Name: Een In Vivo methode om te studeren muis bloed-Testis barrière integriteit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Leer een in vivo methode om de integriteit van de bloed-testis barrière te beoordelen met inulin-FITC injecties in muizen. Deze techniek helpt onderzoekers genetische en milieufactoren te bestuderen die de vruchtbaarheid beïnvloeden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de nationale toets R & D programma van China (2016YFA0500902), de nationale Natural Science Foundation van China (31471228, 31771653), de Jiangsu Science Foundation voor DN jonge geleerden (BK20150047), de natuurwetenschappen Stichting van de provincie Jiangsu (BK20140897, 14KJA180005) en het innovatieve en ondernemende programma van de oostelijke provincie Jiangsu te K.Z.

Alle uitgevoerde dierproeven zijn goedgekeurd door het Comité van de Nanjing Medizinische Universität. Mannelijke C57BL/6 muizen werden gehouden onder omstandigheden van de gecontroleerde fotoperiode en werden bevoorraad met voedsel en water.
1. voorbereiding
<ol><li>
Microinjection haarvaten
	<ol>
<li>Gebruik van microinjection haarvaten met een buitendiameter, innerlijke dimeter en lengte van 1,0 mm, 0,8 mm en 10,0 cm, respectievelijk.</li>
		<li>Trek glas haarvaten met een capillaire trekker (figuur 1A). Testen en aanpassen van de instellingen afhankelijk van de capillaire trekker-machine die wordt gebruikt.</li>
		<li>Breek de uiteinden van de pipet met een tang te gebruiken om te verkrijgen van de haarvaten met een diameter van 50-µm op het puntje. Opmerking: De tips is mogelijk te lang door te dringen de testis.</li>
		<li>Verscherp de tip in een hoek van 30° met behulp van een micropipet beveler (Figuur 1 c).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reagentia
	<ol>
<li>1% pentobarbital natrium bereiden: Los pentobarbital natrium 100 mg 10 ml-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (stap 2.3.3).</li>
		<li>10 mg/mL inuline-FITC bereiden: los van de inuline-FITC 1 mg in 100 μl van PBS (stap 2.1.6).</li>
		<li>4% paraformaldehyde bereiden: Los paraformaldehyde (PFA) 4 g in 100 mL PBS (stap 2.3.3).</li>
		<li>30% sacharose bereiden: los van sacharose 3 g in 10 mL PBS (stap 2.3.4).</li>
		<li>0,1% cadmium chloride bereiden: Los cadmium chloride 10 mg in 10 mL PBS (stap 2.1.1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. methoden
<ol><li>
Narcose en presurgery voorbereiding
	<ol>
<li>Weeg 8-week-oude C57BL/6 mannelijke muizen en berekenen van de vereiste dosis voor CdCl2. Behandelen van een groep van muizen (n = 3) met CdCl2 (5 mg/kg b.w., i.p.) voor 3 d voor de operatie. Behandelen van een andere groep 8-week-oude C57BL/6 mannelijke muizen (n = 3) met PBS als besturingselement.</li>
		<li>Chirurgie onder aseptische condities uitvoeren met behulp van steriele injectiespuit, naald, schaar en pincet.</li>
		<li>Anesthesie werkoplossing vers bereiden. De vereiste dosis van anesthesie is 70 mg pentobarbital natrium/kg lichaamsgewicht. Een volwassen muis van het C57BL/6 op 8 weken leeftijd weegt gemiddeld ~ 25 g, die correspondeert met 175 μL van 1% pentobarbital natrium (1,75 mg per muis). Opmerking: De pentobarbital natrium wordt ontbonden in steriele-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). De oplossing wordt gefiltreerd door 0.22 um filter eenheid alvorens te worden gebruikt.</li>
		<li>Reinig het gebied voor chirurgie met 75% ethanol en bestrijken het gebied met een schone tissue handdoek.</li>
		<li>Zet de thermostaat van de kachel en aanpassen van de temperatuur tot 37 ° C.</li>
		<li>Inuline-FITC werkoplossing (10 mg/mL) voor te bereiden op de dag van de operatie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Chirurgische ingreep
	<ol>
<li>Weeg 8-week-oude C57BL/6 mannelijke muizen en berekenen van de vereiste dosis van de verdoving.</li>
		<li>Een intraperitoneale injectie van pentobarbital natrium met behulp van de 1 mL steriele injectiespuit uit te voeren. Houd de muis in een schone kooi.</li>
		<li>Observeer het oog reflex reactie en ademhaling patroon van de muis om te bevestigen dat er onder volledige verdoving. Opmerking: Gewoonlijk 10-15 min nodig zijn totdat de muis is diep verdoofd, met een totaal gebrek aan teen snuifje respons en het onderhoud van langzame, gestage ademhaling.</li>
		<li>Verplaats de muis naar het operatie gebied en bestrijken haar oog gebied met een vochtig tissue papier om te voorkomen dat droogte tijdens anesthesie (figuur 2A).</li>
		<li>Het buikhaar scheren met een scheerapparaat en Desinfecteer het operatie gebied met 75% ethanol.</li>
		<li>Maken met een scherpe schaar, een 1-cm huid incisie boven de preputiale klieren bloot van de buikwand. Til de buikwand met een kleine Tang en maak een incisie van 0,5-cm bloot de peritoneale Holte (figuur 2B).</li>
		<li>Pincet gebruiken om te zoeken naar vet pads rond de bijbal en de testis. Trek voorzichtig de dikke pads uit de bijgevoegde testis duidelijk bloot (figuur 2C en 2D). Meestal werken op één testis tegelijk. Opmerking: Raak de dikke pads en de testis met handen.</li>
		<li>Plaats een papier (9 cm in diameter) onder de dikke pads en de testis (figuur 2C).</li>
		<li>Inuline-FITC injecteren een microinjection pipet en sluit deze aan op de micromanipulator eenheid (Figuur 1 d). Zachtjes de microinjection pipet onder de tunica albuginea invoegen en laadt een totaal van 20 μL van de inuline-FITC in het interstitium van de testis (figuur 2E en 2F). Opmerking: Druk zorgvuldig de microinjection pipet om te voorkomen dat het wordt verplaatst.</li>
		<li>Toezicht op het verkeer van inuline-FITC in de testis (Figuur 2 g).</li>
		<li>Onmiddellijk zet de testis terug in de buikholte na de voltooiing van de injectie.</li>
		<li>Herhaal de procedure voor de contralaterale testis. Deze testis wordt geïnjecteerd met 20 μL van PBS als een besturingselement.</li>
		<li>Sluit de huid met een chirurgische hechtdraad en verplaats de muis naar een pad van de warmte van een thermostatische kachel (figuur 1B). Het beheren van een dosis van 1 mg van pijnstiller (buprenorfine) per 1 kg lichaamsgewicht via subcutane injectie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Oogsten van de teelballen en de voorbereiding van de bevroren secties
	<ol>
<li>40 minuten na de injectie, euthanaseren van de ontvangende muis door cervicale dislocatie volgens dierenverzorgers en gebruiken van richtsnoeren.</li>
		<li>Gebruik een paar scherpe schaar voor het verzamelen van de teelballen. Plaats de teelballen in 1 mL ijskoud PBS te verwijderen elke besmetting van bloed.</li>
		<li>Bevestigen van de teelballen in 4% paraformaldehyde (PFA) bij 4 ° C voor 12-24 h. negeren de 4% PFA en wassen het weefsel 3 x met 1,5 mL 1% PBS bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Uitdrogen van het weefsel in 30 gewichtspercenten sacharose 's nachts. Zet de testis in het verzonken frame en dekking van het weefsel met optimale scherpe temperatuur samengestelde (OCT). Nadat de LGO is bevroren, moet u het insluiten frame vult met LGO zodat de hele testis kan worden gedekt met LGO.</li>
		<li>Knip 5 μm-dik, bevroren cross-secties van de teelballen in een cryostaat bij-20 ° C en laat ze zich houden aan Microscoop dia's. Opmerking: Refreezing ingesloten weefsels in droog ijs kan verhogen de stijfheid voor het snijden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Afbeelding inkoopvoorstel
	<ol>
<li>Plaats de dia's in een bevochtigde doos. Warm de dia's bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Wassen van de secties 3 x met Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Luchtdroog gedurende 5 min. in het donker. Veeg eventuele resterende TBS met stofvrije papier.</li>
		<li>Dekking van de doorsneden met 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Plaats de omgekeerde dekglaasje aan op een microscoopglaasje.</li>
		<li>Verwerven van beelden met behulp van een confocal microscoop. Een totaal van 20 X vergroting is over het algemeen voldoende zijn voor het opsporen van het helder fluorescerende signaal.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sertoli-Sertoli+and+Sertoli-germ+cell+interactions+and+their+significance+in+germ+cell+movement+in+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis.</a> Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).</li>
<li>Wen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+germ+cells+across+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis-the+involvement+of+both+actin-+and+microtubule-based+cytoskeletons%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Transport of germ cells across the seminiferous epithelium during spermatogenesis-the involvement of both actin- and microtubule-based cytoskeletons.</a> Tissue Barriers. 4 (4), e1265042(2016).</li>
<li>Wang, C. Q., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+seamless+trespass%3A+germ+cell+migration+across+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A seamless trespass: germ cell migration across the seminiferous epithelium during spermatogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 178 (4), 549-556 (2007).</li>
<li>Fijak, M., Meinhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+testis+in+immune+privilege%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The testis in immune privilege.</a> Immunological Reviews. 213, 66-81 (2006).</li>
<li>O'Bryan, M. K., Hedger, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+Networks+in+the+Control+of+Spermatogenesis+Chronic+Inflammation+in+an+Immunologically+Privileged+Tissue%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Mechanisms+In+Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Inflammatory Networks in the Control of Spermatogenesis Chronic Inflammation in an Immunologically Privileged Tissue?</a> Molecular Mechanisms In Spermatogenesis. 636, 92-114 (2008).</li>
<li>Li, N., Wang, T., Han, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+cellular+and+molecular+aspects+of+immune+privilege+in+the+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Structural cellular and molecular aspects of immune privilege in the testis.</a> Frontiers in Immunology. 3, 152(2012).</li>
<li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mammalian+Blood-Testis+Barrier%3A+Its+Biology+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Review%22%5BJournal%5D)">The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation.</a> Endocrine Review. 36 (5), 564-591 (2015).</li>
<li>Govero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+infection+damages+the+testes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Zika virus infection damages the testes in mice.</a> Nature. 540 (7633), 438-442 (2016).</li>
<li>Jenabian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+tolerance+properties+of+the+testicular+tissue+as+a+viral+sanctuary+site+in+ART-treated+HIV-infected+adults%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Immune tolerance properties of the testicular tissue as a viral sanctuary site in ART-treated HIV-infected adults.</a> AIDS. 30 (18), 2777-2786 (2016).</li>
<li>Holembowski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAp73+is+essential+for+germ+cell+adhesion+and+maturation+in+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">TAp73 is essential for germ cell adhesion and maturation in testis.</a> Journal Of Cell Biology. 204 (7), 1173-1190 (2014).</li>
<li>Legendre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineered+3D+blood-testis+barrier+model+for+the+assessment+of+reproductive+toxicity+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An engineered 3D blood-testis barrier model for the assessment of reproductive toxicity potential.</a> Biomaterials. 31 (16), 4492-4505 (2010).</li>
<li>Setchell, B. P., Waites, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+permeability+of+the+testicular+capillaries+and+of+the+%27blood-testis+barrier%27+after+injection+of+cadmium+chloride+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Changes in the permeability of the testicular capillaries and of the 'blood-testis barrier' after injection of cadmium chloride in the rat.</a> Journal of Endocrinology. 47 (1), 81-86 (1970).</li>
<li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+central+role+of+Sertoli+cells+in+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The central role of Sertoli cells in spermatogenesis.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 9 (4), 411-416 (1998).</li>
<li>Cheng, C. Y., Mruk, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-testis+barrier+and+its+implications+for+male+contraception%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The blood-testis barrier and its implications for male contraception.</a> Pharmacological Reviews. 64 (1), 16-64 (2012).</li>
<li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+system+to+study+Sertoli+cell+blood-testis+barrier+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics.</a> Methods Molecular Biology. 763, 237-252 (2011).</li>
<li>Orth, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+of+Sertoli+cells+in+fetal+and+postnatal+rats%3A+a+quantitative+autoradiographic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study.</a> Anatomical Record. 203 (4), 485-492 (1982).</li>
<li>Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+cadherin%2Fcatenin+complex+a+functional+unit+of+cell-cell+actin-based+adherens+junctions+in+the+rat+testis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis?</a> Biology of Reproduction. 68 (2), 489-508 (2003).</li>
<li>Bai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Germline-Specific+Role+for+the+mTORC2+Component+Rictor+in+Maintaining+Spermatogonial+Differentiation+and+Intercellular+Adhesion+in+Mouse+Testis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis.</a> Molecular Human Reproduction. 24 (5), 244-259 (2018).</li>
<li>Korhonen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DICER+Regulates+the+Formation+and+Maintenance+of+Cell-Cell+Junctions+in+the+Mouse+Seminiferous+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium.</a> Biology of Reproduction. 93 (6), 139(2015).</li>
<li>Loir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trout+Sertoli+cells+and+germ+cells+in+primary+culture%3A+I.+Morphological+and+ultrastructural+study%5BTitle%5D)+AND+%22Gamete+Research%22%5BJournal%5D)">Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study.</a> Gamete Research. 24 (2), 151-169 (1989).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+Integrity+of+the+Blood-Testis+Barrier+%28BTB%29%3A+An+In+Vivo+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Spermatogenese vindt plaats in de seminiferous epitheel en is een zeer geordende en dynamisch proces, dat wordt beheerst door kiemcellen en somatische cellen (bijvoorbeeld, Sertoli cellen)13. De BTB-structuur, die is gebouwd door de Sertoli-cellen, verdeelt de seminiferous epitheel in een basale en een apicaal compartiment. De ontwikkeling van Meiotische en haploïde geslachtscellen treedt op in de apicale compartiment dat een immunologische barrière14 vormt</sup...

Zoogdieren spermatogenese wordt beschouwd als een zeer gestructureerde proces dat spermatogonia zelf-vernieuwing en differentiatie via spermatocyten in de haploïde spermacellen via mitose, meiose, en spermiogenesis, gedurende welke dramatische omvat biochemische en morfologische veranderingen optreden. Ontwikkelende geslachtscellen worden geleidelijk vervoerd vanaf de basis van de seminiferous zaadvormende richting de lumen. Dit proces wordt gereguleerd door cel contacten tussen kiemcellen en Sertoli cellen1,2. Aangrenzende Sertoli cellen vormen de BTB die zich in de buurt van de basis van de seminiferous zaadvormende bevindt. De BTB verdeelt fysiek het epithelium in een basale en een adluminal-compartiment. Tijdens fase VIII - IX van de epitheliale cyclus, migreren preleptotene/leptotene spermatocyten van de basale compartimenten over het BTB, de adluminal compartimenten3invoeren. Daarom wil de functie van het BTB bieden een immunoprivileged communicatie voor de voltooiing van de meiose en spermiogenesis4,5,6. In tegenstelling tot andere bloed-weefsel-barrières die (b.v., bloed - hersenbarrière) en dat alleen uit strakke kruispunten (TJs bestaat), wordt de BTB gevormd door vier verschillende kruispunten (TJs, ectoplasmic specialisaties kloof kruispunten en intermediair gloeidraad gebaseerde desmosomes) tussen Sertoli cellen1,7.
Vele studies hebben gebruikt genetisch gemodificeerde muizen, virusinfecties en toxische stoffen in het milieu te onderzoeken van de mechanismen van BTB integriteit7,8,9. De verstoring van de BTB induceert verminderde spermatogenese en subfertility of onvruchtbaarheid. Aangezien de BTB vorming en integriteit zijn bevestigd te worden beïnvloed door contacten tussen Sertoli cellen8, een in vitro model gebaseerd op de primaire cultuur van geïsoleerde Sertoli cellen is gebruikt voor BTB studie. Echter dit model kan niet nauwkeurig na te bootsen BTB dynamiek in vivo. Bovendien is geen dergelijke co cultuur van kiemcellen met Sertoli cellen opgezet als staat als gevolg van alle relevante structurele en functionele onderdelen van het BTB10,11.
In het algemeen, zijn in vivo de tests van de integriteit van het BTB meestal gebaseerd op kleine molecules, zoals EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotine en FITC-geconjugeerd inuline (inuline-FITC). Normaal gesproken, wordt de verspreiding van biotine of inuline-FITC van de basale compartiment geblokkeerd door BTB structuur. Daarom kunnen wij deze methode gebruiken om te beoordelen in welke mate van BTB schade in vergelijking met controlegroepen. Terwijl BTB kan worden aangetast met bepaalde soorten stimuli, zoals behandeling met cadmium chloride (CdCl2)12, wordt BTB toegankelijk voor kleine molecules, die uiteindelijk het compartiment van de adluminal als indicatoren invoeren.
Een vroege in vivo BTB integriteit bepaling houdt injecteren van biotine of inuline-FITC in de halsslagader, die houdt van chirurgie, en invasieve, ingewikkeld en tijdrovend. Bovendien, als de verslaggever stoffen door het hele lichaam via het verkeer verspreiden, de plaatselijke concentratie van biotine of inuline-FITC in de seminiferous buisjes is beperkt. Systemische blootstelling kan bovendien immuunreacties veroorzaken. Hier presenteren we een eenvoudige en effectieve in-vivo BTB integriteit assay directe injectie van een kleine hoeveelheid van de inuline-FITC in het interstitium van een testis inschakelen. Met behulp van de TL labeling methode, is de kleuring proces handig, als secundaire antilichamen niet vereist zijn. Hier is het proces van fluorescente kleurstof invoeren van de testis gevisualiseerd.

<table><tbody><tr><td>Capillary puller&nbsp;</td><td>SUTTER INSTRUMENT (USA)</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Hyclone (USA)</td><td>SH30258.01</td><td>dilutie tot 1&times; in ddH2O</td></tr><tr><td>4&rsquo;,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI)</td><td>Sigma (USA)</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Adhesie microscoopglazen</td><td>CITOGLAS (China)</td><td>80312-3161</td><td></td></tr><tr><td>Cadmium chloride</td><td>Sigma (USA)</td><td>655198-5G</td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Zeiss (Duitsland)</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>Stofvrij papier</td><td>Kimberly-Clark (USA)</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Inuline-FITC</td><td>Sigma (USA)</td><td>F3272</td><td></td></tr><tr><td>Microinjectie capillairen</td><td>Zhengtianyi (China)</td><td>BJ-40</td><td>1.0 mm &times; 0.8 mm&nbsp; &times; 100 mm</td></tr><tr><td>Micropipet beveler</td><td>NARISHIGE (JAPAN)</td><td>EG-400</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>SAKURA (JAPAN)</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma (USA)</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital natrium</td><td>Merck (Duitsland)</td><td>P11011</td><td></td></tr><tr><td>Shaver&nbsp;</td><td>Yashen (China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Nikon (JAPAN)</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose&nbsp;</td><td>Sangon Biotech (China)</td><td>A610498</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische instrumenten</td><td>Stronger (China)</td><td></td><td>schaar, pincet, naaldhouder</td></tr><tr><td>Spuit</td><td>KDL (China)</td><td>20163150518</td><td>0.45 mm &times; 0.16 mm RW LB</td></tr><tr><td>thermostaatverwarming</td><td>KELL (Nanjing, China)</td><td>KEL-2010</td><td></td></tr><tr><td>10x TBS, pH 7.6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 M Tris</td><td>Sangon Biotech (China)</td><td>A600194</td><td></td></tr><tr><td>1.37 M NaCl</td><td>Sangon Biotech (China)</td><td>A610476</td><td></td></tr></tbody></table>

een in vivo methode om te studeren muis bloed-testis barrière integriteit

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenese is de ontwikkeling van de testis tot volwassen spermacellen in de seminiferous tubuli van de testis. Dit proces wordt ondersteund door de Sertoli cell kruispunten op de bloed-testis barrière (BTB), die is de strakste barrière van het weefsel in het lichaam van zoogdieren en beveiligingsmethode de seminiferous epitheel in twee compartimenten, een basale en een adluminal. De BTB creëert een unieke communicatie voor kiemcellen in meiose I / II en voor de ontwikkeling van postmeiotic spermatids in spermacellen via spermiogenesis. Hier beschrijven we een betrouwbare test om te controleren van de integriteit van het BTB van muis testis in vivo. Een intact BTB blokkeert de verspreiding van FITC-geconjugeerd inuline uit de basale tot het apicale compartiment van de seminiferous buisjes. Deze techniek is geschikt voor de studie van gene kandidaten, virussen of milieu toxische stoffen die BTB functionaliteit of integriteit, met een eenvoudige procedure en een minimale vereiste voor chirurgische vaardigheden in vergelijking met alternatieve methoden kunnen beïnvloeden.

De experimentele opstelling voor het uitvoeren van de bepaling van BTB integriteit is afgebeeld in Figuur 1. Trek en verscherpen microinjection haarvaten met een capillaire trekker en micropipet beveler, respectievelijk (figuur 1A en 1 C). De thermostaat van de kachel en de apparatuur van microinjection worden geïllustreerd in figuur 1B en 1 D.
<p class="jove_con...

Hier presenteren we een protocol voor de beoordeling van de bloed-testis barrière integriteit door het injecteren van inuline-FITC in teelballen. Dit is een efficiënte in-vivo -methode om te studeren bloed-testis barrière integriteit die kan worden aangetast door genetische en omgevingsfactoren elementen.

Een In Vivo methode om te studeren muis bloed-Testis barrière integriteit

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de bloed-testis barrière van biologie velden over gen kandidaten, virussen, of milieu-toxines die van invloed kunnen zijn bloed-testis barrière functie of integriteit. Behandel drie dagen voor de operatie dagelijks ten minste drie acht weken oude C57Black/6 mannelijke muizen met een vijf milligram per kilogram lichaamsgewicht cadmiumchloride via intraperitoneale injectie. Op de dag van de operatie, plaats een schoon weefsel over een 75%ethanol gesteriliseerd chirurgisch gebied en stel een thermostatische kachel op 37 graden Celsius.Plaats een verdoofde muis op het weefsel en bevestig vervolgens een gebrek aan respons op teenknijpen. Scheer het buikhaar met een scheerapparaat en desinfecteer de blootgestelde huid met 75% ethanol. Maak een huidincisie van één centimeter boven de preputiale klieren om de buikwand bloot te stellen en gebruik kleine tangen om de huid op te tillen om een incisie van 0,5 centimeter in het buikvlies te maken.Gebruik de tangen om te zoeken naar vet pads rond de epididymis en testis, zorgvuldig trekken van de vetpads uit om een bijgevoegde testis bloot. Plaats een stuk papier van negen centimeter onder de vetpads en testis en laad een microinjectiepipet met vers bereide inuline-FITC-oplossing. Sluit de pipet aan op een micromanipulator-eenheid en gebruik een ontledende microscoop om de microinjectiepipetpunt voorzichtig onder de tunica albuginea te plaatsen.Draai de bedieningshendel langzaam om 20 microliter van de inuline-FITC in het interstitium van de testis te leveren. Als de levering succesvol is, zal de testis een felgroen-gele kleur. Breng de testis onmiddellijk terug naar de buikholte en injecteer de contralaterale testis met 20 microliter PBS en sluit de huid vervolgens met een chirurgische hechting.En plaats de muis op het verwarmingskussen van een thermostatische kachel. 40 minuten na de injectie, gebruik een scherpe schaar om de teelballen van elke muis te verzamelen en was de weefsels in een milliliter ijskoude PBS. Bevestig vervolgens de teelballen in 4%paraformaldehyde bij vier graden Celsius gedurende 12 tot 24 uur, gevolgd door drie wasbeurten in 1,5 milliliter van 1%PBS per wasbeurt.Na 30% sacharose uitdroging 's nachts, breng de monsters in individuele inbedding frames, en bedek de weefsels met een optimale snijtemperatuur verbinding. Stel de temperatuur van een cryostat in op negatieve 20 graden Celsius en plaats de frames ongeveer 10 minuten in de cryostat totdat de OKT is bevroren. Vul vervolgens elk inbeddingsframe met verse OCT totdat de hele testis in elke mal is bedekt.Wanneer de tweede laag OKT is bevroren, verwerven van een vijf-micrometer-dikke dwarsdoorsnedes van elke testis, het vastleggen van de weefselsecties op glazen microscoop dia's als ze worden verkregen. Als u de monsters wilt verbeelden, verwarmt u eerst de dia's in een bevochtigde doos bij kamertemperatuur. Na 10 minuten was je de glijbanen drie keer in verse Tris-gebufferde zoutoplossing per wasbeurt en laat je de secties vijf minuten drogen, beschermd tegen licht.Gebruik stofvrij papier om eventuele resterende zoutoplossing te verwijderen en monteer de monsters met dapi-supplementedrerend montagemedium. Bedek vervolgens elk monster met een omgekeerde cover slip, en beeld de monsters onder de 20X doelstelling van een confocale microscoop. Drie dagen cadmiumchloridebehandeling veroorzaakt schade aan de bloedtestisbarrière waardoor inuline-FITC diffusie van het basale compartiment naar het apicale compartiment van het halfniferous epitheel mogelijk wordt.Deze diffusie wordt daarentegen geblokkeerd in besturing met PBS-behandelde teelballen. De omvang van de schade aan de bloedtestenbarrière wordt bepaald door de verhouding van de afstand van de inuline-FITC diffusie tot de straal van dezelfde halfniferous tubuli te berekenen. Verder, de intacte bloed-testis barrière in heterozygoot Rictor floxed knock-out muizen blokken inuline diffusie over de barrière in de apical compartiment, terwijl de voorwaardelijke Rictor knock-out muizen beschikken over een gecompromitteerde bloed-testis barrière die het mogelijk maakt inuline diffusie.Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om inuline-FITC bereid op de dag van het experiment te leveren en om het weefsel beschermd tegen licht te houden, omdat FITC een lichtgevoelig molecuul is. De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot de therapie van verminderde spermatogenese omdat de functie van de bloedtestisbarrière is om een immuun-bevoorrechte micro-omgeving te bieden voor de voltooiing van meiose in spermatogenese. Na zijn ontwikkeling, verstrekt deze techniek een manier voor onderzoekers op het gebied van reproductieve geneeskunde om subvruchtbaarheid en onvruchtbaarheid in muizen te onderzoeken.Vergeet niet dat het werken met paraformaldehyden zeer gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van kleding en gezichtsmaskers altijd moeten worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.

an-in-vivo-method-to-study-mouse-blood-testis-barrier-integrity

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Een<em&gt; In vivo</em&gt; Assay naar Blood Vessel Permeabiliteit Test

Dit artikel beschrijft micro-injectie en elektroporatie van muis testis in vivo als een transfectie techniek voor testiculaire muizencellen unieke processen spermatogenese bestuderen. Het gepresenteerde protocol omvat stappen van glazen capillaire preparaat, micro-injectie via de efferente kanaal en transfectie door elektroporatie.

In vivo micro-injectie en elektroporatie of Mouse Testikel

We presenteren een protocol voor humane endotheliale pericyte-interacties in muizen te bestuderen onder toepassing van een variatie van de matrix gel plug angiogenese assay.

In vivo studie van humane endotheliale-pericyte Interaction Met behulp van de Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Twee methoden worden hier voorgesteld om te bepalen van intestinale barrièrefunctie. Een epitheliale meter (volt/ohm) wordt gebruikt voor metingen van de elektrische weerstand van de transepithelial van gekweekte epithelen rechtstreeks in weefselkweek wells. Bij muizen, wordt de FITC-dextran maagsonde methode gebruikt om te bepalen de intestinale permeabiliteit in vivo.

In Vitro en In Vivo benaderingen te bepalen van intestinale epitheliale cel permeabiliteit

Hier presenteren we een muis hersenen vasculaire permeabiliteit assay gebruik intraperitoneale injectie van fluorescerende traceurs gevolgd door perfusie die gelden voor dierlijke modellen van de bloed - hersenbarrière dysfunctie. Een hemi-hersenen wordt gebruikt voor het beoordelen van permeabiliteit kwantitatief en anderzijds voor tracer visualisatie/immunokleuring. De procedure duurt 5-6 h voor 10 muizen.

Een In Vivo bloed - hersenbarrière permeabiliteit Assay in muizen met behulp van Fluorescently label Tracers

Hier presenteren we een eCLIP protocol om de belangrijkste RNA doelen van RBP kandidaten in testis te bepalen.

Verbeterde crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) methode voor efficiënte identificatie van proteïne-verbindend RNA in muis testis

Gebruikmakend van intravitale microscopie, maakt de hier gepresenteerde methode real-time visualisatie van darmeppitheelcelvergieten bij levende dieren mogelijk. Daarom is geigreerd darmslijmvlies (acriflavine en rhodamineB-dextran) van verdoofde muizen afgebeeld tot eencellige resolutie met behulp van confocale microscopie.

Een intravitale microscopie-gebaseerde benadering om darmdoorlatendheid en epitheelcelvergieten prestaties te beoordelen

Dit protocol beschrijft transillumination-ondersteunde microdissectie van segmenten van volwassen muis seminifereuze tubuli die specifieke stadia van seminifereuze epitheelcyclus vertegenwoordigen, en celtypen daarin, en daaropvolgende immunostaining van squashpreparaten en intacte tubulussegmenten.

Transillumination-Assisted Dissectie van specifieke stadia van de muis seminifereuze epitheelcyclus voor downstream immunostaininganalyses

Dit artikel meldt een in vivo remming van CENP-E door middel van abdominale chirurgie en testiculaire injectie van GSK923295, een waardevol model voor mannelijke meiotische deling. Met behulp van de immunofluorescentie, flowcytometrie en transmissie-elektronenmicroscopietests tonen we aan dat CENP-E-remming resulteert in chromosoomafwijking en genoominstabiliteit in spermatocyten van muizen.

Functionele beoordeling van kinesine-7 CENP-E in spermatocyten met behulp van in vivo remming, immunofluorescentie en flowcytometrie

In dit protocol werd de endotheelbarrièrefunctie van de submandibulaire klier (SMG) geëvalueerd door verschillende moleculair gewogen fluorescerende tracers in vivo in de hoekaders van proefdiermodellen te injecteren onder een laserscanmicroscoop met twee fotonen.

In vivo Vasculaire permeabiliteitsdetectie bij submandibulaire klier van muizen

In deze studie wordt fluoresceïne-isothiocyanaat-gelabeld (FITC) dextran toegediend aan muizen via orale maagsonde om de intestinale permeabiliteit zowel in vivo als in plasma- en fecale monsters te evalueren. Omdat de darmbarrièrefunctie in veel ziekteprocessen wordt beïnvloed, kan deze directe en kwantitatieve test in verschillende onderzoeksgebieden worden gebruikt.

Beoordeling van de integriteit van de darmbarrière bij muizen met fluoresceïne-isothiocyanaat-gelabeld dextran

Leer een in vivo methode om de integriteit van de bloed-testis barrière te beoordelen met inulin-FITC injecties in muizen. Deze techniek helpt onderzoekers genetische en milieufactoren te bestuderen die de vruchtbaarheid beïnvloeden.

Een In Vivo methode om te studeren muis bloed-Testis barrière integriteit

Meer video's verkennen