Methionine Gefunctionaliseerde biocompatibele blok copolymeren voor gerichte plasmide DNA-levering
6 augustus 2019
Dit werk presenteert de voorbereiding van methionine Gefunctionaliseerde biocompatibele blok copolymeren (mBG) via de omkeerbare addition-fragmentatie Chain Transfer (RAFT) methode. De plasmide DNA-complexering van het verkregen mBG en hun transfectie efficiëntie werden ook onderzocht. De RAFT methode is zeer gunstig voor polymerisatie monomeren met speciale functionele groepen.
Kationische polymeer drug dragers hebben de voordelen van een goede stabiliteit, lage immunogeniciteit, en facile voorbereiding en modificatie. Hier bieden we een snelle en eenvoudige methode voor de synthese. Omkeerbare toevoeging-fragmentatie ketting overdracht polymerisatie methode is een methode die van toepassing is op de opbrengst blok polymeren met gecontroleerde moleculair gewicht en structuur en het dragen van functionele groepen.
Deze geneesmiddelendragers kunnen tegelijkertijd verschillende geneesmiddelen dragen om de samenwerkingsbehandeling van kanker, ontsteking en andere ziekten te bereiken. IFT polymerisatie is een klassieke methode, en dit protocol geeft een voorbeeld van de toepassing ervan in gentherapie. De sleutel tot het succes voor de synthese van dit polymeer is om de reactietemperatuur nauwkeurig te regelen.
Het is meer aan te raden om een oliebad te gebruiken dan een waterbad. Om deze procedure te beginnen, verkrijg je een ronde-bodemkolf met een rubberen stop en een magnetische roerder die als polymerisatiefles moet worden gebruikt. Los 1,87 gram bishydroxy HEMA op in één milliliter gedestilleerd water in de polymerisatiefles.
Los in een bekerglas van vijf milliliter 0,03 gram CTP en 0,02 gram ACVA op in 0,5 milliliter van 1, 4-dioxaan. Voeg dit mengsel toe aan de polymerisatiefles. Gebruik vervolgens een condensaatval om de oplossing in de polymerisatiefles te bevriezen.
Bevestig de fles aan de ijzersteun, en gebruik een leiding struikelde met een naald te stofzuigen en stikstof te injecteren in de reactie mengsel. Sluit vervolgens de polymerisatiefles af en ontdooi de oplossing 30 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal deze vriespomp-dooi cyclus drie keer.
Plaats de fles hierna in een oliebad op 70 graden Celsius en laat de oplossing 24 uur lang reageren onder de stikstofatmosfeer. De volgende dag, chill de polymerisatie fles op nul graden Celsius en open de rubberstop om de polymerisatiereactie te beëindigen. Vervolgens precool aceton in een koelkast bij negatieve 20 graden Celsius gedurende twee uur, en meng het met de reactie oplossing in de polymerisatie fles bij een verhouding van 50 tot een.
Centrifugeren dit mengsel op 8, 200 keer g gedurende 10 minuten om de aceton te verwijderen en het neerslag te verzamelen. Om de gesynthetiseerde poly bis-hydroxy HEMA te zuiveren, los je het verzamelde neerslag op in twee milliliter zuiver water. Meng het vervolgens met 100 milliliter voorgekoelde aceton met een verhouding van 1 tot 50.
Centrifugeren de oplossing op 8, 200 keer g gedurende 10 minuten om het neerslag te verzamelen. Herhaal dit zuiveringsproces van het oplossen, mengen en centrifugeren van het neerslag drie keer. Los eerst 0,96 gram APMA en 0,93 gram gezuiverde poly bis-hydroxy HEMA op in vijf milliliter gedestilleerd water in een bekerglas van 10 milliliter.
Los 0,01 gram ACVA op in 0,5 milliliter van 1, 4-dioxaan en voeg dit toe aan de APMA- en polybixy HEMA-oplossing. Breng dit mengsel over op een polymerisatiefles en ventileer een uur lang met droge stikstof. Zet vervolgens de polymerisatiefles in een oliebad op 70 graden Celsius en laat het 24 uur onder de stikstofatmosfeer reageren.
De volgende dag, chill de polymerisatie fles op nul graden Celsius en open de rubberstop om de polymerisatie proces oplossing te beëindigen. Om te beginnen, zaad MCF-7 cellen in de putten van een zes-put plaat bij een dichtheid van 20,000 cellen per put. Kweek de cellen in een bevochtigde couveuse bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide gedurende 12 uur.
Vervang hierna het kweekmedium door het verse kweekmedium met kationisch polymeer en pDNA polyplex polyplexen met verschillende verhouding tussen stikstof en fosfor. Kweek de cellen zes uur en vervang het medium vervolgens door twee milliliter vers RPMI 1640-medium. Blijf 48 uur door.
Dan, het verzamelen van de cellen, en gebruik een stroom cytometer om de groene fluorescentie te detecteren. In deze studie worden methionine-gefunctionaliseerde biocompatibele blokcopolymeren bereid via de omkeerbare toevoegingsfragmentatieketenoverdrachtsmethode, en wordt het plasmide DNA-complexingvermogen van de verkregen mBG en hun transfectie-efficiëntie onderzocht. De gemiddelde deeltjesgrootte en zetapotentieel van mBG/pDNA polyplexen zijn respectievelijk 124 nanometer en plus 15,7 millivolt bij een N-to-P-verhouding van 16.
Elektroforetische retardatie onthult dat pDNA met een N-to-P verhouding van nul kan bewegen zonder terughoudendheid in de agarose gel en wordt waargenomen als een streep in de gel imager. Wanneer pDNA is complex met mBG, is de beweging van pDNA vertraagd en vervolgens wordt de helderheid van de band verminderd. Dit toont aan dat mBG de pDNA volledig kan complexen wanneer de N naar P hoger is dan vier.
De cytotoxiciteit van de mBG/pDNA polyplexen wordt vervolgens gemeten met behulp van de standaard MTT-test Deze resultaten tonen aan dat mBG/pDNA-polyplexen cytotoxiciteit hebben dan PEI/pDNA-polyplexen bij de N-to-P-verhoudingen van vier, acht, 16 en 32. Zoals ook te zien is, neemt de cytotoxiciteit van de mBG/pDNA polyplexen toe met een verhoogde N-to-P-verhouding. Deze verhoogde cytotoxiciteit is het gevolg van de positief geladen GPMA-component.
De N-to-P-verhouding die wordt gebruikt in het pDNA-transfectie-experiment wordt geselecteerd op basis van de cytotoxiciteitsresultaten. De transfectiecapaciteiten van mBG1, mBG2 en mBG3 worden vergeleken door de GFP-fluorescentieintensiteit te meten, en de resultaten toonden aan dat mBG3 de optimale gendrager is. Het is belangrijk om lucht uit de slibronde kolf te laten uitputten en de reactietemperatuur te behouden.
De verkregen polymeer drug dragers kunnen worden toegepast op de co-levering van chemotherapie drugs en gen drugs om synergetisch te behandelen resistente kanker. Het moleculaire mechanisme van combinatie van genmedicijnen en chemotherapeutische geneesmiddelen kan verder worden onderzocht voor de behandeling van resistente tumoren. Aceton wordt beoordeeld als laag giftig voor de acute toxiciteit.
Sleutels, inademing of contact met ogen of huid moeten worden vermeden. Vermijd het risico van broei tijdens de verwarmingsprocedure.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een snelle en eenvoudige methode voor de synthese van kationische polymere geneesmiddeldragers met behulp van de methode van reversibele additie-fragmentatie ketenoverdracht (RAFT)-polymerisatie. De gesynthetiseerde methionine-gefunctionaliseerde biocompatibele blokcopolymeren (mBG) werden geëvalueerd op hun vermogen om plasmide DNA te complexeren en op hun transfectie-efficiëntie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Polymeerchemie
- Gentherapie
- Medicijnafgifte-systemen
Achtergrond
- Kationische polymere geneesmiddeldragers bieden stabiliteit en een lage immunogeniciteit.
- RAFT-polymerisatie maakt een gecontroleerd moleculair gewicht en een gecontroleerde structuur mogelijk.
- Deze dragers kunnen meerdere geneesmiddelen transporteren voor een collaboratieve behandeling.
- Preciese controle van de reactietemperatuur is cruciaal voor een succesvolle synthese.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor de synthese van biocompatibele blokcopolymeren.
- Het onderzoeken van het vermogen van de gesynthetiseerde polymeren om complexen met DNA te vormen.
- Het beoordelen van de transfectie-efficiëntie van de geneesmiddeldragers.
Gebruikte methoden
- Reversibele additie-fragmentatie ketenoverdracht (RAFT) polymerisatie.
- Synthese van methionine-gefunctionaliseerde blokcopolymeren.
- Evaluatie van het vermogen tot complexvorming met plasmid DNA.
- Beoordeling van de transfectie-efficiëntie.
Belangrijkste resultaten
- Het gesynthetiseerde mBG vertoonde een effectieve complexatie van plasmid-DNA.
- De transfectie-efficiëntie is succesvol geëvalueerd.
- RAFT-polymerisatie bleek gunstig voor de synthese van gefunctionaliseerde polymeren.
- De methode maakt de gelijktijdige afgifte van meerdere geneesmiddelen mogelijk.
Conclusies
- De studie heeft met succes een methode ontwikkeld voor de synthese van mBG.
- Deze biocompatibele polymeren zijn veelbelovend voor toepassingen in gentherapie.
- Verder onderzoek zou hun effectiviteit bij medicijnafgifte kunnen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Dit werk presenteert een methode op basis van RAFT-polymerisatie voor de synthese van methionine-gefunctionaliseerde biocompatibele blokcopolymeren die in staat zijn om plasmide-DNA te complexeren, wat een instelbaar platform biedt voor de ontwikkeling van genoverdrachtsvectoren. De mogelijkheid om het molecuulgewicht, de ladingsverhouding en de deeltjesgrootte te controleren, maakt het voorspellend ontwerpen van niet-virale dragers mogelijk met een verminderde cytotoxiciteit in vergelijking met PEI, wat bijdraagt aan het vroegtijdige beperken van risico's bij nucleïnezuurtherapieën. Dergelijke systemen voorzien in de behoefte aan schaalbare, reproduceerbare polymeersynthese in preklinische discovery-workflows, waarbij mechanistische helderheid en consistentie van de formulering van invloed zijn op go/no-go-beslissingen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om polymeer-DNA-interacties te onderzoeken door middel van kwantificeerbare complexvorming bij gedefinieerde N/P-ratio's, wat targetvalidatie via gecontroleerde genoverdracht ondersteunt.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare syntheseroute voor kationische blokcopolymeren met instelbare methionine- en guanidine-functionalisering, waardoor de variabiliteit in vroege screeningassays wordt verminderd.
Screening & assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert goed gedefinieerde polyplexen met een meetbaar zetapotentieel (+15.7 mV bij N/P 16) en een grootte (124 nm), waardoor een gestandaardiseerde beoordeling van de transfectie-efficiëntie en cytotoxiciteit mogelijk is.
- Operationele waarde: Faciliteert high-throughput screening van polymeervarianten (mBG1, mBG2, mBG3) door het APMA-gehalte (21%, 37%, 52%) te koppelen aan functionele resultaten in gentransfer-assays.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Demonstreert volledige vertraging van plasmide-DNA bij N/P >4, wat duidt op een betrouwbare bescherming van de vracht—een cruciale preklinische benchmark voor vectorstabiliteit.
- Operationele waarde: Ondersteunt het screenen van formuleringen over verschillende N/P-ratio's (8, 16, 4) om optimale transfectiecondities te identificeren, terwijl cytotoxiciteitstrends gekoppeld aan het GPMA-gehalte worden gemonitord.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode past binnen het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek door de synthese van gedefinieerde genvectoren mogelijk te maken voor de identificatie van lead-verbindingen voor de aflevering van nucleïnezuren, waarbij structuur-functie-relaties van polymeren de basis vormen voor beslissingen over verdere ontwikkeling.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten bij polymeer-gemedieerde genoverdracht door kwantificeerbare resultaten (deeltjesgrootte, zetapotentiaal, transfectie-efficiëntie) te leveren om de structuur te correleren met de biologische activiteit.
- Screening: Maakt de productie van assay-klare polyplexen mogelijk met een consistente grootte (100–200 nm bij N/P 16–32) en oppervlaktelading, wat de reproduceerbaarheid bij evaluatiecampagnes van verbindingen verbetert.
- Analytics: Genereert meetbare biofysische uitlezingen (N/P-ratio, zetapotentiaal, elektroforetische retardatie) die een vergelijkende analyse van polymeervarianten onder gestandaardiseerde omstandigheden mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt polymeerontwerp met preklinische relevantie via aangetoonde pDNA-complexering en verminderde cytotoxiciteit ten opzichte van PEI, wat risico-gecorrigeerde voortgang ondersteunt.
- Bedrijfsmatige Hergebruik: Vestigt een modulair RAFT-gebaseerd platform dat aanpasbaar is aan andere functionele aminozuren of therapeutica, wat cross-project standaardisatie in polymeersynthese bevordert.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in de prestaties van genendragers door moleculair ontwerp (methionine/guanidine-gehalte) te koppelen aan DNA-binding en transfectieresultaten.
- Operationele waarde: Levert een schaalbaar, zuiveringsvriendelijk syntheseprotocol met gebruik van acetonprecipitatie en RAFT-controle, wat de consistentie tussen batches verbetert.
- Strategische waarde: Vermindert biologische risico's in een laat stadium door een alternatief met een lagere cytotoxiciteit voor PEI te bieden, wat betere go/no-go-beslissingen mogelijk maakt bij de ontwikkeling van therapeutische nucleïnezuren.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van polymeerkandidaten (bijv. mBG3 als optimale drager) op basis van transfectie-efficiëntie en veiligheidsprofielen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in RAFT-polymerisatie, inclusief freeze-pump-thaw ontgassing en het werken onder een inerte atmosfeer.
- Afhankelijk van nauwkeurige temperatuurbeheersing (oliebad op 70°C) en gespecialiseerde reagentia (ACVA, CTP) voor een reproduceerbare synthese van blokcopolymeren.
- Vereist analytische infrastructuur voor GPC, zetapotentiaal, deeltjesgroottebepaling en fluorescentiegebaseerde transfectie-assays om de prestaties van polyplexen te evalueren.
- Aanpassing aan andere cellijnen of payloads kan een re-optimalisatie van de N/P-ratio en cytotoxiciteitsbeoordeling vereisen vanwege variabele GPMA-gemedieerde effecten.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak van meerstapszuivering en gevoeligheid voor zuurstof tijdens de polymerisatie, wat moet worden beperkt via strikte ontgassingsprotocollen.
