Name: Endotoxine activiteit test voor de detectie van volbloed Endotoxemie bij ernstig zieke patiënten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Leer de Endotoxin Activity Assay voor snelle detectie van endotoxemie bij patiënten met sepsis. Dit protocol meet endotoxineactiviteit in volbloed en helpt clinici bij risicostratificatie en vroege interventie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken Paolo Braganò en Lisa Mathiasen, Ph.D. voor hun beoordeling van de methodologie van het assay protocol. Dario winterton, MD heeft substantiële hulp geboden bij het herzien van het manuscript voor Engelse taalvaardigheid.

Het protocol wordt uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen met betrekking tot de omgang met menselijke biospecimens en na de huidige standaard operatieve procedures van ons klinisch laboratorium. Het gebruik van EA-gegevens en klinische informatie van patiënten die worden getest, volgt de richtlijnen van de ethische commissie voor menselijk onderzoek van onze instelling.
1. laboratoriumapparatuur en inhoud van de assay kit
<ol><li>Bewaar de EA-Kit op 2 – 8 °C wanneer deze niet wordt gebruikt.</li>
	<li>
Elke EA-test bestaat uit 5 verschillende soorten buizen; gebruik elk voor een ander deel van de test (zie rubriek 2).
	<ol>
<li>Gebruik Tube #1 (de "Control" Tube) om de basale activiteit van de niet-specifieke oxidatieve uitbarsting van de neutrofielen van de patiënt te meten bij afwezigheid van een specifiek antilichaam.</li>
		<li>Gebruik Tube #2 (de "sample" Tube) om de oxidatieve uitbarsting te meten in reactie op het LPS-antilichaam complex.</li>
		<li>Gebruik Tube #3 (de "Max" buis) om de maximale oxidatieve uitbarsting van de neutrofielen van de patiënt te meten als reactie op een overmaat endotoxine.</li>
		<li>Gebruik Tube #4 (de "LPS" buis) als een bron van exogene endotoxine.</li>
		<li>Gebruik Tube #5 ("aliquot" Tube) voor bloed opslag. Opmerking: Duplicaten van buizen #1, #2 en #3 zijn voorzien voor een totaal van 8 buizen die moeten worden gebruikt voor elk bloedmonster dat wordt getest (de EA-reagensfles en de kwaliteitscontrole test kunnen worden gebruikt voor alle tests in een zakje).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verzamel bloedmonsters van patiënten in steriele buisjes met EDTA-anticoagulans. Bewaar bloedmonsters bij kamertemperatuur voordat u de EA-test uitvoert.</li>
	<li>Schakel voor aanvang van de test de chemiluminometer en de incubator in. Verwarm de incubator tot de temperatuur van 37 °C.</li>
	<li>Idealiter begint het verwerken van het monster binnen 30 minuten na het verzamelen van bloed.</li>
</ol>2. endotoxine activiteit test
<ol><li>Bereid de testbuisjes van EA voor voor het bloedmonster van elke patiënt die u moet testen. Leg de buizen in buis rekken. Verwijder vervolgens de caps.</li>
	<li>Pipetteer met behulp van een combipipet een volume van 1 mL van het EA-reagens uit de fles in buisjes #1 (controle buis), #2 (monsterbuisje) en #3 (Max Tube), elk in tweevoud. Opmerking: Pipetteer de zijkant van de buis om te voorkomen dat de oplossing opspattend.</li>
	<li>Meng het bloedmonster van de patiënt door de bloedafname buis gedurende 20 keer voorzichtig te inverteren. Pipetteer vervolgens 0,5 mL bloed van de patiënt in de buis #4 (LPS Max Tube) en buis #5 (aliquot Tube). Vortex buis #4 voor 10 s.</li>
	<li>Leg de tube racks met alle EA-reageerbuisjes in de incubator Shaker. Sluit de deksel en incuberen gedurende 10 minuten bij een temperatuur van 37 °C.</li>
	<li>Open het deksel en verwijder de buis rekken uit de incubator. Vortex buis #5 (aliquot Tube). Pipetteer met behulp van een steriele punt 40 μL bloed in buisjes #1 en #2, in tweevoud.</li>
	<li>Vortex buis #4 (LPS buis). Pipetteer met dezelfde pipetpunt 40 μL bloed van buis #4 in buis #3 (Max buis), in tweevoud.</li>
	<li>Vortex de zes laatste reageerbuisjes (#1, #2, #3 en respectieve duplicaten) en plaats ze vervolgens weer in hun rekken. Opmerking: Zorg ervoor dat alle buizen voor dezelfde hoeveelheid tijd worden gevorde.</li>
	<li>Plaats de buis rekken terug in de incuberende shaker en sluit de deksel. Stel de incuberende Shaker in op 100 rpm en start de beweging gedurende 14 minuten.</li>
	<li>Plaats de EA gelabelde chipkaart in de chemiluminometer en druk op Start. Volg na de incubatie van 14 minuten de instructies die op de chemiluminometer worden weergegeven om de EA-Tubes in de juiste volgorde te lezen.</li>
	<li>Draai elke buis gedurende 10 sec zachtjes om voordat u deze op de monsterhouder van de chemiluminometer plaatst. Open de monster lade en plaats de buis #1 in de monsterhouder. Sluit vervolgens de voorbeeld lade en wacht tot het lezen van de relatieve licht eenheid (RLU).</li>
	<li>Herhaal stap 2,10 voor buis 2 en buis 3.</li>
	<li>Herhaal stap 2,10 voor dubbele buizen 1, 2 en 3. Opmerking: Probeer alle buizen voor dezelfde hoeveelheid tijd te Vortex tijdens stappen 2.10 – 2.12.</li>
	<li>Nadat alle buizen zijn verwerkt, moet u er rekening mee dat de resultaten van EA automatisch worden berekend en afgedrukt. Niveaus worden uitgedrukt als EA-eenheden en vertegenwoordigen het gemiddelde van dubbele bepalingen van dezelfde monsters.</li>
	<li>Herhaal de stappen 2,2 tot en met 2,13 voor elk bloedmonster dat moet worden getest.</li>
	<li>Bewaar na afloop van de test de overgebleven reageerbuisjes en EA-reagentia gedurende maximaal 30 dagen bij 2 – 8 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Akira, S., Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor signalling.</a> Nature Reviews Immunology. 4 (7), 499-511 (2004).</li>
<li>Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+integration+of+innate+immune+recognition+systems%3A+the+Toll-like+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endotoxin+Research%22%5BJournal%5D)">Evolution and integration of innate immune recognition systems: the Toll-like receptors.</a> Journal of Endotoxin Research. 11 (1), 51-55 (2005).</li>
<li>Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+gram-negative+bacteria+and+endotoxin+by+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system.</a> Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).</li>
<li>Natanson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin+and+tumor+necrosis+factor+challenges+in+dogs+simulate+the+cardiovascular+profile+of+human+septic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endotoxin and tumor necrosis factor challenges in dogs simulate the cardiovascular profile of human septic shock.</a> The Journal of Experimental Medicine. 169 (3), 823-832 (1989).</li>
<li>Suffredini, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardiovascular+response+of+normal+humans+to+the+administration+of+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The cardiovascular response of normal humans to the administration of endotoxin.</a> The New England Journal of Medicine. 321 (5), 280-287 (1989).</li>
<li>Singer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Third+International+Consensus+Definitions+for+Sepsis+and+Septic+Shock+%28Sepsis-3%29%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%3A+The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3).</a> JAMA: The Journal of the American Medical Association. 315 (8), 801-810 (2016).</li>
<li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture-Negative+Severe+Sepsis%3A+Nationwide+Trends+and+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Culture-Negative Severe Sepsis: Nationwide Trends and Outcomes.</a> Chest. 150 (6), 1251-1259 (2016).</li>
<li>Ikeda, T., Ikeda, K., Suda, S., Ueno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usefulness+of+the+endotoxin+activity+assay+as+a+biomarker+to+assess+the+severity+of+endotoxemia+in+critically+ill+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Usefulness of the endotoxin activity assay as a biomarker to assess the severity of endotoxemia in critically ill patients.</a> Innate Immunity. 20 (8), 881-887 (2014).</li>
<li>Dellinger, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Targeted+Polymyxin+B+Hemoperfusion+on+28-Day+Mortality+in+Patients+With+Septic+Shock+and+Elevated+Endotoxin+Level%5BTitle%5D)+AND+%22The+EUPHRATES+Randomized+Clinical+Trial.+JAMA%3A+The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Effect of Targeted Polymyxin B Hemoperfusion on 28-Day Mortality in Patients With Septic Shock and Elevated Endotoxin Level.</a> The EUPHRATES Randomized Clinical Trial. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 320 (14), 1455-1463 (2018).</li>
<li>Marshall, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+prognostic+implications+of+endotoxemia+in+critical+illness%3A+results+of+the+MEDIC+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and prognostic implications of endotoxemia in critical illness: results of the MEDIC study.</a> The Journal of Infectious Diseases. 190 (3), 527-534 (2004).</li>
<li>Levin, J., Bang, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clottable+protein+in+Limulus%3B+its+localization+and+kinetics+of+its+coagulation+by+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+et+Diathesis+Haemorrhagica%22%5BJournal%5D)">Clottable protein in Limulus; its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin.</a> Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica. 19 (1), 186-197 (1968).</li>
<li>Marshall, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+endotoxin+activity+in+critically+ill+patients+using+whole+blood+neutrophil+dependent+chemiluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Measurement of endotoxin activity in critically ill patients using whole blood neutrophil dependent chemiluminescence.</a> Critical Care. 6 (4), London, England. 342-348 (2002).</li>
<li>Grimaldi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Level+of+Endotoxemia+Following+Out-of-Hospital+Cardiac+Arrest+Is+Associated+With+Severity+and+Duration+of+Postcardiac+Arrest+Shock%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">High Level of Endotoxemia Following Out-of-Hospital Cardiac Arrest Is Associated With Severity and Duration of Postcardiac Arrest Shock.</a> Critical Care Medicine. 43 (12), 2597-2604 (2015).</li>
<li>Klein, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EUPHRATES+trial+%28Evaluating+the+Use+of+Polymyxin+B+Hemoperfusion+in+a+Randomized+controlled+trial+of+Adults+Treated+for+Endotoxemia+and+Septic+shock%29%3A+study+protocol+for+a+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Trials%22%5BJournal%5D)">The EUPHRATES trial (Evaluating the Use of Polymyxin B Hemoperfusion in a Randomized controlled trial of Adults Treated for Endotoxemia and Septic shock): study protocol for a randomized controlled trial.</a> Trials. 15, 218(2014).</li>
<li>Bottiroli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+clinical+significance+of+early+high+Endotoxin+Activity+in+septic+shock%3A+An+observational+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Prevalence and clinical significance of early high Endotoxin Activity in septic shock: An observational study.</a> Journal of Critical Care. 41, 124-129 (2017).</li>
<li>Kaukonen, K. M., Bailey, M., Suzuki, S., Pilcher, D., Bellomo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortality+related+to+severe+sepsis+and+septic+shock+among+critically+ill+patients+in+Australia+and+New+Zealand%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%3A+The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Mortality related to severe sepsis and septic shock among critically ill patients in Australia and New Zealand.</a> JAMA: The Journal of the American Medical Association. 311 (13), 1308-1316 (2014).</li>
<li>Biagioni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin+activity+levels+as+a+prediction+tool+for+risk+of+deterioration+in+patients+with+sepsis+not+admitted+to+the+intensive+care+unit%3A+a+pilot+observational+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Endotoxin activity levels as a prediction tool for risk of deterioration in patients with sepsis not admitted to the intensive care unit: a pilot observational study.</a> Journal of Critical Care. 28 (5), 612-617 (2013).</li>
<li>Roth, R. I., Levin, F. C., Levin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+detection+of+bacterial+endotoxin+in+plasma+with+the+Limulus+test%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Laboratory+and+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Optimization of detection of bacterial endotoxin in plasma with the Limulus test.</a> The Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 116 (2), 153-161 (1990).</li>
<li>Yaguchi, A., Yuzawa, J., Klein, D. J., Takeda, M., Harada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+intermediate+levels+of+the+Endotoxin+Activity+Assay+%28EA%29+with+other+biomarkers+in+the+assessment+of+patients+with+sepsis%3A+results+of+an+observational+study%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Combining intermediate levels of the Endotoxin Activity Assay (EA) with other biomarkers in the assessment of patients with sepsis: results of an observational study.</a> Critical Care. 16 (3), London, England. (2012).</li>
<li>Earley, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burn+Injury+Alters+the+Intestinal+Microbiome+and+Increases+Gut+Permeability+and+Bacterial+Translocation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Burn Injury Alters the Intestinal Microbiome and Increases Gut Permeability and Bacterial Translocation.</a> PLoS One. 10 (7), (2015).</li>
<li>Munster, A. M., Smith-Meek, M., Dickerson, C., Translocation Winchurch, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidental+phenomenon+or+true+pathology%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Incidental phenomenon or true pathology?</a> Annals of Surgery. 218 (3), 321(1993).</li>
<li>Clementi, A., Virzì, G. M., Brocca, A., Ronco, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Endotoxin+in+the+Setting+of+Cardiorenal+Syndrome+Type+5%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiorenal+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Role of Endotoxin in the Setting of Cardiorenal Syndrome Type 5.</a> Cardiorenal Medicine. 7 (4), 276-283 (2017).</li>
<li>Virzì, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiorenal+Syndrome+Type+5+in+Sepsis%3A+Role+of+Endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22in+Cell+Death+Pathways+and+Inflammation.+Kidney+and+Blood+Pressure+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiorenal Syndrome Type 5 in Sepsis: Role of Endotoxin.</a> in Cell Death Pathways and Inflammation. Kidney and Blood Pressure Research. 41 (6), 1008-1015 (2016).</li>
<li>Mignon, F., Piagnerelli, M., Van Nuffelen, M., Vincent, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+empiric+antibiotic+treatment+on+plasma+endotoxin+activity+in+septic+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Infection%22%5BJournal%5D)">Effect of empiric antibiotic treatment on plasma endotoxin activity in septic patients.</a> Infection. 42 (3), 521-528 (2014).</li>
<li>Klein, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Daily+variation+in+endotoxin+levels+is+associated+with+increased+organ+failure+in+critically+ill+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Daily variation in endotoxin levels is associated with increased organ failure in critically ill patients.</a> Shock. 28 (5), 524-529 (2007).</li>
</ol>

Estor SpA had betrekking op de kosten van de publicatie van het dagboek en de kosten voor videoproductie. De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Septische shock is tegenwoordig nog steeds geassocieerd met een sterfte zo hoog als 40%, hoewel dit percentage varieert volgens de overwogen rapporten16. De behoefte aan nieuwe en betere biomerkers wordt bepleit door de meeste deskundigen op de gebieden om clinici te helpen bij vroegtijdige diagnose, beter beheer en prognosticatie van patiënten met septische shock6.
Het uitvoeren van een EA-test vereist geen eerdere technische kennis of geavancee...

De lipopolysaccharide (LPS), ook bekend als endotoxine, is een belangrijk onderdeel van de membraan structuur van gram-negatieve (GN) bacteriën. Het maakt ongeveer 10% van de celwand, essentieel voor de buitenste membraan integriteit en homeostase. Bovendien, het is een krachtige activator van de gastheer aangeboren immuunsysteem1,2.
In vitro blootstelling van aangeboren immuunsysteem cellen aan LPS leidt tot veranderingen in de expressie van meerdere genen3. Toediening van zeer kleine hoeveelheden LPS bij gezonde menselijke vrijwilligers activeert de cascade van acute systemische ontstekingen, terwijl sepsis en septische shock kunnen ontstaan met hogere endotoxine concentraties4,5.
Sepsis is een levensbedreigende aandoening die, indien niet snel herkend, kan leiden tot meervoudig orgaan falen en overlijden. Septische patiënten moeten tijdig worden behandeld, met agressieve reanimatie, adequate antibioticumtherapie, optimale broncode beheersing en snelle orgaanondersteunende strategieën. De diagnose van de etiologie van sepsis is voornamelijk gebaseerd op klinische herkenning en op cultuur gebaseerde pathogeen detectie6. De resultaten van microbiële culturen kunnen echter tot 48 uur duren en zijn onduidelijk in maximaal 30% van de gevallen7. Vroegtijdige identificatie en interventie kunnen leiden tot betere resultaten van de patiënt. Bij patiënten bij wie sepsis wordt vermoed, worden beslissingen vaak genomen op basis van fysiologische en biochemische parameters, zonder een duidelijk teken van endotoxemie.
De meting van de endotoxine activiteit (EA) kan worden verkregen door middel van een commerciële assay (Zie tabel van de materialen) in volbloed. Het kan worden gebruikt als een biomarker van systemische endotoxemie voor de vroege stratificatie van de ernst van de ziekte, met name bij patiënten met een risico op het ontwikkelen van septische shock8. De test werd gebruikt om Polymyxine B hemoperfusie therapie te begeleiden in een recent gepubliceerde dubbelblinde gerandomiseerde-gecontroleerde klinische studie bij patiënten met septische shock9. Bij ernstig zieke patiënten toonde de MEDIC-studie verhoogde EA-niveaus om te worden geassocieerd met meerdere orgaandisfunctie, Intensive Care Unit (ICU) lengte van verblijf, en sterfte10.
Er zijn verschillende assays ontwikkeld om endotoxine op te sporen. De Limulus Amoebocyte lysate (LAL) Assay, hetzij als een gel-stolsel, turbidimetrische, of chromogene test, is tot nu toe het vaakst aangenomen voor de schatting van serum endotoxine. Het is gebaseerd op het vermogen van endotoxine voor het induceren van stolling van de Hemolymfe van de Horseshoe krab, Limulus polyphemus. Deze bepaling heeft echter enkele beperkingen op het gebied van specificiteit. In het bijzonder kan het ook worden geactiveerd door andere microbiële producten dan endotoxine, zoals componenten van de schimmel celwand, en het kan worden geremd door verschillende humane plasmaproteïnen11.
Gedurende het laatste decennium is de meting van EA ontwikkeld en gevalideerd als een biomarker van circulerende endotoxemie. In vergelijking met de LAL test is EA sneller en gemakkelijker te implementeren in de klinische setting. Bovendien, het is aangetoond dat nauwkeuriger dan LAL in volbloed, met verhoogde gevoeligheid en specificiteit, zowel in vitro en in vivo12.
Ondanks de initiële implementatie als een vroeg diagnostisch instrument voor de snelle identificatie van GN-bacteriën als sepsis veroorzaker agenten, is het EA-niveau ook bestudeerd als een biomarker van de ernst van de ziekte. In dit verband is gebleken dat het bijzonder nuttig is om de hypoperfusie toestand te beoordelen als gevolg van aanhoudende kritieke ziekte, zoals septische shock of post-hartstilstand syndroom13. Meer recentelijk, sinds de ontwikkeling van hemopurificatie systemen, is er ook een positief resultaat van EA voorgesteld als screening tool om potentiële kandidaten voor deze therapie14nauwkeurig te identificeren. Onlangs voerden we een observationele retrospectieve studie uit over de prevalentie en klinische significantie van vroege hoge niveaus van EA bij 107 patiënten met septische shock. In lijn met andere recente resultaten ontdekten we dat EA een veelbelovende marker is van de ernst van de ziekte bij patiënten met septische shock15.
Het doel van het huidige manuscript is om de methode te beschrijven om de EA-test uit te voeren, hetzij aan het bed of in het laboratorium, en om het mogelijke gebruik ervan te beschrijven in een representatief scenario van septische shock. Deze techniek kan LPS-activiteit detecteren door het meten van de verbeterde oxidatieve uitbarsting in neutrofielen na hun priming door complexen van een anti-endotoxine-antilichaam en LPS. De verhoogde respiratoire burst wordt gedetecteerd door een chemiluminometer en de hoeveelheid uitgezonden licht wordt evenredig geacht aan de hoeveelheid Endotoxine in het bloedmonster. De assay vereist weinig reagentia, duurt ongeveer 30 minuten om uit te voeren en gebruikt zo weinig als 40 μL volbloed12.

<table><tbody><tr><td>EAA kit</td><td>Spectral Medical Inc.</td><td>EAAST-20</td><td>Pakket met 20 tests + 1 kwaliteitscontrole</td></tr><tr><td>Smart Line TL</td><td>Berthold</td><td>EAASL</td><td>Luminometer</td></tr><tr><td>Incubator shaker</td><td>GRANT</td><td>ES-20</td><td>Mini-incubator shaker</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>VWR</td><td>444-2790</td><td>Vortex instrument</td></tr></tbody></table>

endotoxine activiteit test voor de detectie van volbloed endotoxemie bij ernstig zieke patiënten

Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients

Lipopolysaccharide, ook bekend als endotoxine, is een fundamenteel bestanddeel van gram-negatieve bacteriën en speelt een cruciale rol in de ontwikkeling van sepsis en septische shock. De vroegtijdige identificatie van een infectieuze proces dat zich snel ontwikkelt tot een kritieke ziekte, kan een snellere en intensievere behandeling mogelijk maken, waardoor dit mogelijk leidt tot betere resultaten van de patiënt. De endotoxine activiteit (EA) test kan aan het bed worden gebruikt als een betrouwbare biomarker van systemische endotoxemie. De detectie van verhoogde endotoxine activiteitsniveaus is herhaaldelijk aangetoond dat deze gepaard gaat met een verhoogde ernst van de ziekte bij patiënten met sepsis en septische shock. De assay is snel en eenvoudig uit te voeren. Kort na de bemonstering wordt een hoeveelheid volbloed gemengd met een anti-endotoxine antilichaam en met toegevoegde LPS. Endotoxine activiteit wordt gemeten als de relatieve oxidatieve uitbarsting van GEPRIMEERDE neutrofielen zoals gedetecteerd door chemioluminescentie. De uitvoer van de assay wordt uitgedrukt op een schaal van 0 (afwezig) tot 1 (maximaal) en gecategoriseerd als "laag" (< 0,4 eenheden), "intermediair" (0,4 – 0.59 eenheden), of "hoog" (≥ 0,6 eenheden). De gedetailleerde methodologie en motivering voor de implementatie van de EA-test worden in dit manuscript gerapporteerd.

Een 72-jarige man werd toegelaten tot de spoeddienst (ED) van een academisch stedelijk ziekenhuis. Een paar dagen eerder had hij aan zijn primaire zorg arts die klagen over branden op urineren gepresenteerd. Een korte-cursus therapie met orale foshomycine werd aanbevolen. Zijn medische geschiedenis omvatte hypertensie, ongecompliceerde type-2 diabetes en goedaardige prostaathyperplasie. Zijn medicijnen waren enalapril, Atorvastatine, tamsulosine en metformine.
<p class="jove_content" ...

Hierbij presenteren wij een protocol om aan het bed de endotoxine activiteit van menselijke volbloed monsters te meten. De endotoxine activity assay is een eenvoudige test om te presteren en kan een nuttige biomarker zijn bij ernstig zieke patiënten met sepsis.

Endotoxine activiteit test voor de detectie van volbloed Endotoxemie bij ernstig zieke patiënten

Lipopolysaccharide, also known as endotoxin, is a fundamental component of gram-negative bacteria and plays a crucial role in the development of sepsis ...

Sepsis kan leiden tot multi-orgaanfalen en de dood. Het endotoxine is een fundamenteel bestanddeel van gramnegatieve bacteriën. Verhoogde circulerende niveaus van endotoxine kunnen identificeren patiënt met een hoger risico op het ontwikkelen van een meer ernstige ziekte.De Endotoxine Activity Assay kan worden gebruikt als een eenvoudige, snelle en betrouwbare biomarker van systemische endotoxemie. De vroege opsporing van dit toxine kan helpen clinici de behandeling van patiënten met septische shock. Bij patiënten met septische shock kan de vroege identificatie van een snel evoluerende aandoening leiden tot een snellere en intensievere levensondersteunende therapie, wat mogelijk leidt tot betere resultaten.Het aantonen van deze procedure zal Lisa Mathiasen zijn, een moleculair bioloog die samenwerkt met onze onderzoeksgroep. Om deze procedure te beginnen, zet een EA-testkit en pak de vijf verschillende soorten buizen uit. Gebruik buis nummer een, de Control buis, om de basale activiteit van de niet-specifieke oxidatieve uitbarsting van de neutrofielen van de patiënt te meten bij afwezigheid van een specifiek antilichaam.Gebruik buis nummer twee, de Sample buis, om de oxidatieve burst te meten in reactie op het LPS-antilichaam complex. Gebruik buis nummer drie, de Max buis, om de maximale oxidatieve uitbarsting van de neutrofielen van de patiënt te meten in reactie op een overmaat aan endotoxine. Gebruik buis nummer vier, de LPS buis, als een bron van exogene endotoxine.En gebruik buis nummer vijf, de Aliquot buis, voor bloedopslag. Verzamel bloedmonsters van patiënten in steriele buizen die EDTA-antistollingsmiddel bevatten en bewaar ze op kamertemperatuur voordat u de EA-test uitvoert. Zet voor aanvang van de test de chemiluminometer en couveuseshaker aan en verwarm de couveuse tot 37 graden Celsius.Plaats eerst de EA-buizen die in buisrekken worden gebruikt en verwijder de doppen. Gebruik een combipipet om een milliliter van het EA-reagens uit de fles over te brengen naar buizen nummer één, nummer twee en nummer drie door langs de zijkant van de buizen te pipetten. Draai de bloedafnamebuis 20 keer voorzichtig om om het bloedmonster van de patiënt te mengen.Dan, pipet 0,5 milliliter van het bloed van de patiënt in buis nummer vier en buis nummer vijf. Vortex buis nummer vier gedurende 10 seconden. Plaats de buisrekken met alle EA-reageerbuizen in de incubatorshaker.Sluit het deksel en broed gedurende 10 minuten uit op 37 graden Celsius. Open hierna het couveusedeksel en verwijder de buisrekken uit de shaker. Vortex buis nummer vijf.Met behulp van een steriele tip, pipet 40 microliters van bloed in buizen nummer een en nummer twee, in duplicaat. Vortex buis nummer vier. Met behulp van dezelfde pipettip breng je 40 microliters bloed van buis nummer vier naar buis nummer drie, in tweevoud.Vortex de zes laatste reageerbuizen een voor een. Plaats de buisrekken terug in de broedende shaker en sluit het deksel. Stel de shaker in op 100 rpm en start de beweging gedurende 14 minuten.Plaats de EA-chipkaart in de chemiluminometer en druk op Start. Volg na de incubatie van 14 minuten de instructies op de chemiluminometer. Voorzichtig vortex elke buis gedurende 10 seconden voor het plaatsen van het op de monsterhouder van de chemiluminometer.Open de monsterlade en plaats buis nummer één in de monsterhouder. Sluit vervolgens de monsterlade en wacht op de relatieve lichteenheid. Herhaal dit leesproces voor buizen twee en drie en alle duplicaten, zoals beschreven in het tekstprotocol.Nadat alle buizen zijn verwerkt, worden de EA-resultaten automatisch berekend en afgedrukt. Herhaal het hele testproces voor elk bloedmonster dat moet worden getest. Bewaar de EA Assay-kit en de bijbehorende componenten in het originele verzegelde pakket bij een temperatuur tussen de twee en 25 graden Celsius.In deze studie wordt een Endotoxine Activity Assay uitgevoerd om volbloed endotoxemie bij ernstig zieke patiënten op te sporen. Een EA-waarde van minder dan 0,40 EA-eenheden duidt op een laag endotoxineactiviteitsniveau, gelijk aan een lage circulerende LPS-concentratie, wat een laag risico op progressie naar een ernstige ziektetoestand vertegenwoordigt. Een resultaat tussen 0,40 en 0,59 EA-eenheden duidt op een intermediair endotoxineactiviteitsniveau, wat een tussenrisico vormt voor de ontwikkeling van ernstige sepsis en septische shock.Resultaten gelijk aan of groter dan 0,60 EA-eenheden geven een hoog endotoxineactiviteitsniveau aan, wat een hoog risico vormt voor septische shock en slechte patiëntresultaten. Bloed van buizen nummer vier en vijf moet worden gemengd met de juiste reageerbuis. Extra zorg moet worden genomen om de juiste volgorde aangegeven in het protocol te volgen.Elke buis wordt uitgevoerd in duplicaten, wat mogelijk leidt tot fouten in deze fase. Na de introductie is de EA Assay voorgesteld als biomarker voor de risicostratificatie van patiënten met systemische hypoperfusie. Ook is het onderzocht als een screening test om patiënten te selecteren voor geavanceerde hemopurification behandeling strategieën.

endotoxin-activity-assay-for-detection-whole-blood-endotoxemia

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Beschrijven we een simpele immunoassay om de productie van pro-inflammatoire cytokines, zoals IL-1 bèta productie, bij patiënten met autoinflammatory fenotypes te meten. Door het activeren van cellen in volbloed culturen met pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen, in het bijzonder met lipopolysaccharide, kan cytokine secretie gemakkelijk worden geëvalueerd in volbloed supernatants.

Nauwkeurige en eenvoudige meting van de pro-inflammatoire cytokine IL-1β met behulp van een volbloed stimulatie Assay

This video demonstrates a rapid bioassay for investigating endotoxin activity in a whole blood sample via a chemiluminescence-based method. This assay is a rapid and sensitive biomarker test for early-stage diagnosis of endotoxin-mediated sepsis.

Endotoxin Activity Assay: A Chemiluminescence-Based Bioassay for Investigating Endotoxin Activity in Blood Sample

This video describes the turbidimetric format of the Limulus amoebocyte lysate, or LAL, assay to estimate endotoxin contamination in PEGylated liposomal doxorubicin nano-formulations. The turbidity of the solution following the reaction of the endotoxin with the LAL reagent helps to estimate the endotoxin in the sample.

Turbidimetric Limulus Amoebocyte Lysate Assay: A Technique to Detect and Quantify Endotoxin Contamination in Nano-Formulated Drugs

This video describes a gel-clot assay to determine the presence of bacterial endotoxins in nano-formulations using Limulus Amoebocyte Lysate derived from the blood cells of horseshoe crabs. The assay helps test for endotoxin contamination of pharmaceutical products, including nano-based formulations.

Gel-Clot Limulus Amoebocyte Lysate Assay: A Method for Bacterial Endotoxin Detection in Nanoparticle Formulations

This video demonstrates an assay to examine the toll-like receptor(TLR)-dependent activity of the transcription factors nuclear factor-kappa-B (NF-κB) and activator protein-1 (AP-1) in macrophages. The TLRs trigger a pro-inflammatory signaling cascade upon recognizing damage-associated molecular patterns (DAMPs), activating NF-κB and AP-1. The engineered reporter macrophages produce secreted embryonic alkaline phosphatase (SEAP) enzyme upon NF-κB and AP-1 activation, which is detected via a...

An Assay for TLR-Dependent NF-&kcy;B/AP-1 Transcription Factor Signaling in Macrophages

Twee complementaire analyses van biologische atmosferische deeltjes uit bemonsterde luchtfilters worden hier beschreven: de extractie en detectie van endotoxine en van DNA.

-Air bemonsterd Filter Analyse voor endotoxinen en DNA Content

Intraveneuze toediening van endotoxine veroorzaakt op betrouwbare wijze dosisafhankelijke fysiologische en immunologische veranderingen die consistent zijn met verschillende pathologische toestanden. Deze reductionistische aanpak maakt de onderzoek, modellering en experimentele modificatie van systemische ontsteking en de downstream effecten ervan bij de mens mogelijk.

Intraveneuze endotoxine Challenge bij gezonde mensen: een experimenteel platform te onderzoeken en te moduleren systemische ontsteking

Detectie van endotoxines in technisch vervaardigde nanomaterialen vertegenwoordigt een van de grote uitdagingen op het gebied van de nanogeneeskunde. Hier, presenteren we een case-studie die het kader bestaat uit drie verschillende LAL formaten beschrijft te schatten van potentiële endotoxine besmetting in nanodeeltjes.

Detectie van endotoxinen in Nano-formuleringen gebruiken Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) testen

Hier presenteren we een reproduceerbaar intensive care unit-georiënteerd endotoxine model bij ratten.

Een reproduceerbaar intensive care-unit-georiënteerd endotoxinemodel bij ratten

Hier beschrijven we een in-house extracellulaire vesikel weefselfactoractiviteitstest. Op activiteit gebaseerde assays en op antigeen gebaseerde assays zijn gebruikt om de weefselfactor te meten in extracellulaire blaasjes van menselijke plasmamonsters. Op activiteit gebaseerde assays hebben een hogere gevoeligheid en specificiteit dan op antigeen gebaseerde assays.

Extracellulaire vesikel weefselfactoractiviteitstest

Leer de Endotoxin Activity Assay voor snelle detectie van endotoxemie bij patiënten met sepsis. Dit protocol meet endotoxineactiviteit in volbloed en helpt clinici bij risicostratificatie en vroege interventie.

Endotoxine activiteit test voor de detectie van volbloed Endotoxemie bij ernstig zieke patiënten

Meer video's verkennen