Geautomatiseerde kwantificering van neutrofiele extracellulaire traps met behulp van NETQUANT
27 november 2019
Hier presenteren we een protocol voor het genereren van neutrofiele extracellulaire vallen (netten) en het bedienen van NETQUANT, een volautomatische software optie voor het kwantificeren van netten in immunofluorescentie beelden.
Hier presenteren we NETQUANT, een volledig geautomatiseerde aanpak voor het kwantificeren van NETS en immunofluorescentie beelden. Dit zal onderzoekers helpen bij het maken van vergelijkbare beeldanalyse op gegevens gegenereerd door meerdere gebruikers en voorwaarden. De voordelen van deze techniek zijn het gebruiksgemak, eencellige data-analyse, meerdere criteria om NET-vorming te evalueren en een onbevooroordeelde analyse van meerdere afbeeldingen.
Installeer en open de analysesoftware. Een up-to-date versie is te vinden op het Zenodo GitHub archief, of de Nordonfelt Lab website. Kies op het tabblad Setup een bronmap voor analyse door op de optie Pad ophalen in het bronmenu te klikken.
Selecteer de map met de te analyseren afbeeldingsreeksen. Klik nogmaals op de optie Pad ophalen in het doelmenu en selecteer de doelmap voor het opslaan van de gegevens die de afbeeldingsanalyse volgen. Vervolgens, bij het gebruik van afzonderlijke kanaalbeelden, een naam van de kanaalmappen, zodat het DNA-kanaal overeenkomt met de nucleaire DNA-vlek, en het NET-kanaal toont de neutrofiele elastase vlek in de beelden.
Geef ook de map met de besturingselementafbeeldingsbestanden als controle. Klik vervolgens op de knop Afbeeldingsgegevens laden en laad de metagegevens van de afbeelding in de software. Selecteer vervolgens in het submenu kanaalvolgorde de juiste kanaalvolgorde in de afbeeldingen.
Dit helpt om toevallige mismatches te voorkomen. Klik nu op de knop Gegevens voorbereiden om primaire afbeeldingseigenschappen uit de ruwe gegevens te verkrijgen en de afbeeldingen om te zetten. De geconverteerde afbeeldingen worden vervolgens weergegeven in het submenu voorbeeldtypen.
Klik op het voorbeeldtypemenu, selecteer een afbeelding in het submenu en klik op weergavegegevens om de afbeeldingen weer te geven die zijn opgesplitst in respectievelijk het DNA- en Neutrophil Extracellular Trap of het NET-kanaal. Als u de cellen wilt segmenteren in hun respectieve kanalen, selecteert u het tabblad segmentatiemethode en selecteert u een methode in het submenu methode voor zowel de DNA- als de NET-kanalen. De standaardmethode voor segmentatie is ingesteld op adaptief en is de aanbevolen instelling.
Andere opties zijn beschikbaar in de software, waaronder global edge en chanverse. Een keerpunt optie is ook opgenomen om te helpen onderscheid maken tussen nauw geplaatste cellen of NETs. Klik ook op het tabblad segmentatie op de optie segmentbesturingselementen.
Selecteer vervolgens PMA in het submenu voorbeeldtype en klik op de batchoptie om te beginnen met het segmenteren van alle afbeeldingen die in de gegevensset zijn opgenomen. Selecteer vervolgens de afbeeldingen in het voorbeeldtypemenu en klik op de knop Weergavegegevens om de binaire afbeeldingsmaskers te visualiseren en te valideren voor zowel de DNA- als NET-maskers die na segmentatie zijn gegenereerd. Klik nu op het tabblad analyse op de knop Drempel bepalen om de besturingselementen te analyseren.
Wijzig vervolgens aan de rechterkant het monstertype in PMA en klik op de knop Celeigenschappen ophalen om de analyse van de gestimuleerde monsters te voltooien. Selecteer vervolgens een afbeelding in het submenu voorbeeldtype en klik op de knop Weergavegegevens om de overlay en het aantal cellen en NET-vormende cellen in de afbeelding weer te geven. Begin met het selecteren van het voorbeeld in het submenu voorbeeldtype.
Afzonderlijke afbeeldingen kunnen worden geselecteerd uit het submenu van het voorbeeldtype voor analyse of de volledige batch afbeeldingen kan worden geanalyseerd door de batchoptie te selecteren. Eenmaal geselecteerd, klikt u op de knop NETs analyseren om de analyse te voltooien. Pas netcriteria handmatig aan om optimale resultaten te behalen voor een bepaald monster.
Vergelijk geïdentificeerde NETs met de originele afbeeldingen om de kwaliteit van de identificatie te beoordelen. Zodra deze stap is voltooid, kunnen de NET-criteria worden toegepast op alle afbeeldingen in de gegevensset. Eventuele wijzigingen in de NET-criteria worden ook gelijktijdig toegepast op alle controlemonsters.
Controleer het gegevensoverzicht in het submenu celgegevens, waar het aantal afbeeldingen, het aantal cellen per afbeelding en het percentage NET's per afbeelding worden weergegeven. Voer het uitvoertabblad in om de resultatenuitgangen te selecteren en weer te geven. Verken en vergelijk de verschillende gegevensuitgangen die zijn gegenereerd uit de analyse van besturings- en PMA-behandelde monsters door de vorm van de uitvoer te selecteren en op de knop uitvoerresultaten te klikken.
Start vervolgens het CSV-bestand met de resultatengegevenstabel om gegevens met één cel te verkennen en klik op de pdf-bestanden voor de resultaten om de net-gebiedsverdeling en DE VERHOUDING DNA naar NET in de monsters te visualiseren. De rode lijn geeft de drempelwaarde in de grafieken aan. Tot slot, klik op de resultaten bivariate distributiebestand om het NET gebied versus vorm van DNA te bepalen.
Hier werden 15 beelden van controlenetrofielen en 15 beelden van PMA-gestimuleerde neutrofielen geanalyseerd in minder dan tien minuten. Het totale aantal cellen werd geteld en het percentage cellen met Neutrophil Extracellular Traps werd bepaald met behulp van de geautomatiseerde kwantificeringsmethode beschreven in dit artikel. Deze resultaten tonen aan dat PMA-gestimuleerde neutrofielen een groter gebied hebben, een toename van nucleaire vervorming en een hogere DNA-tot NET-ratio dan controlemonsters.
In combinatie met een 3D-grafiek vertonen de pma-gestimuleerde monsters vaak gebieden van aanscherpingsgroepen dan de controlemonsters. Tijdens het proberen van de procedure, is het belangrijk om te onthouden dat, hoewel de workflow werd getest met behulp van meerdere donoren, is het raadzaam dat de gebruiker moet beslissen over de software parameters op de juiste manier op basis van de individuele gegevensset.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert NETQUANT, een volledig geautomatiseerde software die is ontworpen voor de kwantificering van neutrophil extracellular traps (NETs) in immunofluorescentiebeelden. Deze tool is bedoeld om een consistente beeldanalyse over verschillende onderzoekscondities te faciliteren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Immunologie
- Beeldanalyse
Achtergrond
- Neutrofiele extracellulaire traps (NETs) spelen een cruciale rol in de immuunrespons.
- De kwantificering van NETs is essentieel voor het begrijpen van hun functie en implicaties bij diverse ziekten.
- Bestaande methoden voor de kwantificering van NETs kunnen inconsistent zijn tussen verschillende gebruikers en omstandigheden.
- NETQUANT beoogt dit proces te standaardiseren door middel van automatisering.
Doel van de studie
- Om een gebruiksvriendelijke software te introduceren voor het kwantificeren van NETs.
- Om onderzoekers in staat te stellen een onbevooroordeelde analyse van meerdere afbeeldingen uit te voeren.
- Om single-cell data-analyse en evaluatie van NET-vorming te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Installatie van de NETQUANT-software vanuit het Zenodo GitHub-archief of de website van het Nordonfelt Lab.
- Selectie van de bronmap voor analyse via de software-interface.
- Gebruik van meerdere criteria voor de evaluatie van NET-vorming.
- Geautomatiseerde verwerking van immunofluorescentiebeelden voor kwantificatie.
Belangrijkste resultaten
- NETQUANT biedt een gestroomlijnde aanpak voor de kwantificering van NETs.
- De software maakt een consistente analyse mogelijk over verschillende experimentele condities heen.
- Onderzoekers kunnen onbevooroordeelde resultaten verkrijgen uit meerdere afbeeldingen.
- Data-analyse op single-cell niveau vergroot het begrip van de NET-vorming.
Conclusies
- NETQUANT is een waardevol hulpmiddel voor onderzoekers die NETs bestuderen.
- De software verbetert de betrouwbaarheid van beeldanalyse in immunofluorescentiestudies.
- Toekomstige studies kunnen dit hulpmiddel benutten voor nauwkeurigere beoordelingen van NET-gerelateerde fenomenen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Geautomatiseerde op beelden gebaseerde kwantificering van neutrophil extracellular traps (NETs) lost een kritiek knelpunt op in immunologisch en inflammatieonderzoek door objectieve high-throughput analyse van NET-vorming mogelijk te maken. Deze mogelijkheid ondersteunt targetvalidatie en mechanistische risicoreductie in drug discovery-programma's die gericht zijn op neutrofiel-gemedieerde pathways, inflammatoire ziekten en mechanismen van de gastheerdefensie. Door gegevens met resolutie op enkelcelniveau en gestandaardiseerde criteria voor NET-identificatie te leveren, verhoogt NETQUANT het voorspellend vertrouwen in preklinische modellen en faciliteert het crossfunctionele samenwerking tussen teams op het gebied van immunologie, imaging en datawetenschappen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen met betrekking tot NETosis-paden en neutrofielenfunctie in ziektemodellen te onderzoeken.
- Operationele waarde: Biedt biologisch relevante parameters, zoals toename van het oppervlak, de DNA:NET-markerproteïneratio en nucleaire deformatie, om NET-vorming met resolutie op enkelcelniveau te definiëren.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie door NET-vorming als reactie op stimuli zoals PMA te kwantificeren, waardoor de effecten van verbindingen op de afgifte van neutrofiele extracellulaire trappen kunnen worden beoordeeld.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor analyse: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-workflows door gestandaardiseerde, kwantitatieve output te genereren uit immunofluorescentiebeelden.
- Reproduceerbaarheid: Pakt belangrijke beperkingen van handmatige en semi-automatische methoden aan door onbevooroordeelde analyse over meerdere gebruikers en condities te leveren via geautomatiseerde drempelwaarde-bepaling en batchverwerking.
- Schaalbaarheid: Maakt screeningklaarheid en hergebruik van het platform mogelijk via een freely available app met een gebruiksvriendelijke GUI die beeldsequenties voor experimentele datasets in minder dan tien minuten verwerkt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Ondersteunt de afstemming van translationele biomarkers door de vorming van NET's te kwantificeren, een proces dat betrokken is bij auto-immuunziekten, kankermetastasen en trombotische aandoeningen.
- Preklinische continuïteit: Faciliteert risico-gecorrigeerde beslissingen over voortgang door kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen te leveren (bijv. percentage NET-vormende cellen, NET-areaverdeling), waardoor vergelijking tussen controle- en gestimuleerde monsters mogelijk wordt.
- Mechanistische risicoreductie: Richt zich op voorspellende risicoreductie via multivariate analyse van NET-oppervlakte versus DNA-vorm, wat helpt bij het verduidelijken van werkingsmechanismen bij het screenen van immunomodulerende verbindingen.
Integratie van Pipeline & Workflow
NETQUANT past binnen het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie via leadidentificatie tot preklinisch onderzoek, in het bijzonder bij programma's die gericht zijn op immunologie en ontsteking waarbij NETose een relevant pathofysiologisch mechanisme is.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door geautomatiseerde kwantificering van NET-vorming mogelijk te maken als reactie op genetische of farmacologische verstoringen.
- Screening: Beschrijft de gereedheid van de assay via geautomatiseerde verwerking van immunofluorescentiebeelden, kwantitatieve outputs en batch-analysemogelijkheden die reproduceerbaarheid over verschillende experimentele condities garanderen.
- Analytiek: Benadrukt metingen zoals celgetal per beeld, percentage NETs per beeld, NET-oppervlakteverdeling en de DNA-tot-NET-ratio, die teams helpen om condities te vergelijken en effecten van verbindingen te evalueren.
- Translationeel onderzoek: Verbindt de methode met preklinische continuïteit door ziekterelevante systeemanalyse van NET-vorming, wat implicaties heeft voor sepsis, lupus en kankergerelateerde trombose.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Presenteert de methode als een herbruikbare capaciteit in plaats van een eenmalige techniek, met vrij beschikbare software die standaardisatie tussen locaties en projecten ondersteunt.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen, targetvalidatie, vermindering van mechanistische ambiguïteit in NETosis-paden.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van beeldbaserede NET-kwantificering tussen verschillende gebruikers en locaties.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium bij programma's voor geneesmiddelenontwikkeling gericht op ontsteking.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van kwantitatieve NET-formatiegegevens uit preklinische modellen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereiste wetenschappelijke expertise in immunofluorescentiemicroscopie en principes van beeldanalyse.
- Behoeften op het gebied van instrumentatie en analytische infrastructuur, inclusief fluorescentiemicroscopie en compatibele beeldbestandformaten.
- Eisen voor standaardisatie tussen teams voor de naamgeving van kanalen, segmentatiemethoden en de toepassing van NET-criteria bij controle- en gestimuleerde monsters.
- Overwegingen voor adaptatie tussen modelsystemen, zoals menselijke versus muine neutrofielen en verschillende stimulatiecondities naast PMA.
- Praktische beperkingen ondersteund door het bronmateriaal: gebruikers moeten softwareparameters op passende wijze bepalen op basis van individuele datasets, en workflowvalidatie kan optimalisatie vereisen voor specifieke celtypen of kleuringsprotocollen.
Veelgestelde vragen over biofarmaceutica
Chapters in this video
0:04
Title
0:34
Analysis and Quantification of Neutrophil Extracellular Traps (NETs)
2:19
Segmentation of Cells in the DNA Channel and the NET Channel
3:41
Single-cell Analysis of Identifiable Properties
4:19
Comparison of Cell Properties to Identify NET-forming Cells
5:23
Result Outputs Demeanor
6:16
Results: Analysis of NET Formation
7:07
Conclusion
