Inductie en evaluatie van inteelt kruisen met behulp van de mier, Vollenhovia Emeryi

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de moleculaire biologie en genetische sferen van Hymenoptera, zoals geslachtsbepalingssystemen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we gemakkelijk inteeltlijnen kunnen opwekken over de mier Vollenhovia Emery, die essentieel zijn voor genetische mapping en de moleculaire status. Dus, deze missie kan inzicht geven in het geslacht bepaling systeem van een specifieke mier en het kan ook worden toegepast op andere mieren en andere Hymenoptera soorten, zoals wespen.

Om te beginnen met het protocol, verzamelen V.Emeryi kolonies in de vroege zomer. Breng de mierenexemplaren van de verzamelde takken met behulp van een aspirator over naar een kunstmatig gipsen nest met een glazen deksel. Houd de kolonies in het kunstmatige nest op 25 graden C, onder een 16 tot acht uur licht-donkere cyclus.

Geef kraanwater met een wasfles om het gips om de andere dag tegelijkertijd vochtig te houden. Voeg vervolgens ongeveer 100 microgram droge cricketpoeder toe, verpakt in aluminiumfolie en een met bruin suikerwater gevulde punt aan de kolonie, met behulp van een 20 microliter tip om de andere dag totdat er nieuwe voortplantingsmieren ontstaan. Het is belangrijk om microkolonies uit de velden te verzamelen en ze genoeg voedsel te geven om nieuwe koninginnen en mannetjes te krijgen.

Ten eerste, stop individuen van bewegen door het plaatsen van kolonies in een kamer met een gecontroleerde omgeving ingesteld op vier graden Celsius gedurende 15 minuten. Verwijder de middenpoten van 30 werkmieren met behulp van tangen onder een stereoscoop om de F-zero generatie te onderscheiden van de werknemers geproduceerd in de daaropvolgende inteelt kruisen. Breng de mieren vervolgens over in een nieuw kleiner gipsen nest voor inteeltkruisen.

Voeg vervolgens drie tot vier larven of schaamhaar toe in een gipsen nest met werknemers. Breng een lange gevleugelde koningin en een mannetje in een eerder voorbereid gipsnest voor inteeltkruisen. Voor deze stap is het belangrijk om experimentele kruisingskolonie in dezelfde staat te houden als die van een normale kolonie.

Het is moeilijk om inteelt te induceren alleen door het plaatsen van mannen en vrouwen samen. Houd de kolonies op 25 graden Celsius onder een 16 tot acht uur licht, donkere cyclus met voedsel en water verstrekt totdat de koningin verliest haar vleugels en legt eieren. Controleer de experimentele kolonie elke dag onder een stereomicroscoop.

Na het opzetten van de inteeltkruisen tussen de F-1 nakomelingen, kunnen eieren worden waargenomen onder een stereoscoop. Nadat de F-one koningin eieren begint te leggen, verwijder je de F-1 mannetjes en larven of pube uit het nest om te voorkomen dat de F-1-generatie en de F-2-generatie zich mengen. Houd de kolonies onder dezelfde omstandigheden totdat de F-twee nakomelingen tevoorschijn komen.

Verwijder een been van een F-zero koningin met behulp van tangen. Breng het been over op een 1,5 milliliter microbuis met 100 microliter van een koelmiddel. Onder een stereoscoop ontleden een vrouwelijke buik in een glazen schaal gevuld met 300 microliters van ultra zuiver water met behulp van tangen.

Dissimilate de spermatica met het sperma van parende mannetjes. Pel het weefsel van de spermatica weg en isoleer het sperma uit het weefsel van het vrouwtje met behulp van insectenspelden. Met behulp van een micro-taart pad, breng het sperma in een 1,5 milliliter micro buis met 100 microliter van een koelmiddel.

Broed de monsters van de F-zero koningin en sperma op 95 graden Celsius gedurende 20 minuten. Flash centro zekering van de micro-buis en bewaar de monsters op vier graden Celsius. Na bevestiging van de eiproductie door de met siv-gedekte F-one koningin, haal het DNA van de koningin eruit met behulp van de schuurvleugels of een middenbeen en genotype.

Vervolgens moet u het DNA van een F-1 mannetje extraheren door één been te genotyperen. Om de vruchtbaarheid van de mannelijke mieren uit de inteeltkruisen te evalueren, ontleedt u interne voortplantingsorganen in een glazen schaal met 400 microliters PBS-oplossing met behulp van tangen. Verwijder vervolgens de PBS en vervang deze door vier procent paraformaldihyde met behulp van een micro-taartpad.

Bevestig het weefsel door de monsters in PFA veertig minuten in kamertemperatuur uit te broeden. Na fixatie, was de weefsels vijf keer met 400 microliters van PBS met behulp van een micro pie pad. Verdun de DAPI-oplossing tot één milligram per milliliter in PBS.

Verwijder de PBS en voeg ongeveer 300 microliter van de verdunde DAPI kleuroplossing toe aan het weefsel. Incubeer het weefsel gedurende 15 minuten onder donkere omstandigheden een kamertemperatuur. Na de incubatie, was het weefsel vijf keer met 400 microliters van PBS en breng het weefsel naar het midden van een glazen glijbaan met behulp van tangen.

Monteer vervolgens het weefsel op het montagemedium met TRITC tetramethylrhodamine. Tot slot observeren de monsters met een confocale laser scanning microscoop met behulp van de 20 of 60 3x objectieve lenzen. Microscopische beelden van teelballen van Haploid mannelijke v Emeryi tonen gezond vezelig weefsel of sperma die afwezig zijn in Diploïde mannelijke v Emeryi, die geen gezond vezelig weefsel laten zien.

De mannelijke voortplantingsorganen van Diploïde mannelijke v Emeryi produceerden geen sperma en hun teelballen ontwikkelden zich niet, wat suggereert dat mannen die in het inteelt kruisen produceerden steriel zijn. Na de ontwikkeling, deze techniek maakte de weg voor ons om seks myatonie te verkennen in een constante in Vollenhovia Emeryi voor de snelle timing mierensoort.