Name: Geautomatiseerde kwantificering van neutrofiele extracellulaire traps met behulp van NETQUANT (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Leer NETQUANT voor geautomatiseerde kwantificering van neutrofiele extracellulaire traps in immunofluorescentiebeelden. Deze software biedt consistente, onbevooroordeelde analyse voor immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk werd gefinancierd door de Crafoord Foundation (TM en PN), de Zweedse overheids onderzoeksbeurs (PN, TM), de Zweedse Onderzoeksraad (PN) en de Groschinsky Foundation (TM, PN).

De ethische commissie van de Universiteit van Lund keurde de verzameling van veneuze bloed van gezonde vrijwilligers goed in overeenstemming met de verklaring van Helsinki (2013/728). Alle vrijwilligers hebben hun schriftelijke geïnformeerde toestemming gegeven.
1. isolatie van perifere bloed neutrofielen met behulp van dichtheid-gradiënt centrifugeren
<ol><li>Verzamel humaan veneuze bloed in buisjes die heparine bevatten en laat de buisjes op kamertemperatuur komen. Opmerking: een minimum van 16 mL bloed van een gezonde donor is nodig om een voldoende grote celpellet te kunnen opleveren.</li>
	<li>Meng het bloed met een volume van 2% dextran in zoutoplossing (0,9% NaCl) en laat 30 minuten bij kamertemperatuur sediment in een steriele conische centrifugebuis van 50 mL.</li>
	<li>Zuig de supernatant op in een steriele 50 mL conische centrifugebuis en centrifugeer bij 200 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Vanaf deze stap gaat u door met isoleren op 4 °C of op ijs.</li>
	<li>Regeer de pellet in 5 mL ijskoude zoutoplossing en laag bovenop 5 mL van de isolatie gradiënt van leukocyten (9,1% natriumdiatrizoaat met 5,7% dextran, w/v) in een steriele 15 mL conische centrifugebuis.</li>
	<li>Centrifugeer 30 minuten bij 400 x g bij 4 °C.</li>
	<li>Aspireren het supernatant en gooi het weg.</li>
	<li>Lyse rode bloedcellen door het resuspenseren van de pellet in 3 mL ijskoud water voor 30 s. Voeg onmiddellijk 1 mL 3,6% NaCl toe en vul vervolgens met 10 mL ijskoude zoutoplossing.</li>
	<li>Centrifugeer de celsuspensie gedurende 10 minuten bij 350 x g.</li>
	<li>Verwijder het supernatant, verzamel de celpellet en rebreng het in 1 mL zoutoplossing. Zet 10 μL in een micro centrifugebuis om het aantal cellen en de levensvatbaarheid te beoordelen met trypan Blue in een Bürker-kamer.</li>
	<li>Voeg 10 μL celsuspensie toe aan 90 μL 0,4% trypeen blauwe oplossing. Neem 10 μL celsuspensie in een Bürker-kamer. Tel de cellen in de 4 vierkantjes gebonden door 3 lijnen op elke hoek van de kamer. Cellen die donkerblauw lijken op de opname van kleurstof, zijn niet levensvatbaar, sluiten ze uit van het totale celnummer.</li>
	<li>Het celgetal uitdrukken als cellen/mL zoals gedefinieerd door de onderstaande vergelijking. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58528/58528eq1.jpg"> Opmerking: hier was kamer factor 10.000, verdunningsfactor was 10 en het totale aantal vierkantjes was 4.</li>
	<li>Verdun de resterende celsuspensie tot 10 mL voor een laatste wasstap.</li>
	<li>Centrifugeer 5 min bij 200 x g.</li>
	<li>Respendeer de neutrofielen in RPMI-1640 met 2 mg/mL warmtegeïnactiveerd humaan serumalbumine (HSA) met een concentratie van 5 x 105 cellen/ml.</li>
</ol>2. bereiding van de Dekstroken en stimulatie van neutrofielen
<ol><li>Plaats één dekslip (10 mm, #1) in elke put van een 12-well plaat en mantel de dekslip door toevoeging van 200 μL 0,01% poly-L-lysine oplossing en laat het bij 37 °C 's nachts.</li>
	<li>Was de dekstroken met 300 μL fosfaatbuffer Saline (PBS) eenmaal en laat drogen.</li>
	<li>Voeg 400 μL van 5 x 105 neutrofielen/ml toe aan elk goed en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Verplaats de plaat met neutrofielen naar een incubator bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 15 min.</li>
	<li>Verwijder het supernatant. Voeg 400 μL voorverwarmde RPMI-1640 medium met 2 mg/mL HSA toe aan de bedieningsorganen. Voeg 300 μL vooraf opgewarmde rpmi toe met 20 nm forbol 12-Myristate 13-acetaat (PMA) voor stimulatie.</li>
	<li>Stimuleren van neutrofielen voor 150 min bij 37 °C met 5% CO2.</li>
</ol>3. visualisatie van netten
<ol><li>Verwijder de supernatant en was de monsters 2x met 200 μL PBS.</li>
	<li>Fix samples door toevoeging van 200 μL van 4% Paraformaldehyde (PFA) in PBS gedurende 20 min bij 37 °C. Opmerking: PFA is giftig en moet voorzichtig worden behandeld.</li>
	<li>Was samples 3x met 200 μL PBS.</li>
	<li>Permeabilize de monsters door toevoeging van 50 μL 0,5% Triton X-100 voor 30 s.</li>
	<li>Was de monsters 3x met 200 μL PBS.</li>
	<li>Blokkeer de monsters met 5% geit serum in PBS voor 1 uur bij 37 °C.</li>
	<li>Voeg 300 μL primair konijn-anti-humaan neutrofiele elastase toe in blokkerende oplossing bij een verdunning van 1:500 voor 90 min bij 37 °C.</li>
	<li>Was de monsters 3x met 300 μL PBS.</li>
	<li>Voeg 300 μL secundaire geit anti-konijn fluorescerende stof toe bij een verdunning van 1:1000 voor 90 min bij 37 °C.</li>
	<li>Was de afdek stroken 3x met 300 μL PBS.</li>
	<li>Verwijder de afdek stroken uit de putjes en monteer de Afdeklijst met 10 μL montage medium met DAPI. Bewaar 's nachts bij kamertemperatuur in het donker om de monsters te drogen. Opmerking: de kleuring van DNA met DAPI is zeker een kritieke stap in de methode. De gebruikers kunnen ook problemen oplossen door exogene DAPI-oplossing toe te voegen in een eindconcentratie bereik van 0,1 \ u 20120.5 μg/mL voor 2 \ u20123 min, gevolgd door 3 wasstappen met 300 μL PBS.</li>
	<li>Verkrijg afbeeldingen met een breedveld fluorescentiemicroscoop met een 20X-doelstelling.</li>
</ol>4. analyse en kwantificering van netten met NETQUANT
Opmerking: NETQUANT kan worden gedownload door te klikken op het installatiebestand gevonden op het Zenodo github archief of de Nordenfelt Lab website (<a href="https://nordlab.med.lu.se/?page_id=34" target="_blank">https://nordlab.med.lu.se/?page_id=34</a>).
<ol><li>Importeren van gegevenssets voor analyse, naamgeving van kanalen en conversie van afbeeldingen
	<ol>
<li>Open het tabblad instellen in NETQUANT.</li>
		<li>Kies de bronmap voor analyse door te klikken op de optie pad ophalen in het menu Bron en selecteer de map met de reeksen afbeeldingen die moeten worden geanalyseerd.</li>
		<li>Klik op de optie pad ophalen in het menu doel en selecteer de map voor het opslaan van de gegevens na de analyse van de afbeelding.</li>
		<li>Noem de kanalen zodat "DNA-kanaal" overeenkomt met de DNA-kleuring (bijvoorbeeldDNA of DAPI) en "net-Channel" toont de net-gebonden eiwit kleuring (bijv. netto, neutrofiele elastase) in de beelden. Voor de soepele werking van de software, (aanbevolen) noem de map met de beeldbestanden van de besturing als "controle". Opmerking: het NET-kanaal verwijst alleen naar de NET-gebonden korrel proteïne marker kleuring.</li>
		<li>Voer de metagegevens van de afbeelding in de software door te klikken op de knop afbeeldingsgegevens laden in het submenu afbeeldingsinformatie .</li>
		<li>Selecteer de juiste kanaal volgorde die is opgenomen in de afbeeldingen in het submenu kanaal volgorde . Deze optie is opgenomen als een fail-safe om onbedoelde mismatches te voorkomen.</li>
		<li>Primaire afbeeldingseigenschappen ophalen uit de onbewerkte gegevens en de afbeeldingen converteren door op de knop gegevens voorbereidente klikken. De geconverteerde afbeeldingen worden weergegeven in het submenu sample type . Klik op het menu voorbeeld type voor het weergeven en selecteren van alle gegevenssets die zijn aangeschaft voor analyse.</li>
		<li>Selecteer een afbeelding in het submenu van het voorbeeld type en klik op de knop beeld gegevens weergeven om de beelden in respectievelijk het DNA en het net kanaal te splitsen.</li>
	</ol></li>
	<li>Segmentatie van cellen in het DNA kanaal en het netto kanaal
	<ol>
<li>Selecteer de segmentatie methode door op het submenu methode in zowel het DNA-kanaal als het net-kanaal te klikken. Opmerking: de standaard segmentatie methode is ingesteld op adaptief en is de aanbevolen instelling. Andere opties zijn ook beschikbaar, waaronder Global, Edge en Chan-Vese. Een waterloods optie is ook inbegrepen om onderscheid te kunnen maken tussen nauw geplaatste cellen of netten.</li>
		<li>Voer het tabblad segmentatie in om eerst de controle cellen in beide kanalen te segmenteren door op de optie voor beelden van segment controle te klikken.</li>
		<li>Selecteer PMA in het submenu sample type en klik op de batch optie (aanbevolen) om te beginnen met segmenteren van alle afbeeldingen die in de gegevensset zijn opgenomen. Selecteer de afbeeldingen in het voorbeeld type menu en klik op de knop afbeeldingsgegevens weergeven om de binaire afbeeldings MASKERS (DNA-masker en netmasker) die na segmentatie zijn gegenereerd, te visualiseren en te valideren.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse van identificeerbare eigenschappen met één cel
	<ol>
<li>Voer het tabblad analyse in en analyseer de controle voorbeelden door te klikken op de knop drempel bepalen .</li>
		<li>Verander het sample type naar PMA en klik op de knop Celeigenschappen ophalen om de analyse van gestimuleerde monsters te voltooien.</li>
		<li>Selecteer een afbeelding in het submenu voorbeeld type en klik op de knop afbeeldingsgegevens weergeven om de overlay en het aantal cellen en de netto vormende cellen in de afbeelding weer te geven.</li>
	</ol></li>
	<li>Vergelijking van Celeigenschappen om NET vormende cellen te identificeren
	<ol>
<li>Selecteer sample in het submenu sample type en klik op de knop netten analyseren om de analyse te voltooien. Afzonderlijke afbeeldingen kunnen worden geselecteerd in het submenu voorbeeld type voor analyse of de hele batch afbeeldingen kan worden geanalyseerd door de optie Batch te selecteren (aanbevolen).</li>
		<li>Pas de NETTOCRITERIA handmatig aan om optimale resultaten voor een bepaald monster te geven. Vergelijk de geïdentificeerde netten met de originele afbeeldingen om de kwaliteit van de identificatie te beoordelen. Opmerking: de netto-criteria kunnen vervolgens worden gebruikt voor alle afbeeldingen in de gegevensset. Alle wijzigingen in de netto-criteria worden gelijktijdig toegepast op alle controlemonsters. Dit beperkt de mogelijkheid van mogelijke verschillen die zich kunnen voordoen als gevolg van overfitting van de netto-parameters. De instellingen in de netto-criteria kunnen worden aangepast aan de vereisten van de gebruiker. De relatie tussen valse Discovery rates en NETQUANT is eerder onderzocht13. Typische bereiken voor gebieds verhoging zijn 2 \ u20124, circulariteit 0,7 \ u 20120.9 en de verhouding DNA/netto te zijn 0.6 – 2.0.</li>
		<li>Inspecteer het gegevensoverzicht in het submenu celgegevens , waar het aantal afbeeldingen, de aantallen per afbeelding en het percentage netten per afbeelding worden weergegeven. Opmerking: het totale percentage van de netten in de gehele gegevensset wordt weergegeven door de "NET-gauge". Het totale aantal afbeeldingen, het aantal cellen, het percentage netten in het monster (netten%) en netten% in het controlemonster worden weergegeven in de tabel met overzichtsstatistieken onder de NET-gauge. Wij raden aan dat de controlegegevens worden gerapporteerd naast de gegevens die zijn verkregen uit gestimuleerde monsters.</li>
	</ol></li>
	<li>Resultaat uitgangen
	<ol>
<li>Voer het tabblad uitvoer in om resultaat uitvoer te selecteren en weer te geven.</li>
		<li>Verken en vergelijk de verschillende gegevens uitgangen die zijn gegenereerd op basis van de analyse van Control en PMA door de vorm van de uitvoer te selecteren en op de knop uitvoer resultaten te klikken. Opmerking: alle gegevens die na de analyse worden gegenereerd voor zowel besturingselementen als stimulaties, worden opgeslagen in de map analyse zoals gekozen in het submenu target. Gegevens worden opgeslagen in CSV-of PDF-indeling.</li>
		<li>Start het methode bestand om de versie van de software en de nettocriteria te verkrijgen die worden gebruikt voor de analyse (om te worden opgenomen in de sectie methoden voor publicatiedoeleinden).</li>
		<li>Klik op de tabel met resultaten gegevens om de afzonderlijke gegevenspunten in een bepaald voorbeeld te visualiseren.</li>
		<li>Visualiseer de netto-gebieds verdeling en DNA: nettoverhouding in de monsters. De rode lijn geeft de drempelwaarde in de grafieken aan.</li>
		<li>Bepaal de netto-oppervlakte versus de vorm van het DNA door op het bivariate distributie bestand te klikken.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorige analyse laden en alle stappen batchgewijs uitvoeren
	<ol>
<li>Laad eerder succesvolle analyse-instellingen in NETQUANT met de knop vorige analyse laden .</li>
		<li>Gebruik de knop batch alle stappen in het Setup -menu om stap 5 \ u201212 (afbeelding 1, Figuur 2, Figuur 3, Figuur 4, figuur 5) rechtstreeks uit te voeren om de uiteindelijke uitvoer te verkrijgen.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Nauseef, W. M., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+at+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils at work.</a> Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).</li>
<li>Borregaard, N., Cowland, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granules+of+the+human+neutrophilic+polymorphonuclear+leukocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte.</a> Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).</li>
<li>Nordenfelt, P., Tapper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+dynamics+during+phagocytosis+by+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils.</a> Journal of Leukocyte Biology. 90 (2), 271-284 (2011).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Sorensen, O. E., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+-+the+dark+side+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps - the dark side of neutrophils.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).</li>
<li>Yipp, B. G., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETosis%3A+how+vital+is+it%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NETosis: how vital is it?</a> Blood. 122 (16), 2784-2794 (2013).</li>
<li>Jorch, S. K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).</li>
<li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li>
<li>Mohanty, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mechanism+for+NETosis+provides+antimicrobial+defense+at+the+oral+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A novel mechanism for NETosis provides antimicrobial defense at the oral mucosa.</a> Blood. 126 (18), 2128-2137 (2015).</li>
<li>Hakkim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Raf-MEK-ERK+pathway+is+required+for+neutrophil+extracellular+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).</li>
<li>Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+quantification+of+in+vitro+NET+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Automatic quantification of in vitro NET formation.</a> Frontiers in Immunology. 3, 413(2012).</li>
<li>Coelho, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+determination+of+NET+%28neutrophil+extracellular+traps%29+coverage+in+fluorescent+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Automatic determination of NET (neutrophil extracellular traps) coverage in fluorescent microscopy images.</a> Bioinformatics. 31 (14), 2364-2370 (2015).</li>
<li>Mohanty, T., Sorensen, O. E., Nordenfelt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETQUANT%3A+Automated+Quantification+of+Neutrophil+Extracellular+Traps%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">NETQUANT: Automated Quantification of Neutrophil Extracellular Traps.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1999(2017).</li>
<li>Kaplan, M. J., Radic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+double-edged+swords+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity.</a> Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).</li>
<li>Cedervall, J., Olsson, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity+Gone+Astray+-+NETs+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Immunity Gone Astray - NETs in Cancer.</a> Trends in Cancer. 2 (11), 633-634 (2016).</li>
<li>Ginley, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+detection+and+quantification+of+human+and+mouse+neutrophil+extracellular+traps+in+flow+cytometry+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Computational detection and quantification of human and mouse neutrophil extracellular traps in flow cytometry and confocal microscopy.</a> Scientific Reports. 7 (1), 17755(2017).</li>
</ol>

TM en PN hebben een patent in behandeling met betrekking tot de algoritmen die worden gebruikt in NETQUANT.

NET Formation is een relatief recente toevoeging aan het gevarieerde neutrofiele armamentarium4 en er is een opvallende Golf van belang om de implicatie van netten te bestuderen in een breed scala aan onderzoeksgebieden5,7,14,15. Het verwerven van beelden met behulp van immunofluorescentie microscopie en daaropvolgende kwantificering op basis van afbeeldingen is een veel...

Neutrofielen zijn cruciale mediatoren van aangeboren gastheer verdediging reacties tegen een breed scala van microbiële pathogenen1. Ze voeren hun antimicrobiële functies uit door hun korrels vrij te geven die een breed scala aan antimicrobiële eiwitten2bevatten, die reactieve zuurstof soorten (Ros) en hypochloriet1produceren, en door fagocytose3. Daarnaast heeft Brinkmann et al. 4 beschreven neutrofiele extracellulaire vallen (netten) als een nieuw mechanisme waarmee neutrofielen vangen en invallende pathogenen elimineren. Sinds hun ontdekking iets meer dan een decennium geleden4, zijn netten betrokken bij een breed scala aan infectieuze5,6 en niet-infectieuze7 morbiiteiten. De netto-vorming is een actief proces en resulteert in de extrusie van chromatine-DNA bedekt met granule afgeleide antimicrobiële eiwitten8. Enkele van de belangrijkste veranderingen in cellulaire en nucleaire morfologie geassocieerd met de netto-vorming omvatten het verlies van nucleaire morfologie, chromatine decondensatie, mobilisatie van korrel eiwitten van cytoplasma tot de Nucleus en een toename van de nucleaire en cellulaire diameter8,9.
De web-achtige netten, die kunnen verschijnen als diffuse structuren iets groter dan de cel of als structuren meerdere malen groter dan een enkele neutrofiele worden beschouwd als indicatoren van netosis5,10. Met behulp van fluorescentiemicroscopie kunnen netten worden gedetecteerd door het indringende DNA met een fluorescerende sonde zoals 4 ', 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) en door immunofluorescentie kleuring tegen netgebonden eiwitten zoals neutrofiele elastase. Kwantificering van overlappende gebieden van kleuring voor DNA en NETGEBONDEN eiwitten bepaalt de totale oppervlakte onder netten in een afbeelding11.
Er zijn een aantal opties voorbeeld analyse beschikbaar voor het uitvoeren van fluorescentie op afbeeldingen gebaseerde kwantificering van netten11,12. Maar deze software opties aanwezig beperkingen in niet gebruiksvriendelijk en/of volledig geautomatiseerd. In dit artikel demonstreren we de werking van NETQUANT13, een vrij beschikbare app die onbevooroordeelde volledig geautomatiseerde immunofluorescentie microscopie beeld gebaseerde netto kwantificering kan uitvoeren. De app heeft een gebruiksvriendelijke grafische interface (GUI) en kan single-cell analyse uitvoeren. De software kwantificeert NETosis in een afbeelding door het detecteren van de morfologische veranderingen in het gebied van DNA-NET-gebonden marker, chromatine decondensatie geassocieerde vervorming van de Nucleus en toename van het DNA: netto-gebonden eiwit ratio. De meervoudige nettodefinitiecriteria maken het mogelijk om op onbevooroordeelde wijze een strikte netto-kwantificering over verschillende gegevensverzamelingen toe te voegen.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer Heparinised plastic tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>367885</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Axis-Shield</td><td>114547</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 met L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>50mL conische kolven</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td></td></tr><tr><td>15mL conische kolven</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>12-wells weefselkweekplaten</td><td>Falcon</td><td>10626491</td><td></td></tr><tr><td>#1 Dekglasjes 10mm</td><td>Menzel Glaser</td><td>CS10100</td><td></td></tr><tr><td>Glasplakjes</td><td>Menzel Glaser</td><td>631-0098</td><td></td></tr><tr><td>Primair anti-menselijke elastase</td><td>DAKO</td><td>DAKO konijn 1373, contractimmunisatie</td><td></td></tr><tr><td>Secundaire fluorofoor-geconjugeerde geitenanti-konijn</td><td>Life technologies</td><td>A-11072, A-11070</td><td></td></tr><tr><td>PROLONG-Gold Antifade reagens met DAPI</td><td>Life technologies</td><td>P36930</td><td>Montagemedium</td></tr><tr><td>Geitenserum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79346</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti-E Epifluorescente microscoop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Andor Zyla</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Apochromat 20x, 40x objectieven</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Windows 10</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Besturingssysteem</td></tr><tr><td>macOS Sierra 10.12</td><td>Apple</td><td></td><td>Besturingssysteem</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

geautomatiseerde kwantificering van neutrofiele extracellulaire traps met behulp van netquant

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Neutrofiele extracellulaire vallen (netten) zijn web-achtige antimicrobiële structuren die bestaan uit DNA en korrels afgeleide antimicrobiële eiwitten. Immunofluorescentie microscopie en op afbeeldingen gebaseerde kwantificeringsmethoden blijven belangrijke instrumenten voor het kwantificeren van neutrofiele extracellulaire trap vorming. Er zijn echter belangrijke beperkingen voor de immunofluorescentie methoden die momenteel beschikbaar zijn voor het kwantificeren van netten. Handmatige methoden van op afbeeldingen gebaseerde netto kwantificering zijn vaak subjectief, gevoelig voor fouten en vervelend voor gebruikers, vooral niet-ervaren gebruikers. Ook, momenteel beschikbare software-opties voor kwantificering zijn ofwel semi-automatische of vereisen opleiding voorafgaand aan de werking. Hier tonen we de implementatie van een geautomatiseerde immunofluorescentie-gebaseerde beeldkwantificerings methode om de netto-vorming genaamd NETQUANT te evalueren. De software is eenvoudig te gebruiken en heeft een gebruiksvriendelijke grafische gebruikersinterface (GUI). Het beschouwt biologisch relevante parameters zoals een toename van het oppervlak en DNA: netto marker eiwit ratio, en nucleaire vervorming om de netto-vorming te definiëren. Bovendien is deze tool gebouwd als een vrij beschikbare app, en maakt het mogelijk om kwantificering en analyse van één cel te herleiden.

5 x 105 neutrofielen/ml werden in een 12-well plaat geplaatst op de dekstroken en gestimuleerd met 20 nm PMA of ongeprikkeld gelaten voor 150 min. De monsters werden vervolgens bevlekt met behulp van primaire konijn anti-menselijke neutrofiele elastase antilichamen, secundaire geit anti-konijn de geconjugeerde antilichamen en DAPI-een fluorescently gelabelde kleurstof die DNA vlekken (Zie de tabel met materialen voor details). Een minimum van 5 beelden werd ver...

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van neutrofiele extracellulaire vallen (netten) en het bedienen van NETQUANT, een volautomatische software optie voor het kwantificeren van netten in immunofluorescentie beelden.

Geautomatiseerde kwantificering van neutrofiele extracellulaire traps met behulp van NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Hier presenteren we NETQUANT, een volledig geautomatiseerde aanpak voor het kwantificeren van NETS en immunofluorescentie beelden. Dit zal onderzoekers helpen bij het maken van vergelijkbare beeldanalyse op gegevens gegenereerd door meerdere gebruikers en voorwaarden. De voordelen van deze techniek zijn het gebruiksgemak, eencellige data-analyse, meerdere criteria om NET-vorming te evalueren en een onbevooroordeelde analyse van meerdere afbeeldingen.Installeer en open de analysesoftware. Een up-to-date versie is te vinden op het Zenodo GitHub archief, of de Nordonfelt Lab website. Kies op het tabblad Setup een bronmap voor analyse door op de optie Pad ophalen in het bronmenu te klikken.Selecteer de map met de te analyseren afbeeldingsreeksen. Klik nogmaals op de optie Pad ophalen in het doelmenu en selecteer de doelmap voor het opslaan van de gegevens die de afbeeldingsanalyse volgen. Vervolgens, bij het gebruik van afzonderlijke kanaalbeelden, een naam van de kanaalmappen, zodat het DNA-kanaal overeenkomt met de nucleaire DNA-vlek, en het NET-kanaal toont de neutrofiele elastase vlek in de beelden.Geef ook de map met de besturingselementafbeeldingsbestanden als controle. Klik vervolgens op de knop Afbeeldingsgegevens laden en laad de metagegevens van de afbeelding in de software. Selecteer vervolgens in het submenu kanaalvolgorde de juiste kanaalvolgorde in de afbeeldingen.Dit helpt om toevallige mismatches te voorkomen. Klik nu op de knop Gegevens voorbereiden om primaire afbeeldingseigenschappen uit de ruwe gegevens te verkrijgen en de afbeeldingen om te zetten. De geconverteerde afbeeldingen worden vervolgens weergegeven in het submenu voorbeeldtypen.Klik op het voorbeeldtypemenu, selecteer een afbeelding in het submenu en klik op weergavegegevens om de afbeeldingen weer te geven die zijn opgesplitst in respectievelijk het DNA- en Neutrophil Extracellular Trap of het NET-kanaal. Als u de cellen wilt segmenteren in hun respectieve kanalen, selecteert u het tabblad segmentatiemethode en selecteert u een methode in het submenu methode voor zowel de DNA- als de NET-kanalen. De standaardmethode voor segmentatie is ingesteld op adaptief en is de aanbevolen instelling.Andere opties zijn beschikbaar in de software, waaronder global edge en chanverse. Een keerpunt optie is ook opgenomen om te helpen onderscheid maken tussen nauw geplaatste cellen of NETs. Klik ook op het tabblad segmentatie op de optie segmentbesturingselementen.Selecteer vervolgens PMA in het submenu voorbeeldtype en klik op de batchoptie om te beginnen met het segmenteren van alle afbeeldingen die in de gegevensset zijn opgenomen. Selecteer vervolgens de afbeeldingen in het voorbeeldtypemenu en klik op de knop Weergavegegevens om de binaire afbeeldingsmaskers te visualiseren en te valideren voor zowel de DNA- als NET-maskers die na segmentatie zijn gegenereerd. Klik nu op het tabblad analyse op de knop Drempel bepalen om de besturingselementen te analyseren.Wijzig vervolgens aan de rechterkant het monstertype in PMA en klik op de knop Celeigenschappen ophalen om de analyse van de gestimuleerde monsters te voltooien. Selecteer vervolgens een afbeelding in het submenu voorbeeldtype en klik op de knop Weergavegegevens om de overlay en het aantal cellen en NET-vormende cellen in de afbeelding weer te geven. Begin met het selecteren van het voorbeeld in het submenu voorbeeldtype.Afzonderlijke afbeeldingen kunnen worden geselecteerd uit het submenu van het voorbeeldtype voor analyse of de volledige batch afbeeldingen kan worden geanalyseerd door de batchoptie te selecteren. Eenmaal geselecteerd, klikt u op de knop NETs analyseren om de analyse te voltooien. Pas netcriteria handmatig aan om optimale resultaten te behalen voor een bepaald monster.Vergelijk geïdentificeerde NETs met de originele afbeeldingen om de kwaliteit van de identificatie te beoordelen. Zodra deze stap is voltooid, kunnen de NET-criteria worden toegepast op alle afbeeldingen in de gegevensset. Eventuele wijzigingen in de NET-criteria worden ook gelijktijdig toegepast op alle controlemonsters.Controleer het gegevensoverzicht in het submenu celgegevens, waar het aantal afbeeldingen, het aantal cellen per afbeelding en het percentage NET's per afbeelding worden weergegeven. Voer het uitvoertabblad in om de resultatenuitgangen te selecteren en weer te geven. Verken en vergelijk de verschillende gegevensuitgangen die zijn gegenereerd uit de analyse van besturings- en PMA-behandelde monsters door de vorm van de uitvoer te selecteren en op de knop uitvoerresultaten te klikken.Start vervolgens het CSV-bestand met de resultatengegevenstabel om gegevens met één cel te verkennen en klik op de pdf-bestanden voor de resultaten om de net-gebiedsverdeling en DE VERHOUDING DNA naar NET in de monsters te visualiseren. De rode lijn geeft de drempelwaarde in de grafieken aan. Tot slot, klik op de resultaten bivariate distributiebestand om het NET gebied versus vorm van DNA te bepalen.Hier werden 15 beelden van controlenetrofielen en 15 beelden van PMA-gestimuleerde neutrofielen geanalyseerd in minder dan tien minuten. Het totale aantal cellen werd geteld en het percentage cellen met Neutrophil Extracellular Traps werd bepaald met behulp van de geautomatiseerde kwantificeringsmethode beschreven in dit artikel. Deze resultaten tonen aan dat PMA-gestimuleerde neutrofielen een groter gebied hebben, een toename van nucleaire vervorming en een hogere DNA-tot NET-ratio dan controlemonsters.In combinatie met een 3D-grafiek vertonen de pma-gestimuleerde monsters vaak gebieden van aanscherpingsgroepen dan de controlemonsters. Tijdens het proberen van de procedure, is het belangrijk om te onthouden dat, hoewel de workflow werd getest met behulp van meerdere donoren, is het raadzaam dat de gebruiker moet beslissen over de software parameters op de juiste manier op basis van de individuele gegevensset.

automated-image-based-quantification-neutrophil-extracellular-traps

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates the induction and visualization of neutrophil extracellular traps or NETs in pre-labeled neutrophils using patient serum containing anti-neutrophil cytoplasmic antibodies. Furthermore, using an impermeable DNA dye and fluorescence microscopy enables the visualization of NETs.

Induction and Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Pre-Labeled Neutrophils

We beschrijven de methoden om te isoleren canine neutrofielen van volbloed en visualiseren van netto vorming in levende neutrofiele granulocyten met behulp van fluorescentie microscopie. Ook beschreven zijn protocollen te kwantificeren netto vorming en citrullinated Histon H3 (citH3)-expressie met immunofluorescentie microscopie.

In Vitro Canine neutrofiele extracellulaire Trap vorming: Dynamische en kwantitatieve analyse door fluorescentie microscopie

Dit protocol beschrijft een zeer gevoelige en hoge doorvoer neutrofiele extracellulaire val (NET) assay voor de semi-automatische kwantificering van ex vivo NET vorming door immunofluorescentie driedimensionale confocale microscopie. Dit protocol kan worden gebruikt voor het evalueren van de netto vorming en afbraak na verschillende prikkels en kan worden gebruikt voor het bestuderen van potentiële NET-gerichte therapieën.

Een High-throughput Assay voor het beoordelen en kwantificeren van neutrofiele extracellulaire Trap vorming

Neutrofiele extracellulaire vallen (netten) zijn driedimensionale structuren gegenereerd door geprikkeld neutrofiele granulocyten. Het is in de afgelopen jaren duidelijk geworden dat netten betrokken zijn bij een grote verscheidenheid aan ziekten. Detectie van netten in weefsel kan diagnostische relevantie hebben, zodat gestandaardiseerde protocollen voor het labelen van NETTOCOMPONENTEN vereist zijn.

Immunofluorescentie-etikettering van humane en Muriene neutrofiele extracellulaire vallen in paraffine-ingesloten weefsel

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de inductie en analyse van in vitro neutrofiele extracellulaire vallen (NET's). Kwantificering van DNA, cathelicidin (LL37) en enzymactiviteit leverde gegevens op die de variabiliteit in de samenstelling en morfologie van NET's geïnduceerd door microbiële en chemische stimuli onder vergelijkbare gecontroleerde omstandigheden aantonen.

Morfologische en compositorische analyse van neutrofiele extracellulaire vallen geïnduceerd door microbiële en chemische stimuli

Neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) worden in verband gebracht met verschillende ziekten en immunofluorescentie wordt vaak gebruikt voor hun visualisatie. Er zijn echter verschillende kleuringsprotocollen en in veel gevallen wordt slechts één type weefsel onderzocht. Hier stellen we een algemeen toepasbaar protocol op voor het kleuren van NET in muizen en menselijk weefsel.

Immunofluorescentiebeeldvorming van neutrofiele extracellulaire vallen in menselijke en muizenweefsels

We presenteren een geautomatiseerde high-throughput methode om neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) te kwantificeren met behulp van het live cell analysesysteem, gekoppeld aan een membraanpermeabiliteit-afhankelijke dual-dye benadering.

Real-time High Throughput-techniek om de vorming van extracellulaire neutrofielen in menselijke neutrofielen te kwantificeren

Dit gedefinieerde protocol beschrijft een real-time high-throughput microscopiebenadering om de afgifte van humane neutrofielen extracellulaire val (NET) in vitro te visualiseren en te kwantificeren. De reproduceerbare methode maakt onderzoek mogelijk naar de kenmerken en kinetiek van NETosis-afgifte na stimulatie met verschillende NETosis-inductoren en maakt beoordeling van de farmacologie van NETosis-antagonisten mogelijk.

Realtime, high-throughput microscopische kwantificering van de afgifte van extracellulaire vallen van menselijke neutrofielen en beoordeling van de farmacologie van antagonisten

Neutrofielen extracellulaire Vallen (NET's) zijn een belangrijk aangeboren immuun mechanisme om pathogene bacteriën, schimmels en parasieten te bestrijden. Hier beschrijven we methoden om neutrofiele granulocyten isoleren uit menselijk bloed en ze te activeren om netten te vormen. We presenteren bereidingstechnieken aan netten in licht-en elektronenmicroscopie te visualiseren.

Neutrofielen Extracellulaire Traps: Hoe te genereren en te visualiseren

Een protocol voor de gelijktijdige kwantificering en vergelijking van drie cellulaire en extracellulaire componenten binnen biofilms wordt gepresenteerd. De methodologie omvat het gebruik van confocale laserscanningmicroscopie, software voor biofilmstructuuranalyse en -visualisatie, en statistische analysesoftware.

Concurrent Kwantificering van Cellulaire en extracellulaire componenten van biofilms

Leer NETQUANT voor geautomatiseerde kwantificering van neutrofiele extracellulaire traps in immunofluorescentiebeelden. Deze software biedt consistente, onbevooroordeelde analyse voor immunologisch onderzoek.

Geautomatiseerde kwantificering van neutrofiele extracellulaire traps met behulp van NETQUANT

Meer video's verkennen