Histochemische kleuring en beeldanalyse te kwantificeren van zetmeel in de eierstok Primordia van zoete kers tijdens de Winter-rustperiode te combineren

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over rust in houtachtige plant, zoals waarom de bloemknoppen moeten verkouden accumuleren in de winter om goed te bloeien. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het mogelijk maakt de kwantificering van het zetmeel in zeer kleine monsters van bloem primordium. Deze aanpak is zeer nuttig om de fysiologische activiteit van het bloem primordium tijdens de rust te detecteren en kan ook worden toegepast op andere boomsoorten zoals abrikoos of pruim.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in de slapende bloemknop, kan het ook worden toegepast op andere processen, zoals de voortplantingsfase van bestuiving tot het begin van vruchtwerk. Om te beginnen verzamel je vijf scheuten van het veld. Weeg en bevestig vervolgens 10 bloemknoppen in een glazen buis van 10 milliliter met fixatieve oplossing gedurende ten minste 24 uur bij vier graden Celsius.

Gooi hierna de fixatieve weg en voeg voldoende 75% ethanol toe om de monsters te bedekken. Bekrijg drie scheuten met een lengte van 15 tot 30 centimeter en vijf millimeter in diameter met elk 10 bloemknoppen. Plaats vervolgens de scheuten op waterdoordrenkt bloemistschuim in een groeikamer.

Na 10 dagen in de groeikamer, verwijder de bloemknoppen van de scheuten en weeg ze. Elke week vanaf het begin van de herfst tot budburst in het voorjaar, evalueren van de groei van de bloemknoppen. Verwijder de externe knop schubben van elk monster, dan plaats elke knop in glas van een horlogemaker met 75%ethanol.

Gebruik precisie tangen en een oogheelkundige scalpel om de knoppen te ontleden en ten minste één bloem primordium van elke knop te verkrijgen. Sluit de monsters individueel in paraffine was om een blok te vormen en sectie ze op een roterende microtome. Na het doorsnee van de monsters, breng een druppel van verse Lugol jodium over een sectie.

Verwijder na vijf minuten overtollige vlek met blottingpapier. Breng vervolgens een kleine druppel synthetische montagemedia aan, plaats een klein afdekglas over het monster en druk hard. Zodra de montage media droog is, observeren de gekleurde sectie onder een brightfield microscoop.

Pas eerst het diafragmamembraan en de helderheidsregeling aan volgens het tekstprotocol. Zorg er dan voor dat er geen filters in de filterhouder zitten en selecteer een helderveldconditie in de microscoop. Pas hierna de camera-instellingen voor het gekleurde preparaat zonder weefsel aan.

Fix the brightness at 50%Next activeer de overbelichtings-/onderbelichtingsfunctie en pas de belichtingstijd aan op de limiet van overbelichting. Pas de witbalansfunctie en de arceringscorrectie toe. Meet het grijze niveau van het resulterende zwart-wit beeld van het gekleurde preparaat zonder weefsel.

Breng vervolgens een 4N-filter aan, verwerf een ander zwart-witbeeld van de voorbereiding en meet het grijze niveau. Vervolgens een beeld van dezelfde voorbereiding zonder licht te verwerven en het grijze niveau van het resulterende beeld te meten en te kalibreren. Hierna een kleurenafbeelding van een voorbeeldsectie in TIFF-indeling met een resolutie van ten minste 300 dpi.

Maak een binaire afbeelding die overeenkomt met het gekleurde gebied en stel vervolgens de drie kleurdrempels in totdat de binaire afbeelding precies de gekleurde zetmeelkorrels weergeeft. Herhaal dit proces met andere preparaten en weefsels om de uiteindelijke detectieniveaus te verfijnen. Met behulp van het beeldanalysesysteem meet u de som van de optische dichtheid van elke pixel onder het masker om de zetmeelinhoud in het veld te kwantificeren.

In dit protocol werden de groei van de bloemknoppen en de slaapstatus geëvalueerd door de toename van het knopgewicht na 10 dagen onder geschikte omstandigheden te meten. Tijdens het slapen gaan werden er na 10 dagen geen veranderingen waargenomen onder geschikte omstandigheden. Zodra de rust was overwonnen, de knoppen zwol en barstte in de groeikamer.

Zetmeelgehalte in de eierstok primordium werd gekwantificeerd via beeldanalyse in elke microtomed sectie. Consequent, de hoeveelheid zetmeel in de vroege winter presenteerde een optische dichtheid waarde minder dan 40,000 en het maximale bedrag bereikte een waarde tussen 120, 000 en 140.000 tijdens beide jaren van de studie. Rekening houdend met de rust, de maximale hoeveelheid zetmeel gelijktijdig opgetreden met de koelende vervulling gedurende beide jaren.

Het is belangrijk om te onthouden dat de detectieniveaus die door de beeldanalyzer worden gebruikt, direct afhankelijk zijn van de kalibratie van het systeem. Dit omvat lichte conditie, vlek intensiteit, en vergroting van de microscoop. Deze voorwaarde moet voor alle voorbereidingen worden vastgesteld.

De combinatie van histochemische technieken met beeldanalyse heeft zeer nuttig geresulteerd om de koolhydraatreserve van het bloem primordium tijdens de verschillende fasen van de rust te onderzoeken. Het kan ook worden toegepast op andere soorten en weefsels. De relatie tussen rusteigenschap en zetmeelaccumulatie in de eierstok primordia onthuld door het gebruik van deze methode bieden een solide basis om de biologische basis van rust en koeling eisen te begrijpen.

Toekomstige inspanningen moeten worden gericht op het bestuderen van betrouwbare biologische indicatoren die gemakkelijk de slaapstatus van de boom kunnen aangeven. Ondertussen kan het patroon van zetmeelvariaties langs de rust worden gebruikt om verdere fysiologische en genetische studies te framen.