Kwantitatieve autoradiografische methode voor de bepaling van de regionale tarieven van cerebrale eiwitsynthese in vivo

Meting van regionale tarieven van de hersenen eiwitsynthese kan de reactie van de hersenen op veranderingen op lange termijn zodanig dat optreden tijdens de ontwikkeling en neuroplasticiteit te traceren. Onze methode heeft de voordelen dat metingen volledig kwantitatief zijn, en ze worden gemaakt in de wakker gedragende dier. De kwantitatieve autoradiografische techniek maakt metingen in alle hersengebieden tegelijk mogelijk.

Het aantonen van de procedure zal Anita Torossian, een post-baccalaureaat fellow in mijn laboratorium, en Tianjian Huang, onze dierenarts. Begin deze procedure met voorbereiding voor een operatie zoals beschreven in het tekstprotocol. Eenmaal op de operatie fase, gebruik chirurgische schaar om een een centimeter incisie te maken van de bovenste mediale gedeelte van de linker dij rostrally naar de middellijn onthullen van de dijbeen slagader en ader.

Trek losse huid in met chirurgische huidhaken boven en aan weerszijden van de incisie. Zet de huidhaken vast door ze aan de operatiefase te tappen. Breng steriele 0,9% natriumchloride aan op het blootgestelde gebied om voldoende vocht te behouden.

Gebruik tangen om te ontleden, het scheiden van het bindweefsel rond een klein deel van de dijbeenslagader en ader. Scheid zorgvuldig de slagader en ader. Gebruik nu tangen om een streng van absorbeerbare hechting draad onder zowel de dijbeenader en slagader op het meest laterale punt van de incisie.

Trek de hechting halverwege, zodat de uiteinden gelijk zijn. Op een meer proximale punt aan de lies, gebruik tangen om een tweede hechting draad onder alleen de dijbeen ader. Bind voorzichtig een halve knoop die zal worden gebruikt om de bloedstroom te beperken.

Gebruik op een punt tussen streng A en streng B tangen om een derde hechting onder alleen de dijbeenader te rijgen. Bind voorzichtig een volledige knoop die zal worden gebruikt om de bloedstroom te beperken. Pas op dat u de ader niet scheurt.

Voorzichtig trekken aan streng B om de bloedstroom te beperken. Gebruik een hemostat om streng B voorzichtig te trekken om de bloedbeperking te handhaven. Sluit nu het niet-gesneden uiteinde van de PE-slang aan op een naald van 32 meter en een spuit van één millimeter gevuld met gehepariniseerde zoutoplossing.

Spoel de katheter door om luchtbellen te verwijderen. Snijd een klein gaatje in het beperkte gebied van de dijbeenader met een microschaar en steek voorzichtig het schuine uiteinde van de gespoelde PE acht buizen in de richting van streng B.Once inserted, laat de spanning van streng B los en leid de katheter verder omhoog in de ader. Draai streng B om de ader met de katheter.

Met streng C bind je een extra knoop rond de katheter. Zorg ervoor dat deze knoop de dijbeenslagader niet vangt. Trek voorzichtig terug op het spuitvat om de slang gedeeltelijk te vullen met bloed om ervoor te zorgen dat de katheter goed is geïmplanteerd voordat u een PE 10 katheter in de linker dijbeenslagader met dezelfde procedure.

Zodra zowel de dijbeenader en slagader katheters zijn beveiligd, bind streng A in een knoop rond beide katheters. Na het snijden van alle overtollige hechtingen en het verwijderen van huidhaken, spoel de slagaderlijke katheter met gehepariniseerde zoutoplossing om stolling te voorkomen. Cauterize de uiteinden van beide katheters om een afdichting te creëren.

Plaats de muis in de gevoelige positie en maak een kleine incisie aan de basis van de nek van toepassing zout op het blootgestelde gebied. Steek een holle metalen staaf onderhuids van de nek incisie aan de femorale incisie. Slang de katheters door de holle staaf en uit de nek incisie.

Na het verwijderen van de holle staaf sluit u de dijbeenincisie met hechting, gevolgd door postchirurgische analgesie. Slang de katheters door een 30 centimeter flexibele holle buis om de lente ketting te maken voordat de knop van de lente ketting onder de huid, gevolgd door post-chirurgische analgesie. Verplaats de muis in een duidelijke cilindrische container met een draaibare mount en arm om de muis te huisvesten tijdens de herstelperiode.

Plaats een handwarmer onder de container om de muis warm te houden. Zorg ervoor dat de muis zich aan het begin van het experiment in een normale fysiologische toestand bevindt door monsters te nemen zoals beschreven in het tekstprotocol. Gebruik voor het intraveneus toedienen van de tracer een Y-connector met een spuit met de C 14-label leucine tracer die op één arm is aangesloten, en een spuit met 100 tot 200 microliter steriele zoutoplossing om de met de andere arm verbonden veneuze lijn te spoelen.

Sluit de Y-connector aan op de veneuze lijn. Start de studie door tegelijkertijd het starten van een stop watch, het injecteren van de tracer, en het verzamelen van getimede arteriële bloedmonsters. Spoel de veneuze lijn met zout onmiddellijk na injectie.

Verzamel bloedmonsters een tot en met zeven continu gedurende de eerste twee minuten van het experiment op dezelfde manier. Na het verzamelen van de zeven monsters, verzamelen 30 microliters van dode ruimte bloed voor elk resterende monster. Monsters acht tot en met 14 worden verzameld op drie, vijf, 10, 15, 30, 45 en 60 minuten respectievelijk.

Op een bepaald moment tijdens het experiment, proces drie buizen voor interne normen die tritiated leucine en norleucine zoals beschreven in het tekstprotocol. Om plasmaleucineconcentraties te kwantificeren, gebruikt u een HPLC-systeem met een kolom voor natriumcatie en nakolomderivaatie met orthofthalaldehyde en flourometrische detectie. Het gebied onder de leucinecurve is evenredig met de concentratie leucine in het monster.

Gebruik vergelijking met normen om leucineconcentraties in de monsters te kwantificeren. Gebruik vervolgens een vloeibare scintillatieteller om desintegraties per minuut tritium en C 14 in de plasmamonsters te kwantificeren. Gebruik deze concentraties om de klaringcurve van C 14 gelabeld leucine uit de circulatie en het tijdstip van zijn specifieke activiteit in het arteriële plasma te construeren.

Bereken uit de grafiek de geïntegreerde C 14-gelabelde leucine-specifieke activiteit in het arteriële plasma. Om kwantitatieve autoradiografie uit te voeren, bereid hersenen secties 20 micron in dikte. Sectie hersenen door middel van een cryostat bij min 20 graden Celsius.

Dooi mount secties op gelatine gecoate glijbanen. Na fixatie van dia's, rangschik dia's in een x-ray filmcassette samen met een set van eerder gekalibreerde C 14 gelabeld methyl methacrylaat normen. In een donkere kamer en onder veilig licht, plaats een stuk röntgenfilm, emulsie-kant naar beneden over de zijkanten en normen.

Sluit de cassette af en plaats deze in een zwarte wisselzak. Ontwikkel de folies volgens de instructies van de fabrikant. Geautomatiseerde filmontwikkeling wordt niet aanbevolen omdat de achtergrond ongelijk kan zijn en de kwantificering kan beïnvloeden.

Bouw een kalibratiecurve van optische dichtheid versus weefsel C 14-concentratie op basis van de optische dichtheidswaarden van de set gekalibreerde normen op de film. Pas deze gegevens aan op een polynomiale vergelijking. Een tweede of derdegraads polynomiale vergelijking past heel goed.

Om specifieke hersengebieden te analyseren, lokaliseert u het gebied van belang of ROI in zes tot acht secties in vergelijking met een hersenatlas. Noteer de optische dichtheid van de pixels binnen een ROI in alle secties. Op basis van de kalibratiecurve berekent u de weefsel C 14-concentratie in elke pixel.

Ten slotte, bereken de regionale tarieven van cerebrale eiwitsynthese van het gemiddelde weefsel C 14 concentratie in de ROI in de integraal van de verhoudingen van arteriële plasmaconcentraties van niet-gelabelde en gelabelde leucine soms t en lamba. De fractie van leucine in het weefsel precursor pool die afkomstig is van het plasma. Hier worden representatieve afbeeldingen getoond van een behandeld dier in vergelijking met een dier dat behandeld wordt met anisomycine, een remmer van eiwitsynthese.

De percentages eiwitsynthese zijn evenredig aan het niveau van duisternis in het beeld. Anisomycine drastisch vermindert de gemeten tarieven van de hersenen eiwitsynthese aangeeft de specificiteit van deze methode. Hier worden gedigitaliseerde autoradiogrammen getoond van een wakkere gemuteerde muis op het niveau van de hippocampus en hypothalamus.

De donkere gebieden hebben hogere regionale tarieven van cerebrale eiwitsynthese. Hier is een gedigitaliseerd autoradiogram van een wakker gedragen controle muis op het niveau van de rug hippocampus. Tarieven van cerebrale eiwitsynthese zijn kleurgecoat in de beelden volgens de kleurbalk.

Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om er zeker van te zijn dat dieren zich tijdens de metingen in een normale fysiologische toestand bevinden. Onze methodologie heeft al aangetoond deregulering van eiwitsynthese in neuroontwikkelingsstoornissen zoals Fragile X syndroom. Het kan ook een nuttige marker voor degeneratieve veranderingen en voorwaarden zoals de ziekte van Alzheimer.

De eiwitsynthesemethode kan worden gebruikt in combinatie met immuun histochemie in afwisselende secties om veranderingen in de eiwitsynthese te correleren met regionale veranderingen in specifieke eiwitten. Samengevat is de kwantitatieve autoradiografische L-1 C 14 leucine methode ideaal voor een nauwkeurige bepaling van de regionale eiwitsynthese in vivo. Het biedt aanzienlijke voordelen op het gebied van nauwkeurigheid en de toepasbaarheid ervan op in vivo omstandigheden.