Name: Gelijktijdige Cryosectioning van meerdere knaagdier hersenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Leer een tijdbesparende methode voor cryosectionering van meerdere knaagdierhersenen tegelijkertijd om variabiliteit in immunohistochemische kleuring te verminderen. Deze techniek optimaliseert anatomische visualisatie en verbetert consistentie in neuroscience onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

PCH missie steunfondsen ondersteund het onderzoek gemeld in dit manuscript. De auteurs bedank Daniel Griffiths voor het nemen van de beelden die worden gebruikt in de cijfers.

De Megabrain-techniek is geoptimaliseerd met behulp van geheel en hemisected hersenen van mannelijke volwassen C57Bl6 muizen5, jonge Sprague-Dawley ratten en volwassen Sprague-Dawley ratten die transcardially geperfundeerd met 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS waren) gevolgd door 4% paraformaldehyde6. Vergelijkbare uitkomsten kunnen worden bereikt in andere stammen van de muis en rat, in beide geslachten en op verschillende leeftijden. De studie voor het genereren van gegevens voor dit manuscript jonge Sprague-Dawley ratten gebruikt en is goedgekeurd door de Universiteit van Arizona institutionele dierenverzorgers en gebruik Comité, en proefdieren werden verzorgd volgens de gids voor de zorg en het gebruik van laboratorium Dieren7.
1. Cryoprotection van geperfundeerd hersenen
<ol><li>Volgende succesvolle transcardial perfusie6, de volledige hersenen6,8 van dieren te verzamelen en na oplossen door te plaatsen in een 25 mL flesje van 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 24 uur. Let op: Paraformaldehyde is een giftige weefsel fixatief; voorzichtig behandelen. Paraformaldehyde overboeken naar een specifiek gelabelde afval container waarmee zijn concentratie en het volume binnen een chemische zuurkast en klik vervolgens op te slaan in het chemisch afval kabinet totdat verwijderd door chemische veiligheid of goed opgeleid personeel.</li>
	<li>Na 24 uur is verstreken, in een zuurkast, verwijder hersenen uit 4% paraformaldehyde met behulp van een spatel. Breng de hersenen in een flesje van ongeveer 20 mL 15% sacharoseoplossing in 1 x Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) totdat de hersenen zinkt naar de bodem van de flacon (ongeveer 24 h).</li>
	<li>Daarop overbrengen in de hersenen een flesje ongeveer 20 ml 30% sacharoseoplossing in 1 x TBS, totdat de hersenen naar de bodem van de flacon (ongeveer 24-48 h zinkt).</li>
</ol>2. brain bevriezing
<ol><li>Plaats een bekerglas van 500 mL glas op een bedje van droog ijs in een ijsemmer. Giet 300 – 400 mL tolueen (2 methyl-butaan) in het bekerglas van glas.</li>
	<li>Laat de temperatuur van de tolueen te bereiken tussen-45 ° C en -50 ° C. Monitoren en onderhouden van deze temperatuurbereik met een thermometer, het constant gedurende de hele procedure te houden. Ervoor dat de temperatuur lezingen zijn genomen uit het midden van de oplossing, en niet tijdens het aanraken van de onderkant of zijkant van het bekerglas.</li>
	<li>Vul op de benchtop, een wegwerp schimmel te embedding (zie lijst van de materialen) ongeveer 1/2 vol met optimale snijden temperatuur (OCT; Zie Tabel van materialen) Compound. Ervoor zorgen dat er geen luchtbellen in de LGO. Als er luchtbellen verwijderen met een spatel of naald.</li>
	<li>
De eerste hersenen uit de flacon van 30% sucrose verwijderen met een spatel. Op dit punt, bevriezen ofwel hersenen geheel of hemisect, afhankelijk van het ontwerp van de studie.
	<ol>
<li>Gebruik voor hemisected de hersenen, een nieuwe scheermesje te maken van een schoon gesneden door het weefsel te scheiden van de hemisferen. Als niet vereist voor de studie, verwijdert u het cerebellum en de bulbus bollen in dit stadium. Als het cerebellum nodig is voor de studie, wordt voorgesteld om te snijden een vlak stuk posterieure eind van de hersenen om hulp van de hersenen in staande recht in de mal. Als de studie alleen weefsel van een gelokaliseerde regio vereist, kan een knaagdier hersenen-matrix worden gebruikt voor het blokkeren van de hersenen op basis van bekende coördinaten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Geven de hersenen een numeriek systeem naamgeving. Teken een diagram zoals afgebeeld in Figuur 1. Schrijf het nummer van de eerste hersenen worden geplaatst in de mal van de Megabrain in positie 2, positie 1 verlaten als een spatie om te helpen bij een snelle identificatie van de richting waarin de hersenen waren bevroren.</li>
	<li>Met behulp van botte pincet of pincet, halen de hersenen in positie 1 worden geplaatst. Oriënteren op de hersenen met de kant te snijden eerste naar boven. De hersenen in de LGO in de juiste locatie, met behulp van het pincet te zijn positie aanpassen tot het lager onafhankelijk staat.</li>
	<li>Herhaal stap 2.3-2.5 voor de resterende hersenen/hemisferen worden bevroren in posities 3 – 10. Vermijd plaatsing hersenen/hemisferen in een symmetrische indeling.</li>
	<li>Bekijk alle 9 hersenen in de Megabrain schimmel. Zodra de hersenen staan zelfstandig rechtop, en goed georiënteerd in de LGO (zoals weergegeven in figuur 2B), toevoegen meer OCT aan de mal (tot de bovenkant van de hersenen vallen). Opnieuw, ervoor zorgen dat er geen zichtbare luchtbellen in de LGO.</li>
	<li>Gebruik het pincet te houden van de hoek van de mal, ervoor te zorgen dat de verlostang doen niet gedeeltelijk worden ondergedompeld in de LGO (figuur 3A). Voorzichtig om te houden van het niveau van de schimmel, lager de mal in de tolueen (-45 ° C tot-50 ° C) zodat het onderste derde van de mal is ondergedompeld. Houd het hier om eventuele luchtbellen in de LGO te stijgen naar de oppervlakte en weg van het weefsel (figuur 3B).</li>
	<li>Na 30 s, lagere de hele schimmel in het tolueen en de introductie van de verlostang, waardoor de Megabrain ondergedompeld gedurende ten minste 3 minuten (Figuur 3 c). Verzekert dat schimmel is niveau, zodat de hersenen blijven rechtop en equidistante (figuur 3D).</li>
	<li>Gebruik het pincet te verwijderen van de schimmel met de bevroren, OCT ingesloten na 3 min, hersenen (figuur 3E) van de tolueen.</li>
	<li>Onmiddellijk, de schimmel en de inhoud ervan wikkel in aluminiumfolie en geef deze het label met de dierlijke cijfers of Megabrain identificatie. Raak de bevroren Megabrain zo spaarzaam mogelijk om te voorkomen dat het ontdooien van het weefsel.</li>
	<li>Deze Megabrain kan nu worden overgedragen naar een vriezer van-20 ° C en opgeslagen gedurende ten minste 24 h. Opmerking: Protocol kan hier worden onderbroken en de Megabrain kan worden opgeslagen bevroren totdat cryosectioning plaatsvindt.</li>
</ol>3. voorbereiding van de Megabrain voor het segmenteren op de cryostaat
<ol><li>Het kabinet temperatuur van de cryostaat instellen tot-19 ° C. Zorg ervoor dat deze temperatuur wordt bereikt voordat u verdergaat. In de gehele afdelen, zorgen dat de temperatuur in de kast tussen-18 ° C en -20 ° C. blijft</li>
	<li>Neem de Megabrain uit de diepvries van-20 ° C en plaats het in de cryostaat. Plaats ook een klauwplaat van de afmetingen van de juiste grootte, en twee dunne omver te werpen schilderskwast in de cryostaat. Laat de Megabrain zowel de chuck in de cryostaat gedurende ten minste 15 minuten om te komen tot de temperatuur van de cryostaat.</li>
	<li>Label dia's op de juiste manier met het identificatienummer van de Megabrain en het dianummer. Leg deze dia's op een dia warmer (35-45 ° C).</li>
	<li>Het uitpakken van de Megabrain van de aluminiumfolie. Gebruik een scheermesje te snijden verticaal de hoeken van de schimmel makkelijk verwijderen van het blok van LGO worden toegestaan van de schimmel (figuur 4A).</li>
	<li>Afzien van een dunne laag (ongeveer 3 mm dik) van LGO op de chuck.</li>
	<li>Snel, met minimale contact tussen de vingers en de LGO, plaats u de Megabrain op de chuck, in de gewenste richting. Grote pincet kan ook worden gebruikt voor deze stap te minimaliseren ontdooien. Voordat u begint met de sectie, laat de Megabrain gemonteerd chuck in de cryostaat gedurende 15-20 minuten om de LGO's naar het volledig bevriezen.</li>
	<li>Zodra de basislaag van LGO heeft bevroren, breng een dikke laag van 2 mm OCT rond de zijkanten van de Megabrain en laten uitvoeren naar beneden vanaf de zijkanten op de chuck. Dit helpt beveiligen van de Megabrain naar de chuck. Nogmaals, voordat u verdergaat, laat de chuck Megabrain gemonteerd in de cryostaat gedurende 15-20 minuten om de LGO te bevriezen.</li>
	<li>Gebruik een scheermesje te verwijderen alle overtollige OCT van de partijen of de onderkant van de chuck (figuur 4B).</li>
</ol>4. Cryosectioning de Megabrain
<ol><li>Voordat u begint, zorg ervoor dat een bekerglas van ten minste 20 mL 1 x PBS toegankelijk.</li>
	<li>Plaats de chuck, gemonteerd met de Megabrain, in het hoofd van de chuck op de cryostaat (figuur 4B).</li>
	<li>Stel de cryostaat te snijden op de gewenste dikte. De huidige methode is geoptimaliseerd voor 10 µm tot 50 µm secties.</li>
	<li>Trim de LGO en weefsel zoals die nodig zijn voor het bereiken van de gewenste hersenen regio voor weefsel collectie (figuur 4C).</li>
	<li>Als u klaar bent voor het verzamelen van weefsel, de anti-roll plaat verlagen, totdat het rust op het podium en draai aan de hendel van de cryostaat te nemen van één afdeling. Langzaam til van de anti-roll plaat, voorzichtig dat de verdeelde Megabrain niet is gekoppeld aan de plaat van de anti-roll en niet naast het podium Figuur 4 d valt).</li>
	<li>Zachtjes kunt de schilderskwast uitrollen van de Megabrain-sectie totdat het ligt plat op het podium van de cryostaat (figuur 5A). (Indien nodig, houd de LGO plat met behulp van de verfborstels ter voorkoming van rollen).</li>
	<li>Dia verwijderen uit dia warmer en beweeg de dia, de labelkant omlaag, over de Megabrain-sectie in het werkgebied de sectie vast te houden aan de dia toe te staan.</li>
	<li>Snel een daling van 1 x PBS van toepassing op elke weefselsectie op de dia en laat dit drogen totdat ze hebben platte geborsteld niet (zie stap 4.9).</li>
	<li>Gebruik een fijne omver te werpen verfkwast gedipt in 1 x PBS borstel uit alle bubbels in het weefsel te ontvouwen van het weefsel, dus het ligt plat op de dia (figuur 5B). Wees voorzichtig niet te veranderen van de positie van de secties van de hersenen en dus verliest de relatieve positie naar de andere weefselsecties. Manipuleren van het weefsel zorvuldig te vermijden van tranen. Houd hersenen secties uit de buurt van de randen van de dia, zoals perifere ruimte benodigd voor een dekglaasje aan PAP pen in sommige kleuring protocollen is.</li>
	<li>Plaats de dia weer op de dia warmer en droog zijn voor 45 min. Cover zo nodig om te voorkomen dat stof afwikkeling op het weefsel. Eenmaal droog, slaat u de dia's in bij-80 ° C tot verder gebruik.</li>
</ol>

<ol><li>Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+markers+for+quantitative+studies+of+neurons+and+glia+in+human+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).</li>
<li>Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+in+immunohistochemistry.+A+research+method+or+a+diagnostic+tool+in+surgical+pathology%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Pathologica%22%5BJournal%5D)">Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology?</a> Pathologica. 87 (3), 300-309 (1995).</li>
<li>Walker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods%2C+utility+and+semiquantitative+assessment+I%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I.</a> Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).</li>
<li>Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+for+immunohistochemistry+on+cryosectioned+rat+brain+tissue%3A+example+staining+for+microglia+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).</li>
<li>Harrison, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolvins+AT-D1+and+E1+differentially+impact+functional+outcome%2C+post-traumatic+sleep%2C+and+microglial+activation+following+diffuse+brain+injury+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li>
<li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+bioscience+research+reporting%3A+the+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> PLoS Biology. 8 (6), e1000412(2010).</li>
<li>Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+removing+the+brain+and+spinal+cord+as+one+unit+from+adult+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats.</a> Lab Animal (NY). 40 (2), 53-57 (2011).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protocols. 2008, pdb prot4986 (2008).</li>
<li>Ji, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Impact+of+Repeated+Freeze-Thaw+Cycles+on+the+Quality+of+Biomolecules+in+Four+Different+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreservation+and+Biobanking%22%5BJournal%5D)">The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues.</a> Biopreservation and Biobanking. 15 (5), 475-483 (2017).</li>
<li>Pegg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+and+principles+of+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Reproductive+Medicine%22%5BJournal%5D)">The history and principles of cryopreservation.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 20 (1), 5-13 (2002).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen informatieverschaffing.

Dit moet worden beschouwd tijdens deze procedure dat de temperatuur van de Megabrain en de omgeving moet voortdurend worden gecontroleerd om te voorkomen dat ontdooien en weer bevriezen van het weefsel. De hersenen kan alleen worden verwijderd uit de diepvries van-20 ° C tot aan 3 keer als telkens als het wordt aangeraakt en links in de cryostaat, met een warmere wisselende temperatuur, het weefsel ontdooit en refreezes, waardoor een gelei als textuur en abnormale weefsel integriteit10. Daarom is ...

Hier presenteren we het protocol voor een nieuwe methode, die wij Megabrain noemen, ontwikkeld om meerdere knaagdier gelijktijdig voor downstream immunohistochemische procedures hersenen cryosection. Een Megabrain zorgt voor de productie van afzonderlijke dia's met weefsel van meerdere dieren. Deze techniek is geoptimaliseerd voor het knippen van coronale secties uit 9 volwassen ratten hemisferen, of 5 volwassen volledige hersenen, tegelijkertijd. De techniek is daarom meest toepasselijke in grote immunohistochemische studies of andere analyses gedaan op dia gemonteerde hersenweefsel van een grote cohort van dieren.
Immunohistochemistry impliceert het gebruik van specifieke antilichamen gericht tegen proteïnen van belang om te begrijpen en karakteriseren van hun expressie en cellulaire veranderingen in specifieke weefsel1,2,3. Het gebruik van immunohistochemistry heerst in onderzoek neurowetenschap, onder andere wetenschappelijke disciplines, helpend in het cellulaire en moleculaire begrip van de hersenen-4. Grootschalige studies waarbij veel dieren en delen van de hersenen kunnen zowel de resource en de tijd intensief zijn. Als zodanig, is er een veelzijdig grondgedachte achter de ontwikkeling van het Megabrain: om tijd doorgebracht cryosectioning, montage en kleuring van weefsel, tijdens het gebruik bijgevolg minder reagentia. Bovendien is de mogelijkheid om het proces te stroomlijnen en vlek meerdere hersenen in dezelfde ronde draagt bij tot verlichting van enkele van de variabiliteit tussen de partijen, een beperking van immunohistochemistry3kleuring. Daarnaast segmenteren van een Megabrain is een tijdbesparende alternatief voor het segmenteren van individuele bevroren knaagdier hersenen en zorgt voor een snelle vergelijking van weefsel tussen dieren of zelfs behandelgroepen door microscopie technieken.

<table><tbody><tr><td>Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-65</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-41</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-128</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 20 mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-23</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose, poly bottle 2.5 kg</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2-212</td><td>Zowel 15% als 30% sucroseconcentraties moeten worden gemaakt.</td></tr><tr><td>2-Methylbutaan (gecertificeerd), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3551-4</td><td></td></tr><tr><td>PYREX Tall-Form Beakers</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-546E</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50 to +50 &deg;C)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-201-642</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp;Scoopula Spatula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>STANLEY Razor Blade</td><td>Grainger</td><td>4A807</td><td></td></tr><tr><td>Edge-Rite Microtome blades</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-070-60</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides (1" frost) - white</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-034-979</td><td></td></tr><tr><td>Gibco&nbsp;PBS (Phosphate Buffered Saline) 10x, pH 7.2</td><td>Fisher Scientific</td><td>70-013-032</td><td>Verdun voor gebruik tot 1X&nbsp;</td></tr><tr><td>15 stuks fijne penselen</td><td>Amazon</td><td>B079J12ZRV</td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>Chuck getoond in figuur 4 is op maat gemaakt door een laborant, maar vergelijkbare maten zijn commercieel verkrijgbaar bij andere bedrijven.</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>EMS065</td><td></td></tr></tbody></table>

gelijktijdige cryosectioning van meerdere knaagdier hersenen

Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains

Histologie en immunohistochemistry zijn routine analysemethoden te visualiseren van microscopische anatomie en lokaliseren van eiwitten in biologische weefsels. In neurowetenschap, evenals een overvloed van andere wetenschappelijke disciplines, worden deze technieken gebruikt. Immunohistochemistry kan worden gedaan op dia gemonteerd weefsel of de zwevende delen. Voorbereiding van monsters dia gemonteerde is een intensief proces van tijd. Het volgende protocol voor een techniek, genaamd de Megabrain, verminderd de tijd genomen om cryosection en mount hersenweefsel door tot 90% door het combineren van meerdere hersenen in een enkele diepgevroren blok. Bovendien, deze techniek verminderd variabiliteit tussen de rondes, in een grote histochemische studie kleuring gezien. De huidige techniek is geoptimaliseerd voor het gebruik van knaagdier hersenweefsel in downstream immunohistochemische analyses; echter kan het worden toegepast op verschillende wetenschappelijke gebieden die gebruikmaken van cryosectioning.

Een positief eindresultaat voor deze procedure is weefsel dat ligt plat op de dia, met geen blaasjes of tranen, in de richting waarin ze werden bevroren. Weefselsecties zijn gelijkmatig uit elkaar en herkenbaar als gevolg van goede plaatsing van de hersenen in de LGO en de goede notatie zoals aangetoond in Figuur 1. Ervan uitgaande dat het hersenweefsel werd bijeengezocht uit dieren van dezelfde leeftijd, en dat het weefsel was correct wordt uitgelijnd in de ...

Hier presenteren we een protocol om te bevriezen en afdeling hersenweefsel van meerdere dieren als een tijdbesparende alternatief voor één hersenen verwerken. Dit vermindert kleuring variabiliteit tijdens immunohistochemistry en vermindert de tijd cryosectioning en beeldvorming.

Gelijktijdige Cryosectioning van meerdere knaagdier hersenen

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In ...

Deze tijdbesparende methode vermindert de variabiliteit tussen rondes van immunohistochemische procedures in neurowetenschappelijke studies om de visualisatie van anatomie en lokale eiwitten en weefsel te optimaliseren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het vermindert de tijd die nodig is om cryosection en monteren hersenweefsel door het combineren van meerdere hersenen in een enkele bevroren blok. Terwijl deze techniek is geoptimaliseerd voor coronale secties van knaagdier hersenen, het kan worden aangepast aan sagittale of dwarse secties of verschillende soorten weefsels zoals spier of lever.Na een succesvolle transcardiale perfusie, post-fix de hersenen van de dieren in een 25 milliliter flacon van 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 24 uur. Gebruik hierna stompe fkrachten om de hersenen uit het paraformaldehyde te verwijderen. Breng de hersenen over naar een flesje met ongeveer 20 milliliter van 30% sacharose oplossing in TBS.Houd de hersenen en oplossing totdat ze zinken naar de bodem van de flacon. Plaats vervolgens een 500 milliliter glazen beker op een bedje van droog ijs in een ijsemmer. Giet vervolgens 300 tot 400 milliliter isopentane in het bekerglas.Houd de isopentane tussen negatieve 45 en negatieve 50 graden Celsius. Op de bank top, vul een wegwerp inbedding schimmel ongeveer halverwege vol met optimale snijtemperatuur of OCT verbinding. Gebruik een naald om eventuele luchtbellen te verwijderen uit de mal.Gebruik de stompe getipte tangen om de eerste hersenen uit de sacharoseoplossing te verwijderen. Gebruik vervolgens een nieuw scheermesje om het cerebellum en de reuklampen te verwijderen voordat u de hemisrond scheidt. Geef de hersenen vervolgens een numeriek naamgevingssysteem.Gebruik stompe tangen, pak de hersenen te worden geplaatst in positie twee, en oriënteren met de zijkant te worden gesneden eerst naar boven gericht. Laat de hersenen in de OKT zakken en gebruik de pincet om zijn positie aan te passen totdat deze onafhankelijk staat. Een belangrijke wijziging van deze techniek is de lege ruimte in positie één.Deze ruimte is aangewezen om een eenvoudige identificatie van de megabrain oriëntatie mogelijk te maken en daarom het dier te identificeren dat aan elk brein is geassocieerd. Nadat alle hersenen zijn geplaatst in de mal, voeg voldoende OKT om de toppen van de hersenen te dekken, gebruik dan een naald om eventuele luchtbellen te verwijderen. Houd de hoek van de mal met tangen ervoor te zorgen dat de tangen niet gedeeltelijk ondergedompeld in de LGO.Dan, lager de mal in de isopentane, zodat de onderste derde van de mal wordt ondergedompeld. Na 30 seconden, laat de hele mal in de isopentane en laat het van de tangen. Na drie minuten, gebruik maken van de tang om de mal te verwijderen uit de isopentane.Wikkel onmiddellijk de mal en de inhoud ervan in aluminiumfolie en label het op de juiste manier. Breng de megabrain voor minimaal 24 uur over in een negatieve vriezer van 20 graden Celsius. Stel eerst de temperatuur van de cryostatkast in op negatieve 19 graden Celsius.Haal het megabrein uit de vriezer en leg het in de cryostat. Plaats dan een chuck en twee dunne getipte kwasten in de cryostat. Label hierna de dia's met het megabrein identificatienummer en het schuifnummer en leg de dia's op de diawarmer.Vervolgens, uitpakken van de megabrain en gebruik een scheermesje om de hoeken van de mal te snijden. Doe een dun laagje OCT op de chuck. Plaats dan snel de megabrain op de chuck.Nadat de OCT volledig bevroren is, breng je een twee millimeter laag OCT aan rond de zijkanten van het megabrein en laat het langs de zijkanten op de klem lopen. Gebruik een scheermesje om overtollige OCT te verwijderen van de zijkanten en onderkant van de chuck. Ten eerste, plaats de chuck gemonteerd met de megabrain op de chuck hoofd van de cryostat.Zet vervolgens de cryostat op de gewenste dikte. Trim de OKT en weefsel als dat nodig is om de gewenste hersenregio voor weefselverzameling te bereiken. Laat vervolgens de anti-rolplaat zakken totdat deze op het podium rust en draai de cryostat-handgreep om een enkele sectie te nemen.Til langzaam de anti-rolplaat op, voorzichtig dat de weefselsectie niet wordt aangeraakt. Gebruik voorzichtig de kwasten om de weefselsectie uit te rollen totdat het plat ligt. Houd indien nodig de OCT plat met behulp van de kwasten om rollen te voorkomen.Verwijder vervolgens de schuif van de diawarmer en beweeg de schuiflabelzijde naar beneden over het megabreingedeelte en laat deze aan de dia kleven. Breng snel een druppel PBS aan op de weefselsectie. Met behulp van een fijne getipte penseel gedoopt in PBS, borstel uit alle bubbels in het weefsel sectie en ontvouwen het weefsel, zodat het plat op de glijbaan ligt.Tot slot, plaats de dia op de dia warmer te drogen voor 45 minuten en bewaar de dia op negatieve 80 graden Celsius. In dit protocol werden hersenweefsel van negen dieren tegelijkertijd voorbereid en cryosectioned. Na cryosectioning kan H&E-kleuring worden uitgevoerd om de cryoprotectiekwaliteit te beoordelen.Representatieve resultaten van geïoniseerde calcium binding adapter molecuul een of Iba1 kleuring van microglia tonen consistente vlekken tussen elke studie hersenen op een enkele megabrain. Tijdens een poging deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om voortdurend toezicht op de temperatuur tijdens het bevriezen van de megabrain om te voorkomen dat kraken of ontdooien en vervolgens opnieuw invriezen van het weefsel wat leidt tot abnormale weefselintegriteit. Het wordt afgeraden om verschillende behandelingsgroepen in afzonderlijke megahersenen te scheiden, omdat dit variantie tussen groepen tijdens het beitsen kan creëren en bias en subjectiviteit tijdens beeldvorming en analyse kan verminderen.Vergeet niet dat het werken met paraformaldehyde zeer gevaarlijk kan zijn en voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van PBE en het werken in een kap moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

simultaneous-cryosectioning-of-multiple-rodent-brains

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

RNA-expressieprofilering van specifieke hersenregio's bij muizen vereist een nauwkeurige en reproduceerbare strategie voor weefselverzameling. Hier wordt een protocol beschreven dat gebruikmaakt van zowel coronale hersensecties als microdissectie met behulp van een weefselpons. De opbrengst en kwaliteit van het totale RNA dat uit de resulterende monsters is verkregen, bevestigen het nut van de beschreven methode.

Niet-Laser Capture Microscopie Aanpak voor de Microdissection van Discrete Mouse Brain Regio&#39;s voor Totaal RNA isolatie en Downstream next-generation sequencing en Gene Expression Profiling

We beschrijven de procedures voor de voorbereiding en elektrofysiologische opname van de hersenen plakken dat de dorsale-ventrale as van de mediale entorhinale cortex (MEC) te handhaven. Omdat neurale codering van de locatie volgt een rug-buik organisatie binnen de MEC, deze procedures te vergemakkelijken onderzoek van cellulaire mechanismen van belang voor de navigatie en het geheugen.

Voorbereiding van Parasagittal Slices voor onderzoek naar Dorsale-ventrale Organisatie van het knaagdier Medial entorhinale cortex

This video demonstrates a detailed step-by-step protocol for preparing frozen mouse brain tissue sections for downstream analyses.

Processing of a Mouse Brain for Downstream Analysis

Dit protocol beschrijft elementaire procedurele stappen voor het uitvoeren van whole-cell patch-clamp opnames. Deze techniek maakt het onderzoek mogelijk van het elektrisch gedrag van neuronen, en wanneer uitgevoerd in hersencoupes, kan worden nagegaan of verschillende neuronale functies van neuronen die nog geïntegreerd in goed behouden hersenen circuits.

Whole-cell patch-clamp opnamen in Brain Slices

Opeenvolgende cryo-secties verzameld histologische toepassingen en verrijking van RNA voor genexpressie metingen met aangrenzende gebieden van een enkele muis skeletspier schakelen. Hoogwaardige RNA wordt verkregen 20-30 mg samengevoegd vriescoupes en metingen worden direct vergeleken verschillende applicaties.

Cryosectioning aaneengesloten Regio&#39;s van een enkele muis skeletspieren voor Gene Expression en histologische Analyses

Hier bieden we een goedkope en betrouwbare methode voor het genereren van electroporated brein organotypic segment culturen van muis embryo's geschikt voor confocale microscopie en live-imaging technieken.

Ex Utero Electroporation en Organotypic Slice culturen van muis embryonale hersenen voor Live-Imaging van GABAergic interneuronen migreren

Deze procedure beschrijft de verzameling van discrete bevroren hersengebieden om hoogwaardige eiwitten en RNA te verkrijgen met behulp van goedkope en algemeen beschikbare tools.

Verzameling van bevroren knaagdierhersengebieden voor downstreamanalyses

We presenteren een hands-on, stap-voor-stap, snel protocol voor het verwijderen en ontleden van discrete gebieden van vers hersenweefsel bij muizen. Het verkrijgen van hersengebieden voor moleculaire analyse is routine geworden in veel neurowetenschappelijke laboratoria. Deze hersengebieden worden onmiddellijk bevroren om transcriptomische gegevens van hoge kwaliteit te verkrijgen voor analyse op systeemniveau.

Microdissectie van muizenhersenen in functioneel en anatomisch verschillende regio's

Het huidige protocol beschrijft een gestandaardiseerde resectie van hersentumoren bij knaagdieren door middel van een minimaal invasieve aanpak met een geïntegreerd weefselbehoudsysteem. Deze techniek heeft implicaties voor het nauwkeurig spiegelen van de zorgstandaard in knaagdier- en andere diermodellen.

Implementatie van minimaal invasieve hersentumorresectie bij knaagdieren voor weefselverzameling met hoge levensvatbaarheid

Het huidige protocol beschrijft een praktische strategie om de verificatiestap van stereotaxische injectiecoördinaten te versnellen voordat virale tracering wordt uitgevoerd met behulp van kleurstoffen en bevroren secties.

Voorlopige validatie van stereotaxische injectiecoördinaten via cryosectie

Moderne neurowetenschappen moeten verschillen onderzoeken tussen veel soorten, waaronder laboratoriumknaagdieren en mensen. Toch ontstaan er technische problemen wanneer groothersenzoogdieren betrokken zijn. Deze benadering richt zich op intersoortelijke variatie van neuronale populaties bij zeer verschillende zoogdieren, wat vergelijkbare resultaten oplevert die in kaart kunnen worden gebracht om evolutionaire patronen te onthullen.

Een vergelijkende benadering voor kwantitatieve celtellingsstudies in zeer verschillende zoogdierhersenen

Leer een tijdbesparende methode voor cryosectionering van meerdere knaagdierhersenen tegelijkertijd om variabiliteit in immunohistochemische kleuring te verminderen. Deze techniek optimaliseert anatomische visualisatie en verbetert consistentie in neuroscience onderzoek.

Gelijktijdige Cryosectioning van meerdere knaagdier hersenen

Meer video's verkennen