Gelijktijdige Cryosectioning van meerdere knaagdier hersenen

Deze tijdbesparende methode vermindert de variabiliteit tussen rondes van immunohistochemische procedures in neurowetenschappelijke studies om de visualisatie van anatomie en lokale eiwitten en weefsel te optimaliseren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het vermindert de tijd die nodig is om cryosection en monteren hersenweefsel door het combineren van meerdere hersenen in een enkele bevroren blok. Terwijl deze techniek is geoptimaliseerd voor coronale secties van knaagdier hersenen, het kan worden aangepast aan sagittale of dwarse secties of verschillende soorten weefsels zoals spier of lever.

Na een succesvolle transcardiale perfusie, post-fix de hersenen van de dieren in een 25 milliliter flacon van 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 24 uur. Gebruik hierna stompe fkrachten om de hersenen uit het paraformaldehyde te verwijderen. Breng de hersenen over naar een flesje met ongeveer 20 milliliter van 30% sacharose oplossing in TBS.

Houd de hersenen en oplossing totdat ze zinken naar de bodem van de flacon. Plaats vervolgens een 500 milliliter glazen beker op een bedje van droog ijs in een ijsemmer. Giet vervolgens 300 tot 400 milliliter isopentane in het bekerglas.

Houd de isopentane tussen negatieve 45 en negatieve 50 graden Celsius. Op de bank top, vul een wegwerp inbedding schimmel ongeveer halverwege vol met optimale snijtemperatuur of OCT verbinding. Gebruik een naald om eventuele luchtbellen te verwijderen uit de mal.

Gebruik de stompe getipte tangen om de eerste hersenen uit de sacharoseoplossing te verwijderen. Gebruik vervolgens een nieuw scheermesje om het cerebellum en de reuklampen te verwijderen voordat u de hemisrond scheidt. Geef de hersenen vervolgens een numeriek naamgevingssysteem.

Gebruik stompe tangen, pak de hersenen te worden geplaatst in positie twee, en oriënteren met de zijkant te worden gesneden eerst naar boven gericht. Laat de hersenen in de OKT zakken en gebruik de pincet om zijn positie aan te passen totdat deze onafhankelijk staat. Een belangrijke wijziging van deze techniek is de lege ruimte in positie één.

Deze ruimte is aangewezen om een eenvoudige identificatie van de megabrain oriëntatie mogelijk te maken en daarom het dier te identificeren dat aan elk brein is geassocieerd. Nadat alle hersenen zijn geplaatst in de mal, voeg voldoende OKT om de toppen van de hersenen te dekken, gebruik dan een naald om eventuele luchtbellen te verwijderen. Houd de hoek van de mal met tangen ervoor te zorgen dat de tangen niet gedeeltelijk ondergedompeld in de LGO.

Dan, lager de mal in de isopentane, zodat de onderste derde van de mal wordt ondergedompeld. Na 30 seconden, laat de hele mal in de isopentane en laat het van de tangen. Na drie minuten, gebruik maken van de tang om de mal te verwijderen uit de isopentane.

Wikkel onmiddellijk de mal en de inhoud ervan in aluminiumfolie en label het op de juiste manier. Breng de megabrain voor minimaal 24 uur over in een negatieve vriezer van 20 graden Celsius. Stel eerst de temperatuur van de cryostatkast in op negatieve 19 graden Celsius.

Haal het megabrein uit de vriezer en leg het in de cryostat. Plaats dan een chuck en twee dunne getipte kwasten in de cryostat. Label hierna de dia's met het megabrein identificatienummer en het schuifnummer en leg de dia's op de diawarmer.

Vervolgens, uitpakken van de megabrain en gebruik een scheermesje om de hoeken van de mal te snijden. Doe een dun laagje OCT op de chuck. Plaats dan snel de megabrain op de chuck.

Nadat de OCT volledig bevroren is, breng je een twee millimeter laag OCT aan rond de zijkanten van het megabrein en laat het langs de zijkanten op de klem lopen. Gebruik een scheermesje om overtollige OCT te verwijderen van de zijkanten en onderkant van de chuck. Ten eerste, plaats de chuck gemonteerd met de megabrain op de chuck hoofd van de cryostat.

Zet vervolgens de cryostat op de gewenste dikte. Trim de OKT en weefsel als dat nodig is om de gewenste hersenregio voor weefselverzameling te bereiken. Laat vervolgens de anti-rolplaat zakken totdat deze op het podium rust en draai de cryostat-handgreep om een enkele sectie te nemen.

Til langzaam de anti-rolplaat op, voorzichtig dat de weefselsectie niet wordt aangeraakt. Gebruik voorzichtig de kwasten om de weefselsectie uit te rollen totdat het plat ligt. Houd indien nodig de OCT plat met behulp van de kwasten om rollen te voorkomen.

Verwijder vervolgens de schuif van de diawarmer en beweeg de schuiflabelzijde naar beneden over het megabreingedeelte en laat deze aan de dia kleven. Breng snel een druppel PBS aan op de weefselsectie. Met behulp van een fijne getipte penseel gedoopt in PBS, borstel uit alle bubbels in het weefsel sectie en ontvouwen het weefsel, zodat het plat op de glijbaan ligt.

Tot slot, plaats de dia op de dia warmer te drogen voor 45 minuten en bewaar de dia op negatieve 80 graden Celsius. In dit protocol werden hersenweefsel van negen dieren tegelijkertijd voorbereid en cryosectioned. Na cryosectioning kan H&E-kleuring worden uitgevoerd om de cryoprotectiekwaliteit te beoordelen.

Representatieve resultaten van geïoniseerde calcium binding adapter molecuul een of Iba1 kleuring van microglia tonen consistente vlekken tussen elke studie hersenen op een enkele megabrain. Tijdens een poging deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om voortdurend toezicht op de temperatuur tijdens het bevriezen van de megabrain om te voorkomen dat kraken of ontdooien en vervolgens opnieuw invriezen van het weefsel wat leidt tot abnormale weefselintegriteit. Het wordt afgeraden om verschillende behandelingsgroepen in afzonderlijke megahersenen te scheiden, omdat dit variantie tussen groepen tijdens het beitsen kan creëren en bias en subjectiviteit tijdens beeldvorming en analyse kan verminderen.

Vergeet niet dat het werken met paraformaldehyde zeer gevaarlijk kan zijn en voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van PBE en het werken in een kap moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.