Temporele analyse van de nucleaire-naar-cytoplasmatische translocatie van een Herpes Simplex Virus 1 eiwit door immunefluorescentie confocale microscopie

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van eiwithandel over nucleaire en cytoplasmische translocatie in het systeem waarbinnen geen lichtbeeldvorming beschikbaar is. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het kan worden toegepast als een algemeen protocol voor de studie van temporele eiwitbeweging zonder dat er lichtbeeldvorming is. 20 tot 24 uur voor de virusinfectie zaad 5 keer 10 tot de 4 menselijke embryonale long of HEL vezel blast cellen per goed op een vier goed 11 millimeter gespreide dia en groeimedium voor 's nachts incubatie bij 37 graden Celsius met vijf procent kooldioxide.

Het is belangrijk om de glijbaan grondig te laten schommelen om een gelijkmatige verdeling van de cellen te garanderen, terwijl het ervoor zorgt dat het cultuurmedium niet wordt gemorst. De volgende dag, vervang de supernatants, zodat de 70 tot 80 procent confluent culturen met Medium 199, met 410 plaque-vormende eenheden per cel, en plaats de dia op 37 graden Celsius met schudden, voor een uur. Vervang aan het einde van de incubatie de supernatants door vers groeimedium en breng de cellen terug naar de couveuse voor de juiste experimentele infectieperiode.

Voor immunofluorescente kleuring van de met virussen geïnfecteerde cellen, snel wassen van de cellen drie keer met PBS. Gevolgd door een acht tot tien minuten durende incubatie in 200 microliters van vier procent paraformaldehyde in PBS per put. Aan het einde van de fixatie, was de cellen drie keer met 200 microliter PBS per was, en permeabiliseren de cellen met 100 microliters van 0,2 procent niet-ionische oppervlakteactieve per goed gedurende vijf tot tien minuten.

Was de permeabiliseerde cellen drie keer in PBS zoals aangetoond, en voeg 200 microliters van het blokkeren buffer aan elke put voor een incubatie van een uur bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens de juiste concentratie van het primaire antilichaam van belang toe aan elke put voor een incubatie van twee uur kamertemperatuur. Verwijder aan het einde van de incubatie elk niet-gebonden primaire antilichaam met drie, tien minuten durende wasbeurten in een verse blokkeringsbuffer en voeg een passend secundair antilichaam toe aan elke put voor een incubatie van een uur bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.

Aan het einde van de incubatie, was de cellen drie keer in een blokkerende buffer zoals aangetoond, gevolgd door een wasbeurt in PBS en voeg een druppel antifade montagemedium aangevuld met DAPI aan elke put. Plaats vervolgens een afdeksel over de glijbaan en verzegel de afdekking helling met transparante nagellak. Het toepassen van zachte druk tijdens het monteren van de cover slip zal verwijderen overtollige montage medium, helpen om ervoor te zorgen dat de verwerving van beelden van hoge kwaliteit te waarborgen.

Voor confocale beeldvorming van de gelabelde geïnfecteerde cellen selecteert u het juiste secundaire antilichaam en DAPI-golflengten en stelt u het afbeeldingsformaat in op 1, 024 bij 1, 024 pixels met een gemiddelde lijn van acht. Dan beeld elke put op de vier-goed dia onder de 100x doelstelling. Voor het tellen van een groot aantal cellen, verkrijgen vijf tot tien beelden uit opeenvolgende velden in dezelfde put onder de 40x doelstelling.

Om de nucleaire en cytoplasmatische distributie van ICP0 te analyseren, opent u het project in de confocale applicatiesoftware en selecteert u een afbeelding. Open het tabblad Hoeveelheid en selecteer Interessegebieden sorteren in het menu Extra. Selecteer Lijn tekenen en teken een langslijn over de cel die moet worden geanalyseerd.

Een histogram zal verschijnen met de fluorescentie intensiteit langs de lijn voor zowel het eiwit van belang, en DAPI. Op basis van de achtergrond kleuring, het opzetten van een constante drempel voor de intensiteit van het eiwit van belang voor de analyse van de subcellulaire distributie van het eiwit in elk experiment. Als het eiwitsignaal gemiddeld onder de drempel in het nucleaire gebied ligt, maar boven de drempel voorbij de DAPI-grens ligt, categoriseert u het eiwitsignaal als hoofdzakelijk gelegen in het cytoplasma.

Als het eiwitsignaal boven de drempel in de kern en voorbij de grens van het DAPI-signaal ligt, groepeert u het eiwitsignaal als een kern plus cytoplasmatische lokalisatie. Als het eiwitsignaal boven de drempel in de kern ligt, maar gemiddeld onder de drempel van de DAPI-signaalgroep ligt, wordt het eiwitsignaal als nucleaire lokalisatie gelokaliseerd. Tot slot, tabuleren meer dan 200 geïnfecteerde cellen van elk monster op verschillende infectie tijdpunten, en plot de gegevens in een staafgrafiek om de beweging van het eiwit van belang in de tijd te illustreren.

Zoals aangetoond, vergemakkelijkt deze methode de analyse van de nucleaire-naar-cytoplasmatische translocatie van proteïnen van belang. Bijvoorbeeld, geïnfecteerde cel eiwit nul, of ICP0 subcellulaire distributie verandert naarmate een virale infectie vordert. Om de elementen die nodig zijn voor ICP0-handel tijdens infectie te begrijpen, kunnen ICP0-bewegingen worden gevolgd in Wild Type en Mutant Type Herpes Simplex Virus 1-geïnfecteerde cellen in verschillende infectiefasen, waardoor de evaluatie van de subcellulaire distributie van ICP0 op verschillende tijdstippen van infectie mogelijk is.

Het is belangrijk om te onthouden om monolaag culturen te gebruiken, zodat de virions hebben gelijke toegang tot de cellen en om de veelheid van infectie te normaliseren volgens de virustitel, zodat infectie progressie is vergelijkbaar tussen en binnen virussen. Na elke ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van biologie en celvirologie om eiwitbewegingen te onderzoeken door de tijdelijke subcellulaire lokalisaties van interessante eiwitten binnen een celpopulatie te bestuderen.