Afzondering, fixatie en immunofluorescentie beeldvorming van muis bijnieren

Immunofluorescentie is een basismethode die kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het bijnierveld over bijnierzonatie, celidentiteit en functie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de studie van meerdere eiwitten mogelijk maakt met behoud van de morfologie van het bijnierweefsel. Om de murine bijnier te verwijderen, snijd rond het omringende vetweefsel en plaats de klier in een put van een 24-multiwell plaat met verse PBS op ijs.

Breng de klier op een petrischaal of glazen steun onder een ontledenmicroscoop en gebruik twee 25 meter naalden om het aangrenzende vetweefsel te verwijderen. Wanneer al het vet is verwijderd, bevestig het weefsel in 4%paraformaldehyde op vier graden Celsius met schommelen voor twee uur. Aan het einde van de incubatie spoel de klier af met drie wasbeurten van 15 minuten bij vier graden Celsius in één tot twee milliliter verse PBS per wasbeurt.

Na de laatste wasbeurt dehydrateer de klier in twee opeenvolgende ethanolonderdompeling bij vier graden Celsius met twee uur schommelen per incubatie. Om het bijnierweefsel voor te bereiden op verwerking, wikkel de klier in gaas en sluit het bijnier in een weefselbedding cassette. Plaats vervolgens de cassette in een pot gevuld met 70% ethanol voor vier graden Celsius opslag tot verwerking.

Om het weefsel te verwerken, steek je de cassette in de weefselprocessor voor verwerking zoals aangegeven in de tabel. Breng de cassette aan het einde van het programma over in een inbeddingsstation gevuld met gesmolten 65 graden paraffine en gebruik een paar tangen om het gaas uit te pakken. Breng de bijnier voorzichtig over in de juiste positie in het midden van de basis van de inbeddingsvorm en giet de gesmolten paraffine op de klier.

Verplaats vervolgens voorzichtig de inbeddingsvorm naar een koellade om de verharding van de paraffine te vergemakkelijken. Voor het doorkuren door roterende microtome, label een reeks microscoop dia's en leg de dia's op een 37 graden Celsius dia-warmer. Geef ongeveer 450 microliters van autoclaved type één ultra zuiver water op elke dia en stel de sectie snijden dikte van het microtome op vijf micrometer.

Laad het ingebedde weefsel op het snijblok en laat het paraffineblok zakken totdat het monster zich op het vlakke niveau bevindt met de rand van het microtomeenblad. Het draaien van het handwiel met een stabiel ritme, het uitvoeren van een eerste trimmen om de paraffine te verwijderen en bloot het bijnierweefsel. Verwerf vervolgens vijf micrometersecties tot het einde van de bijnier met behulp van tangen om elke sectie over te brengen in de waterdruppel op een van de vooraf gelabelde dia's terwijl deze wordt verzameld.

Na bevestiging van de aanwezigheid van weefsel in de secties door microscopie, droog de glijbanen op de hete plaat voor ongeveer twee uur en bak ze ten minste 's nachts op een dia lade op 37 graden Celsius totdat er geen water meer zichtbaar is. Eenmaal droog, bewaar de dia's in een diavak op kamertemperatuur. Voor immunofluorescentie antigeneraal retrieval, de-paraffine de dia's met twee vijf minuten 100%xylene onderdompees, gevolgd door rehydratie in een dalende ethanol en water onderdompeling serie.

Breng na de wateronderdompeling de glijbanen over op een metalen schuifhouder en plaats de houder gedurende 10 minuten in een bekertje kokend 0,01 molar citraat op een hete plaat. Verwijder aan het einde van de incubatie het bekerglas van de kookplaat en laat het 20 minuten afkoelen, waarbij ervoor wordt gezorgd dat alle bijniersecties nog steeds bedekt zijn met een buffer. Wanneer het bekerglas wordt gekoeld, breng je de glijbanen in een Coplin-pot voor drie wasbeurten van 10 minuten in verse PBS met zacht schommelen.

Na de laatste wasbeurt, zorgvuldig veeg het oppervlak van elke dia zonder beschadiging van de weefselsecties en gebruik een hydrofobe marker om een cirkel rond elke sectie te maken. Plaats de glijbanen in een bevochtigde kamer en voeg snel ten minste 50 microliter blokkeringsoplossing toe aan elke sectie voor een incubatie van een uur bij kamertemperatuur. Aan het einde van de blokkerende incubatie, was de glijbanen drie keer in verse PBS gedurende vijf minuten per wasbeurt met schommelen en terug glijbanen naar de kamer.

Voeg vervolgens de primaire antilichaamcocktail van belang toe aan elke sectie voor een nachtelijke incubatie bij vier graden Celsius. De volgende ochtend was je de monsters met drie wasbeurten van 15 minuten in verse PBS per wasbeurt en label je de glijbanen met de juiste secundaire antilichaamoplossing gedurende een uur beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie, was de monsters met drie wasbeurten van 15 minuten op een tuimelschakelaar beschermd tegen licht, waarbij de kernen van de secties zeven minuten met DAPI worden gelabeld bij kamertemperatuur die na de laatste wasbeurt tegen licht is beschermd.

Na drie pbs-wasbeurten van vijf minuten met schommelen, voeg 60 microliter montagemiddel toe dat geschikt is voor immunofluorescentie langs het oppervlak van één afdekglas per monster en druk deze schuifweefselsectiezijde licht op een afdekglas, waarbij u ervoor zorgt dat bellen worden vermeden. Leg vervolgens elke dia plat in een donkere container om ten minste 24 uur op kamertemperatuur te genezen voordat de beeldvorming wordt gebruikt. Tijdens het vetverwijderingsproces is het van cruciaal belang om de bijnier niet uit te laten drogen, omdat uitdroging de weefselstructuur kan beschadigen.

Na een succesvolle verwijdering van het omringende vetweefsel moet de bijnier gemakkelijk detecteerbaar zijn zonder extra zichtbaar vet. Immunostaining van bijnier secties zoals aangetoond onthult nucleaire steroïde factor een kleuring van de adrenocortical cellen, tyrosine hydroxylase vlekken van de medullaire cellen, DAPI vlekken van de kernen van niet-steroïdeogene cellen van de buitenste capsule, en co-vlekken met adrenocortical en medullaire cellen. Bij het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat de muis bijnieren zijn klein en dat hun posities zijn enigszins variabel waardoor hun detectie moeilijk.

Daarom is het van cruciaal belang om tijdens de ontleding een duidelijk beeld te hebben van het gebied. Deze procedures zijn basistechnieken voor de studie van de bijnier in vivo. Hierna kunnen aanvullende methoden voor immunostaining worden uitgevoerd om aan specifieke wetenschappelijke behoeften te voldoen.

Na de ontwikkeling maakte immunostaining de weg vrij voor onderzoekers op biomedische wetenschapsgebieden om in situ eiwitexpressie te verkennen, een nuttig instrument in vele disciplines en vakgebieden.