van groenten en siergewassen in veel landen over de hele wereld beïnvloedt. Vanwege het gemak kan de methode ter plaatse rechtstreeks worden uitgevoerd op plaatsen van binnenkomst voor plantaardige importproducten, zoals havens en luchthavens, en heeft daardoor het potentieel om de verspreiding van Bemisia tabaci langs handelsnetwerken te verminderen. Om te beginnen, gebruik schaar om een acht-buis LAMP strip te snijden in twee, vier-buis LAMP strips.

Label vervolgens de buizen volgens het schema dat in figuur een van het tekstprotocol is beschreven. Bereid hierna voldoende B.tabaci LAMP reaction reaction mix voor 80 reacties. Vervolgens, afzien van 22,5 microliter van de master mix in elk van de buizen van de vier-buis LAMP strips.

Pulse centrifuge, en zet ze op ijs. Snel vortex en pulscentrifuge B.tabaci LAMP PAC. Voeg vervolgens 2,5 microliter toe aan de buis met het label PAC in elk van de lampstrips met vier buizen.

Sluit vervolgens de deksels en bewaar de kant-en-klare B.tabaci LAMP-kitunits bij min 20 graden Celsius. Gebruik om te beginnen met DNA-extractie steriele tandenstokers om de insectenmonsters over te brengen in 0,5 milliliter microcentrifugebuizen met 30 microliter DNA-extractieoplossing. Vervolgens, incubeer de monsters gedurende vijf minuten op 95 graden Celsius in een ThermoMixer ingesteld op 300 rpm.

Kort vortex en puls centrifugeren de monsters. Ontdooi een van de kant-en-klare B.tabaci LAMP kits. Dan, vortex de kit snel, en puls centrifuge het.

Voeg 2,5 microliter monster-DNA-extract toe aan de S-one en S-two buizen. Voeg vervolgens 2,5 microliter pure alkalische DNA-extractieoplossing toe aan de NAC-buis. Na vortexing en puls centrifugeren van de kit, steek de kit in een LAMP analyse apparaat, en het uitvoeren van isothermale DNA versterking analyse op 65 graden Celsius gedurende 60 minuten.

Voer in dezelfde run een smelttemperatuuranalyse uit van de DNA-versterkingsproducten door de kit eerst te verwarmen tot 98 graden Celsius en af te koelen tot 75 graden Celsius. Valideer de LAMP-uitlezing met behulp van de geautomatiseerde LAMP-validatietoepassing. Definieer eerst de doelsoort en het aantal geteste monsters voordat u op de knop Rapport genereren klikt.

Breng ten slotte de uitlezing over naar de juiste invoervelden van de validatietoepassing. Direct na het invoeren van de gegevens wordt het resultaat van de validatie weergegeven. In dit protocol werden B.tabaci insectenexemplaren die in de loop van het reguliere Zwitserse importcontroleproces werden onderschept, geanalyseerd via LAMP-test.

Uit een totaal van 80 geanalyseerde exemplaren werden 75 exemplaren correct geïdentificeerd als echte positieven en twee exemplaren werden correct geïdentificeerd als echte negatieven. Drie exemplaren waren echter valse negatieven en werden ten onrechte geïdentificeerd als niet B.tabaci. Een deel van de testen werd ter plaatse uitgevoerd door fytosanitaire inspecteurs op de luchthaven van Zürich.

In de representatieve resultaten werden monsters één en twee correct geïdentificeerd als B.tabaci via DNA-versterking na ongeveer 30 minuten in de verwachte annealing temperatuur van ongeveer 82 graden Celsius. Na de ontwikkeling maakte deze methode de weg vrij voor een snelle en eenvoudig uit te voeren on-site identificatie van Bemisia tabaci. Het protocol is zo ontworpen dat het kan worden uitgevoerd door fytosanitaire inspecteurs met een beperkte laboratoriumopleiding.

Na een succesvolle validering ter plaatse van de methode op een Zwitsers punt van binnenkomst voor plantaardige invoerproducten, kan de methode worden aangepast aan andere plantpathogenen, maar ook, indien nodig, aan andere menselijke of veterinaire pathogenen.