Name: Meten van interacties van bolvormige en filamenteuze eiwitten door nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (NMR) en Microscale Thermophoresis (MST) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Leer hoe je eiwit-eiwitinteracties karakteriseert met NMR-spectroscopie en Microscale Thermophoresis. Dit protocol gebruikt stabiele isotooplabeling voor atomaire inzichten in bindingsaffiniteiten en eiwitdynamica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit project werd ondersteund door NSERC RGPIN-2018-04994, Campus Alberta innovatie programma (RCP-12-002 C) en Alberta Prion Research Institute / Alberta innoveert Bio oplossingen (201600018), toegekend aan M.O en genoom Canada en Canada Stichting voor Innovatie subsidies toegekend aan The metabolomica innovatie centrum (TMIC) en NANUC.

<ol><li>Vinogradova, O., Qin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+as+a+unique+tool+in+assessment+and+complex+determination+of+weak+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Topics+in+Current+Chemistry%22%5BJournal%5D)">NMR as a unique tool in assessment and complex determination of weak protein-protein interactions.</a> Topics in Current Chemistry. 326, 35-45 (2012).</li>
<li>McKercher, M. A., Wuttke, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+Chemical+Shift+Mapping+of+SH2+Peptide+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">NMR Chemical Shift Mapping of SH2 Peptide Interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 1555, Clifton, N.J. 269-290 (2017).</li>
<li>Al-Jassar, C., Bikker, H., Overduin, M., Chidgey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+Basis+of+Desmosome-Targeted+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanistic Basis of Desmosome-Targeted Diseases.</a> Journal of Molecular Biology. 425 (21), 4006-4022 (2013).</li>
<li>Fogl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+intermediate+filament+recognition+by+plakin+repeat+domains+revealed+by+envoplakin+targeting+of+vimentin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mechanism of intermediate filament recognition by plakin repeat domains revealed by envoplakin targeting of vimentin.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Protein+Protocols+Handbook%22">The Protein Protocols Handbook</a>. Walker, J. M. , 2nd ed, Humana Press. (2002).</li>
<li>Wishart, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1H%2C+13C+and+15N+chemical+shift+referencing+in+biomolecular+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+NMR%22%5BJournal%5D)">1H, 13C and 15N chemical shift referencing in biomolecular NMR.</a> J. Biomol. NMR. 6, 135-140 (1995).</li>
<li>Casali, N. Escherichia coli Host Strains. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCasali%2C+N+%22E.+coli+Plasmid+Vectors%22">E. coli Plasmid Vectors</a>. , Humana Press. 27-48 (2003).</li>
<li>Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).</li>
<li>Kozak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+protein+samples+for+NMR+using+thermal+shift+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Nmr%22%5BJournal%5D)">Optimization of protein samples for NMR using thermal shift assays.</a> Journal of Biomolecular Nmr. 64, 281-289 (2016).</li>
<li>Burgess, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+practical+review+of+size+exclusion+chromatography%3A+Rules+of+thumb%2C+limitations%2C+and+troubleshooting%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">A brief practical review of size exclusion chromatography: Rules of thumb, limitations, and troubleshooting.</a> Protein Expression and Purification. , In Press (2018).</li>
<li>Kunji, E. R. S., Harding, M., Butler, P. J. G., Akamine, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+molecular+mass+and+dimensions+of+membrane+proteins+by+size+exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of the molecular mass and dimensions of membrane proteins by size exclusion chromatography.</a> Methods. 46 (2), 62-72 (2008).</li>
<li>Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+light+scattering%3A+a+practical+guide+and+applications+in+biomedical+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).</li>
<li>Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation%3A+A+versatile+tool+for+the+characterisation+of+macromolecular+complexes+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution.</a> Methods. 95, 55-61 (2016).</li>
<li>Pearson, J. Z., et al. Chapter One - Next-Generation AUC Adds a Spectral Dimension: Development of Multiwavelength Detectors for the Analytical Ultracentrifuge. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687915003936">Methods in Enzymology</a>. Cole, J. L. 562, Academic Press. 1-26 (2015).</li>
<li>Gorbet, G. E., Pearson, J. Z., Demeler, A. K., Cölfen, H., Demeler, B. Chapter Two - Next-Generation AUC: Analysis of Multiwavelength Analytical Ultracentrifugation Data. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687915002980">Methods in Enzymology</a>. Cole, J. L. 562, Academic Press. 27-47 (2015).</li>
<li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nature Communications. 1, 100(2010).</li>
<li>Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022286014002750">MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond.</a> Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).</li>
</ol>

De auteurs vermelden geen belangenconflicten.

De 2D 15N-resolved NMR experiment is een van de meest gebruikte methoden om te laten zien hoe twee moleculen samenwerken. Het is de meest informatie-rijke methode waarmee signalen uit beide partners naar permanent te worden bewaakt door een titratie experiment in oplossing staat. Hoewel meestal kwalitatieve in het geval van grote complexen, de methode kan ook worden gebruikt in gunstige gevallen voor het meten van bindende affiniteiten waar NMR signalen kunnen worden getraceerd in hoge resolutie spectra. Indien toewijzingen kunnen gemakkelijk worden gedaan, kunnen zoals in het geval van veel eiwitten onder 20 kDa in grootte, de bandplaatsen ook worden toegewezen. Aanvullende tests zoals MST kwantitatieve informatie verschaffen over interacties in oplossing, en vereist minder eiwit in labelloze Staten. Vergelijking van mutant bindende gegevens is nuttig voor het verstrekken van de controles om ervoor te zorgen dat interacties blijkt door NMR lijn verbreding echte en niet artefacten van, bijvoorbeeld, aggregatie of viscositeit veranderingen.
Eiwit expressie
Stroomlijning van het proces van expressie, vermindert de hoeveelheid arbeid intensieve eiwitproductie. Onderdeel van deze optimalisatieproces omvat identificatie van een passende stam van E. coli om recombinant eiwit. Stam voorkeur hangt af van elementen met inbegrip van de aard van de vector in gebruik en, meer in het bijzonder, de ultieme stabiliteit van de recombinant eiwit wordt uitgedrukt7. Het risico van aantasting van het heterologe eiwit door endogene E. coli proteasen kunnen worden verminderd door gebruik van protease gebrekkig E. coli zoals de BL21-stam. Voor genen met zeldzame codonen, kan een stam zoals BL21-CodonPlus (DE3) RIPL zijn voorkeur. Deze spanning combineert de protease gebrekkige aard van de BL21-stam met extra endogene kopieën van zeldzame codon tRNAs voor arginine, isoleucine, leucine en proline. Anderzijds kunnen zeldzame codonen die overexpressie in gevaar kunnen brengen worden vermeden door het bestellen van een codon-geoptimaliseerde constructie van een commerciële bron. Veel stammen van E. coli zijn beschikbaar voor recombinante genexpressie, elk geoptimaliseerd voor omzeiling van een bepaald probleem tijdens expressie7. In het geval van deze studie, de standaard protease gebrekkig stam BL21(DE3) geproduceerd voldoende hoeveelheden van oplosbare eiwitten voor verdere zuivering en analyse.
Eiwitreiniging
Het protocol van de reiniging voor een bepaald eiwit is vaak uniek in die zin dat elke proteïne stabiel en oplosbare onder verschillende omstandigheden zoals zoute concentratie, temperatuur en pH blijft. De algehele effectiviteit van de zuivering door affiniteitchromatografie is ook gevoelig voor de concentratie van eluerende soorten zoals imidazool op verschillende stappen tijdens het zuiveringsproces. In dit werk waren kritisch buffer voorwaarden voor IMAC pH voor de E-PRD en imidazol concentratie voor de VimRod. Een pH van 7.5 was nodig om te voorkomen dat neerslag van de E-PRD na eerste elutie van de IMAC-kolom. Voor de IMAC zuivering van VimRod, verhoging van de concentratie van imidazool van 30 tot 50 mM tijdens de kolom wassen stap bleek te hebben een substantiële verbetering in de zuiverheid van de definitieve elutie breuken. Voor de elutie stap, verhoging van de concentratie van imidazool van 250 tot 350 mM ook bleek te verbeteren van het rendement van de uiteindelijke elutie. Eerste pogingen om het eiwit met behulp van 250 mM imidazool Elueer geleid tot onvolledige elutie van VimRod zoals onthuld door een definitieve 1 M imidazool strook van de kolom (gegevens niet worden weergegeven). Verhoging van de concentratie van de imidazool tot 350 mM voor de elutie was voldoende om te herstellen van alle van het eiwit gebonden aan de kolom. S kan dienen een tweeledig doel omdat het fungeert als een polijst stap voor eiwitreiniging tijdens het gelijktijdig uitvoeren van buffer uitwisseling. Buffer uitwisseling is een cruciale stap voor latere bindende analyse, aangezien het verwijdert de imidazool gewend Elueer His6-gelabeld eiwit. Het dient ook als een kans om te veranderen van aandoeningen zoals zoutconcentratie of pH, die mogelijk van invloed op de werkzaamheid van bepaalde downstream technieken of testen. Eiwit thermische shift (PTS) kan worden gebruikt voor het identificeren van de optimale buffers voor downstream testen, vooral voor diegenen die van stabiele eiwitten voor langdurige perioden bij kamertemperatuur8,9.
Bindende analyse
Eiwit dat is vers bereid is essentieel voor nauwkeurige bindende analyses, hoewel bevroren eiwit kan ook worden gebruikt, zolang de resultaten worden vergeleken. Filamenteuze eiwitten zoals vimentin multimerize in een zout en pH afhankelijke mode, en dus de oplossing moet worden geoptimaliseerd en de oligomere staat geschat door een methode zoals SEC10,11, dynamisch licht verstrooiing conditie 12 of analytische ultracentrifugatie13,14,15. NMR-spectroscopie is geschikt voor het meten van de ligand interacties van kleine eiwitten met atomaire resolutie. Echter, wanneer een eiwit met grotere molecuul interageert, langzamer tumbling ontstaat en dit in verlies van signalen, die bindende bevestigen resulteert, kan hoewel het niet noodzakelijkerwijs toestaan toewijzing van bindende sites, waarbij ook toewijzing van ten minste ruggengraat resonanties. In dit scenario staan NMR experimenten geen identificatie van de interactie-site. Dus geleide plaats mutagenese wordt toegepast ter identificatie van de kritische residuen die nodig zijn voor de binding. Dergelijke mutanten daarom vertonen geen signaalverlies. In dit protocol, een gemuteerde vorm met een substitutie op positie 1914 behoudt de piek-intensiteiten in aanwezigheid van VimRod en bevestigt derhalve verstoring van de interactie van E-PRD en VimRod. Toewijzing van de ruggengraat en sidechain resonanties zou een toegevoegde waarde aan deze aanpak, vooral omdat de structuur voor de gratis E-PRD is opgelost door middel van röntgendiffractie4. Toekomstige toepassingen van de NMR omvatten karakterisatie van complexe interacties tussen grotere moleculen en zullen profiteren van ultra hoge veld magneten en het gebruik van andere waarneembare groepen zoals 13C-gelabeld en trifluor methylgroepen als verslaggevers.
MST heeft een aantal voordelen voor de studie van bindende interacties16. De bindende-partners zijn vrij in de oplossing en niet geïmmobiliseerdet. Analyse van de kwaliteit van de monsters is ingebouwd in de software met kwaliteitscontrole rapportage van aggregatie, adsorptie aan de haarvaten of onvoldoende fluorescerende labeling van de doelmolecule. Kleine hoeveelheden van het doel worden doorgaans gebruikt, de concentratie van de gelabelde doel is meestal tussen 20-50 nM in een 10-20 μL volume/reactie. Dit protocol maakt gebruik van zeer kleine reactie volumes (10 μL) te maximaliseren van de concentratie van ligand die kan worden bereikt in de titraties waardoor zwak bindend interacties te worden gekarakteriseerd. Dit vereist nauwkeurige pipetteren en zorg worden genomen om te voorkomen dat de invoering van bellen terwijl nog grondig mengen. Voldoende mengen is essentieel voor accurate, consistente fluorescentie metingen langs de seriële verdunningen. De hoeveelheid van de Tween-20 in de MST experimenten werd teruggebracht van een standaard 0,05 tot 0,015% te verlagen van de neiging om te maken bellen en verbeteren mengen.
De RED-Tris-NTA kleurstof biedt een snelle, gemakkelijke en handige manier om fluorescently label een eiwit dat een heeft label. De etikettering is effectief voltooid in slechts 30 minuten en is zeer strak, zodat de procedure voor het verwijderen van geen kleurstof nodig is. Geen wijzigingen zijn aangebracht in aminozuurresidu's in het eiwit dat de ligand bindende eigenschappen kunnen wijzigen. Een valkuil is dat alleen het eiwit worden gelabeld een tag His6 moet hebben. Dit vereist het splijten van de tag van het ligand-eiwit, E-PRD en de verwijdering van de tag en de uncleaved E-PRD met een tweede stap van de kolom in de IMAC. Indien mogelijk, moet de ligand-eiwit bereid zijn zonder het gebruik van een zijn label. U kunt ook kunnen eiwitten covalent worden aangeduid met een fluorophore door middel van amine koppelen aan lysine residuen of thiol koppelen aan cysteïne residuen. Echter wees voorzichtig bij het gebruik van dergelijke systemen sinds de covalente bevestiging van een fluorophore invloed kan zijn op elektrostatische of polar bindende interacties afhankelijk van lysine of cysteïne residuen. De kwantificering van bindende affiniteit tussen de VimRod en de E-PRD door MST was ongewoon gevoelig voor de concentratie zout. Dit probleem werd verzacht door in eerste instantie zowel de doelgroep als ligand in dezelfde batch van assay buffer dialyzing. Niettemin, verzadiging van de MST bindende curve niet kon worden bereikt bij het uitvoeren van de bepaling van de MST in aanwezigheid van 150 mM NaCl als gevolg van de complexe gedrag van VimRod. Betrouwbare, volledige gegevens is verworven zodra de concentratie van NaCl werd verlaagd tot 10 mM, waardoor nauwkeurige berekening van de K-D. Vandaar, zorgvuldige optimalisatie van oplossing voorwaarden en vergelijking met aanvullende tests worden aanbevolen om robuuste resultaten te bereiken. MST kan bovendien worden gebruikt om kwantificeren van de zout afhankelijkheid voor een gegeven interactie, kwantificeren stoichiometrische eigenschappen van eiwit interacties, vouwing van de eiwitten van de monitor en sonde in enzyme kinetics17.

Interacties tussen eiwitten toestaan de vorming van moleculaire machines die order binnen cellen maken. De afzonderlijke interacties zijn vaak zwak maar meestal bijdragen aan multivalent complexen die coöperatieve en dynamisch geregeld kunnen worden. Gevoelige testen waarmee atomaire resolutie en kwantitatieve informatie over dergelijke complexe interacties zijn nodig om afleiden van mechanismen en interventies zoals drugs-achtige moleculen ontwerpen. NMR-spectroscopie is een efficiënte methode voor het verkrijgen van dergelijke informatie over eiwitinteractie, en ook wordt gebruikt voor snelle screening voor liganden met inbegrip van degenen die zwak1binden. De NMR-methoden gebruikt kunnen worden onderverdeeld in die zijn eiwitten observeren of ligand observeren. Dit manuscript maakt gebruik van de voormalige aanpak waarin een spectrum van een testing-isotoop label eiwit dat is relatief klein (meestal onder 20 kDa) wordt verworven en de labelloze ligand wordt getitreerd. Hierdoor de gelabelde residuen betrokken bij de interactie worden toegewezen in gunstige gevallen. Eenmaal de complexe vormen, zijn er veranderingen in de chemische omgevingen van interagerende residuen die zich als veranderingen in de chemische verschuiving manifesteren en vorm van hun NMR-signalen. De omvang van dergelijke wijzigingen correleert met de mate van betrokkenheid van deze groepen in de interactie. Chemische verschuiving verstoringen (CSP's) kunnen worden gemeten door het vergelijken van een reeks van NMR spectra van het eiwit verzameld in de afwezigheid en aanwezigheid van wisselende hoeveelheden van het ligand. Voor grotere liganden of complexe interacties, kan de verandering in de vorm van de piek of intensiteit worden gemeten om afleiden van interacties.
De meest voorkomende 2D experiment gebruikte voor het opsporen van ligand interacties is de 15N-heteronucleaire één quantum correlatie (HSQC) experiment2. Dit vereist dat een eiwit gelijkmatig worden gelabeld met 15N, die meestal wordt bereikt door het uiten van hen als affiniteit-tagged versies in E. coli bacteriele gegroeid in 15N verrijkte media. Bindende is duidelijk wanneer de spectra van de HSQC tijdens de titratie verzameld, zijn erover, piek wijzigingen voor een subset van residuen die betrokken zijn bij de complexvorming onthullen. De interactie kan optreden in het regime van de snelle uitwisseling waar de signalen van de vrije en ligand-verzadigd staat in een bevolking die gemiddeld piek samenvouwen. U kunt ook in het geval van langzame uitwisseling tussen de Staten, worden beide signalen waargenomen met integralen die hun relatieve bedragen vertegenwoordigen. Terwijl NMR lineshape analyse kan worden gebruikt om te schatten de bindende affiniteiten in sommige gevallen, zoals MST gebleken ook handige methodenen Kruis-validatie van echte interactie bieden.
Het voorbeeld is van twee eiwitten binnen desmosomes gevonden. Zij bemiddelen kruispunten tussen cel oppervlakken en het cytoskelet en bemiddelen multivalent interacties tussen cel adhesie machines en intermediaire filamenten te handhaven van de integriteit van de huid en hart weefsels en het weerstaan van schuintrekken krachten. Ziekten kunnen leiden tot wanneer desmosomal eiwitten zoals desmoplakin of vimentin zijn aangetast door mutaties of autoantilichamen, wat leidt tot destabilization van cel-cel kruispunten, en vandaar hun interacties van cruciaal belang3 zijn. De structurele basis van ligand binding door desmosomal eiwitten kan worden gekarakteriseerd door NMR spectroscopie, terwijl de interacties kunnen worden gekwantificeerd door MST. Hierin methoden werden gebruikt om het karakteriseren van de interacties tussen de plakin herhalen domeinen (PRDs), die vaak aanwezig als tandem verzamelingen die het aanbieden van fundamentele groeven en vimentin, een tussenliggende gloeidraad die via een zure oppervlak aangeboden door de spiraalvormige communiceert bundel4. Deze complexen worden gevormd op het celmembraan waar ze anker voor intermediaire filamenten van het cytoskelet van de cel te desmosomes die verbinding met de aangrenzende cellen maken, en vormt aldus een netwerk van zelfklevende obligaties die in een weefsel uitstraalt.

<table><tbody><tr><td>Monolith NT.115, inclusief besturings- en analysesoftware</td><td>NanoTemper Technologies</td><td>MO-G008</td><td>Instrument voor microschaal thermoforesis</td></tr><tr><td>His-Tag Labeling Kit RED-Tris-NTA</td><td>NanoTemper Technologies</td><td>MO-L008</td><td>RED-tris-NTA kleurstof voor MST</td></tr><tr><td>Standaard capillairen</td><td>NanoTemper Technologies</td><td>MO-K022</td><td>capillaren voor MST</td></tr><tr><td>HisTrap HP, 5 mL</td><td>GE Healthcare</td><td>17524801</td><td>IMAC-kolom</td></tr><tr><td>HisPur Ni-NTA hars, 100 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88222</td><td>IMAC-hars</td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg</td><td>GE Healthcare</td><td>28989333</td><td>SEC-kolom</td></tr><tr><td>TEV-protease</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4455</td><td>afsplitsing van his-tag van E-PRD</td></tr><tr><td>BL21(DE3) Competent E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527H</td><td>cellen voor eiwitexpressie</td></tr><tr><td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets EDTA-Free</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11873580001</td><td>protease-remmers voor eiwitzuivering door IMAC</td></tr><tr><td>TCEP, Tris(2-carboxyethyl)fosfinehydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706</td><td>reducerend middel voor eiwitzuivering</td></tr><tr><td>Reagentia (HEPES, NaCl, etc)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>diverse</td><td>Bereiding van media en buffers</td></tr><tr><td>Ammoniumchloride (15N, 99%)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>NLM-467</td><td>isotooplabeling voor NMR</td></tr><tr><td>D2O, Deuteriumoxide (D, 99,8%)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-2259</td><td>NMR-monstervoorbereiding</td></tr><tr><td>DSS, natrium 2,2-dimethyl-2-silapentaan-5-sulfonaat-D6 (D,98%)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-8206</td><td>referentie voor NMR</td></tr><tr><td>Precisie 5 mm NMR-buisjes, 7&rdquo; lang</td><td>SJM/Deuterotubes</td><td>BOROECO-5-7</td><td>NMR-buisjes</td></tr><tr><td>NMR-spectrometer (14.1 Tesla)</td><td>Bruker</td><td></td><td>acquisitie van NMR-gegevens</td></tr><tr><td>TCI 5mm z-PFG cryogene sonde</td><td>Bruker</td><td></td><td>acquisitie van NMR-gegevens</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker TopSpin 4.0.1</td><td>Bruker</td><td></td><td>verwerking van NMR-gegevens</td></tr><tr><td>MO.Control</td><td>NanoTemper Technologies</td><td></td><td>inclusief met Monlith NT.115</td></tr><tr><td>MO.Affinity Analysis</td><td>NanoTemper Technologies</td><td></td><td>inclusief met Monlith NT.115</td></tr></tbody></table>

meten van interacties van bolvormige en filamenteuze eiwitten door nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (nmr) en microscale thermophoresis (mst)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Filamenteuze eiwitten zoals vimentin bieden organisatie binnen cellen door een structurele steiger voorzien van sites die eiwitten met plakin te binden wordt herhaald. Een protocol voor het opsporen en het meten van dergelijke interacties wordt hier beschreven met behulp van het bolvormige plakin herhalen domein van envoplakin en de spiraalvormige spoel van vimentin. Dit vormt de basis voor het bepalen of een proteïne bindt vimentin (of soortgelijke filamenteuze eiwitten) en voor meting van de affiniteit van de interactie. De bolvormige proteïne van belang is gelabeld met 15N en getitreerd met vimentin eiwit in oplossing. Een tweedimensionale NMR-spectrum is verkregen te detecteren interacties door het observeren van veranderingen in de vorm van de piek of chemische shifts, en te verhelderen effecten van oplossing voorwaarden met inbegrip van zout niveaus, die van invloed zijn vimentin quaternaire structuur. Als de proteïne van belang de draadvormige ligand bindt, wordt de bindende interactie gekwantificeerd door MST met behulp van de gezuiverde eiwitten. De benadering is een eenvoudige manier om te bepalen of een proteïne van belang een gloeidraad bindt, en voor de beoordeling van de invloed van wijzigingen, zoals mutaties of oplossing omstandigheden, op de interactie.

Het domein van de E-PRD (residuen 1822-2014 gekloond in pProEX-HTC) van het gen van menselijke envoplakin en het VimRod domein (residuen 99-249 gekloond in pET21a) van menselijke vimentin4 werden uitgedrukt met His6 tags en gezuiverd. Figuur 6 en Figuur 7 laten zien dat de niveaus van de zuiverheid van VimRod (18.8 kDa) en de E-PRD (21.8 kDa) deze methode van eiwitreiniging verkregen. De verwijdering van de markering van het E-PRD-construct essentieel voor de MST experimenten is zoals het eiwit VimRod is gemarkeerd met behulp van een His6 tag bindende kleurstof en eventuele E-PRD behoud van haar His6 tag voor de binding van de kleurstof concurreren kan His6. De tweede kolom van de IMAC na de splitsing van de tag met TEV protease verwijdert de TEV protease, de gekloofd tag en eventuele uncleaved His6-E-PRD die bleef. De laatste polijsten stap van de zuivering is grootte uitsluiting chromatografie. Ondanks het beide eiwitten zijn van een vergelijkbare grootte, GC de VimRod uit de kolom bij een 51 mL terwijl de E-PRD elutie piek is gecentreerd op 72 mL waar een eiwit monomeer van deze omvang zou worden verwacht. Deze toename in grootte van VimRod is waarschijnlijk vanwege het haar kenmerken als een banale lange staaf vormige eiwit als analytisch ultracentrifuge experimenten aangetoond dat VimRod monomeer4 was. Lagere rendementen van eiwitten worden verkregen van de culturen geteeld in de M9 dan die van rijke Bouillon als gevolg van een lager bedrag van cellen wordt geproduceerd in de minimale media. De initiële groei van grotere starterculturen M9 preparaten TB kunt verbetering van cel rendementen met behoud van de omvang van 15N etikettering nodig voor de NMR experimenten.
De 15N -1H HSQCs werden verworven voor het wild type en R1914E mutant van E-PRD in aanwezigheid of afwezigheid van VimRod (figuur 8A-8 D). Het spectrum van E-PRD in figuur 8A toont het verwachte aantal goed opgelost pieken, indicatief voor een goed gevouwen proteïne. In aanwezigheid van VimRod (Figuur 8) toont het spectrum uitgebreide lijn verbreding en piek verdwijning, overeenkomt met de binding tussen de E-PRD en VimRod. Deze binding is verloren door mutatie van R1914E zoals blijkt door vergelijking van figuur 8C en 8 D. Weinig verandering wordt geconstateerd in het spectrum van toevoeging van VimRod aan de R1914E mutant met vermelding van een gebrek aan binding tussen deze mutant E-PRD en VimRod. De E-PRD piek intensiteit in de aanwezigheid/afwezigheid van VimRod werden vergeleken en uitgezet als de relatieve piek intensiteit in figuur 8E, waarin het bereik van de verbreding van de piek in de E-PRD-complex. De mutant R1914E van E-PRD (niet afgebeeld) behouden ongeveer 97% van pieken bij 20% of hogere intensiteiten van de piek in aanwezigheid van VimRod in vergelijking met ongeveer 20% voor het wild-type (figuur 8E). Dit vertegenwoordigt een verlies van functie punt mutant, met extra mutanten met tussenliggende effecten ook heb bestudeerde4.
Om te valideren en kwantificeren van de binding van VimRod en E-PRD MST analyse met behulp van His6-VimRod aangeduid met fluorescente kleurstof van RED-tris-NTA als doel gemengd met de ligand E-PRD van 1,28 mM naar 39,1 PM10 nM werden uitgevoerd. Drie bindende titraties werden uitgevoerd en de resultaten zijn gemiddeld en aangegeven in Figuur 9. De gegevens werden passen bij een standaardmodel voor een-site ligand bindende en gaf een KD van 25.7 ± 2.1 μM. Evaluatie van de binding tussen VimRod en E-PRD door oppervlakte plasmon resonantie gaf een gelijksoortige KD waarde van 19,1 ± 1,3 μM4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig1.jpg"> Figuur 1: Screen Capture van de Setup van de NMR Experiment. Het getoonde venster wordt gebruikt voor het instellen van een standaard experiment om te verzamelen van een HSQC dataset. Experiment parameters worden gelezen grenzend aan Experiment. Het experiment van de ZGPR komt te staan is gekozen als een eerste experiment te laden van de standaard en oplosmiddel afhankelijke proton-parameters. Het venster titel wordt gebruikt voor het invoeren van experimentele gegevens voor het bijhouden van een register doeleinden. Voor het verzamelen van het spectrum van de HSQC wordt de ZGPR-experiment vervangen door SFHMQC3GPPH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig2.jpg"> Figuur 2: aanpassing van NMR experimentele Parameters. Het getoonde venster wordt gebruikt voor het invoeren van de fundamentele parameters voor de NMR pulse-reeks voor het optimaliseren van het signaal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig3.jpg"> Figuur 3: de verwerking van de gegevens van de NMR. Parameters die worden gebruikt voor het verwerken van elk van de twee dimensies van de NMR-spectrum worden weergegeven, met pijlen waarin wordt aangegeven welke die gewoonlijk worden aangepast. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig4.jpg"> Figuur 4: Parameters voor NMR piek picken. De parameters die worden gebruikt voor het plukken van NMR pieken in het verwerkte NMR spectrum worden weergegeven met typische waarden. Pas de ppm bereik, intensiteit en aantal pieken te optimaliseren de spectra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig5.jpg"> Figuur 5: vertegenwoordiger Peaklist met intensiteiten. Elke piek die is geplukt in het spectrum van de NMR is gezien een aantal, en haar 1H en 15N chemische verschuivingen en signaalsterkte worden weergegeven. Deze peaklist kan vervolgens worden gebruikt om te vergelijken spectra verkregen in de aanwezigheid/afwezigheid van een interactie partner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig6.jpg"> Figuur 6: zuivering van VimRod His6-gelabeld door IMAC en S. A. Het chromatogram voor de elutie van de IMAC kolom toont een grote piek van VimRod. B. het chromatogram voor de elutie van de S-kolom toont een grote piek. C. SDS-PAGE van breuken verzameld in de loop van zuivering: MW normen met de MW aangegeven in kDa aan de linkerkant van de gel (M), cel lysate (1), IMAC doorstroming (2), wassen (3), gebundelde elutie (E1), gebundeld S elutie (E2). Bands zichtbaar op hogere molecuulgewichten in rijstroken E1 en E2 zijn oligomeren van zuivere VimRod zoals bevestigd door westelijke vlek (gegevens niet worden weergegeven). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig7.jpg"> Figuur 7: zuivering van E-PRD door IMAC en S. A. SDS-pagina van de zuivering van de IMAC met de normen van het molecuulgewicht met de MW aangegeven in kDa aan de linkerkant van de gel (M) en het eluaat uit de eerste IMAC kolom (E1), de TEV decollete producten (+ TEV), en de stroom door uit de tweede kolom van de IMAC (FT). B. de chromatograaf uit de S-kolom toont een grote piek. C. SDS-PAGE van het molecuulgewicht normen (M) en de breuken van S piek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig8.jpg"> Figuur 8: HSQC Spectra van Wild-type en R1914E Mutant van E-PRD in de aanwezigheid en de afwezigheid van VimRod. De spectra HSQC Toon wild-type E-PRD (100 µM) in 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7 bij afwezigheid (A) of aanwezigheid van 50 µM VimRod (B). Panelen C en D zijn de spectra van de HSQC van de mutant R1914E (100µM) in de afwezigheid of de aanwezigheid van 50 µM VimRod, respectievelijk. In paneel E de relatieve 1H -15N piek worden intensiteiten van de E-PRD met of zonder VimRod bindend weergegeven als een functie van het piek-nummer, dat is willekeurig toegewezen en niet op basis van volgorde positie. Deze waarden kunnen worden gebruikt om te definiëren een betekenis cutoff voor vermindering van de intensiteit van de piek bij toevoeging van een ligand. Als toewijzingen beschikbaar zijn, kunnen het significante waarden vaak toewijzen aan een bindende-gebied worden gezien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig9.jpg"> Figuur 9: binden van E-PRD naar VimRod. E-PRD werd verdund in een reeks tweevoudige verdunningen van 1,28 mM naar 39,1 nM en geïncubeerd met gelabelde VimRod alvorens MST analyse uit te voeren. Gegevens uit drie onafhankelijke tests werden samengevoegd. De gegevens werden passen aan een KD model geven een KD van 25.7 μM met een KD vertrouwen van ± 2.1 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig9large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Hoeveelheid</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natriumfosfaat, dibasische (watervrij)</td>
			<td>6.0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalium fosfaat, monobasisch (watervrij)</td>
			<td>3,0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natriumchloride</td>
			<td>0.5 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>Tot 950 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. M9 media voor het labelen van isotopische.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Hoeveelheid</td>
		</tr>
<tr>
<td>
15 NH4Cl</td>
			<td>1,0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glucose (of 13C-glucose)</td>
			<td>2.0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgSO4
</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM CaCl2
</td>
			<td>4 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 mg/mL Thiamine</td>
			<td>1,0 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>3 mM FeCl3
</td>
			<td>400 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Metalen Mix (tabel 3)</td>
			<td>500 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>Tot 50 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2. Nutriënten Mix voor suppletie van M9 media.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Hoeveelheid</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 mM ZnSO4
</td>
			<td>323 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 mM MnSO4
</td>
			<td>75,5 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>4,7 mM H3BO3
</td>
			<td>145 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,7 mM CuSO4
</td>
			<td>55,9 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>Tot 500 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3. Metalen Mix Supplement voor het verrijken van de MT nutriënten Mix.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Monster</td>
			<td>1 mM E-PRD in buffer A1 (µL)</td>
			<td>1mM VimRod in buffer A (µL)</td>
			<td>Buffer een (µL)</td>
			<td>200 µM DSS in D2O (µL)</td>
			<td>Buffer B2 (µL)</td>
			<td>Totaalvolume (µL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>E-PRD alleen</td>
			<td>50</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>350</td>
			<td>500</td>
		</tr>
<tr>
<td>E-PRD + VimRod</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>350</td>
			<td>500</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">
1 Buffer A: 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">
2 Buffer B: 23 mM Tris-HCl, 1.14 mM DTT, pH 7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 4. Bereiding van de monsters van de NMR.

Hier presenteren we een protocol voor de productie en zuivering van eiwitten die zijn gemarkeerd met stabiele isotopen, en verdere karakterisering van eiwit-eiwitinteractie met behulp nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie en MicroScale Thermophoresis (MST) experimenten.

Meten van interacties van bolvormige en filamenteuze eiwitten door nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (NMR) en Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied met eiwitinteractie, zoals of eiwit zich direct bindt aan een klein of een groot molecuul. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het eenvoudige en snelle manier is om directe interacties op atomair niveau te detecteren. Zet de luchtstroom aan met het uitwerpcommando ej.Dit brengt het monster van de magneet. Plaats het monster nu in een spinner bovenop de magneet in de opening. Invoegen met de opdracht ij.Wacht tot het monster zich in de magneet nestelt voordat u verdergaat. Maak een nieuwe gegevensset met behulp van de opdracht edc en laad standaard proton NMR-parameters door het experiment ZGPR te selecteren. Vul de velden NAAM, experimentnummer en verwerkte gegevensmapnummer in.Selecteer het oplosmiddel in het veld Oplosmiddel instellen en klik op Getprosol uitvoeren om standaard probehead- en oplosmiddelafhankelijke parameters uit te lezen. Vergrendel het monster naar het ontwijdende oplosmiddel met behulp van het vergrendelingscommando en wacht tot het is voltooid vegen en bereikt slot. Corrigeer de resonantiefrequentie van de magneet door het monster af te stemmen met behulp van het automatische stemcommando atma.Controleer de wiebelcurve totdat de automatische afstemming is voltooid. Shim het magnetisch veld met behulp van topshim. Shimming maakt aanpassing aan het magnetisch veld.Bereik uniformiteit rond het monster. Het is een goede gewoonte om dit op te slaan in waarden met de opdracht wsh, en lees ze met behulp van rsh voor topshim, indien het gebruik van dezelfde of soortgelijke monsters. Pas nu de ontvangsttoename aan met het rga-commando om de maximale signaal-ruisverhouding te bereiken.Plaats het midden van het spectrum op de waterresonantie offset, en stel de 90 graden proton puls op hoog vermogen met behulp van calibo1p1. Verzamel het protonspectrum met behulp van de zero go zg-commando en -proces met efp. Dit omvat exponentiële vermenigvuldiging, de vrije inductie verval waarin lijn verbreding, Fourier transformatie van FID, en pk toe te passen fasecorrectie.Pas de automatische fasecorrectie apk en de automatische basiscorrectie absn met behulp van de polynomial zonder integratie optie. Maak een nieuwe gegevensset voor het HMBC-experiment sofast door SFHMQC3GPPH in experiment te selecteren. Kopieer de geoptimaliseerde P1 en O1 uit het protonspectrum en vul P1-afhankelijke pulsen met behulp van de opdracht getprosol 1H p1 plw1, waar p1 de geoptimaliseerde P1-waarde is, en plw1 is het vermogensniveau voor P1. Optimaliseer nu de CNST54-constante om de compensatie in te stellen voor een chemische verschuiving temidden.Optimaliseer ook CNST55 om de bandbreedte te definiëren om de spectrale regio's van belang te omvatten, waardoor de ontvangeraanwinst kan worden geoptimaliseerd. Als u deze parameters wilt selecteren, haalt u de eerste FID uit het tweedimensionale spectrum en zoekt u naar het waargenomen signaal om ze te definiëren. Bovendien, variëren de ontspanning vertraging, het aantal scans, en dummy scans om aanvaardbare signaalgevoeligheid te verkrijgen met de commando gs, die het mogelijk maakt gaan en scannen om de kwaliteit van de gegevens te controleren in real time.Tot slot, neem de spectra met behulp van Zero Go zg. Stel de verwerkingsparameters in op de grootte van de directe F2- en indirecte F1-dimensies van het spectrum, met optionele lineaire voorspelling in de indirecte dimensie. Selecteer QSINE als vensterfunctie en voer een Sinusbelverschuiving van twee in om het tweedimensionale spectrum te verwerken.Voer de opdracht xfb in om de gegevens in beide richtingen te verwerken met de vensterfunctie en de Fourier-transformatie. Gebruik de opdracht apk2d om automatische fasecorrectie in beide richtingen uit te voeren. Corrigeer de basislijn met de automatische basiscorrectiefunctie abs2 voor 2D-gegevens.Dit past een polynomiale functie toe tussen de ppm-waarden die in de verwerkingsparameters zijn gedefinieerd en zal een 2D-spectrum produceren voor verdere analyse. Als u van plan bent seriële verwerking uit te voeren voor de vergelijking van interactiegegevens met een ander molecuul, slaat u de verwerkingsparameters op met de opdrachtwpar en roept u deze terug met rpar. Voer de opdracht pp om het proces van piekpicking te beginnen.Definieer het ppm-bereik, de minimale intensiteit en het maximum aantal pieken op basis van verwachte pieken. Klik vervolgens op OK. Controleer de resultaten door visuele inspectie. Indien nodig, opnieuw uitvoeren van het proces totdat de resultaten bevredigend zijn op basis van spectra kwaliteit.Een pieklijst genereren met de opdracht PP. Deze pieklijst bevat standaard gegevenshoogte en piekintensiteitsinformatie. De pieklijst kan worden geëxporteerd naar volgende spectrums en kan worden gelezen door andere programma's.Observeer nu het eiwit HSQC spectra voor veranderingen in piekintensiteiten of beweging in chemische verschuivingen die duiden op interactie met een ander molecuul. Als de interactie molecuul is groot, verwachten vermindering van de piekintensiteiten, samen met het verdwijnen van een aantal pieken. Importeer de pieklijst naar de volgende gegevensset door op het tabblad Pieken te klikken en importeren te selecteren met een klik met de rechtermuisknop in het piekvenster.Visualiseer de pieken over het spectrum en verplaats ze indien nodig naar nieuwe posities. Klik op resetintententie voor de volledige tabel om een pieklijst voor het spectrum te genereren met intensiteiten. Deze pieklijst zal de positiegegevens van de opgeslagen pieklijst overdragen.Exporteer de pieklijsten van verschillende gegevenssets naar een spreadsheet of ander wiskundig programma voor analyse door de functie Exporteren te selecteren. Bereken de verandering in piekintensiteiten met de functiepiekintensiteit in complex spectrum, piekintensiteit in eiwitspectrum voor elke piek. Waarden kunnen worden omgezet in procentuele verandering door vermenigvuldiging met 100.Merk op dat piekvolumes ook nuttig zijn, hoewel piekintensiteiten gemakkelijker te meten zijn voor pieken die dicht bij elkaar zijn geplaatst, zoals meestal het geval is voor eiwitten met een hoge dichtheid van relatief brede pieken. De N15HSQCs werden verworven voor het wilde type E-PRD, evenals de R1914E mutant, in aanwezigheid of afwezigheid van VimRod. Het spectrum van het wilde type E-PRD toont het verwachte aantal goed opgeloste pieken, wat wijst op een goed gevouwen eiwit.In aanwezigheid van VimRod toont het spectrum een uitgebreide lijn verbreding en piekvermissing, wat overeenkomt met binding tussen E-PRD en VimRod. Er wordt weinig verandering waargenomen tussen het spectrum van de R1914E mutant op zichzelf en op aanvulling van VimRod, wat wijst op een gebrek aan binding aan deze mutant E-PRD. Hier werden de E-PRD-piekintensiteiten in aanwezigheid en afwezigheid van VimRod vergeleken en uitgezet als de relatieve piekintensiteiten om het bereik van piekverbreeding in het E-PRD-complex aan te geven.Om de binding van VimRod en E-PRD te valideren en te kwantificeren, werd de MST-analyse met behulp van His6-VimRod gelabeld met fluorescerende RED-tris-NTA-kleurstof als doelwit uitgevoerd met behulp van afnemende concentraties van de E-PRD ligand. De gegevens waren geschikt voor een standaardmodel van one-site ligand binding en gaven een KD van 25,7 plus of min 2,1 micromolar. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om identieke acquisitie- en verwerkingsvoorwaarden te gebruiken.zal worstelen vanwege de toegang tot isotoop gelabelde eiwitmonsters voor het verzamelen van NMR-spectra. De implicaties van deze techniek uit te breiden tot therapie van kanker, infectie, of neurodegeneratieve ziekte, omdat ze betrekking hebben op de vorming van eiwit interacties die zijn aangetast in de ziekte.

measuring-interactions-globular-filamentous-proteins-nuclear-magnetic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

This video describes the nuclear magnetic resonance spectroscopy technique to study protein-protein interactions between 15N-labeled wild-type and mutant envoplakin proteins and the unlabeled vimentin protein. The successful interaction between wild-type envoplakin and vimentin leads to extensive line broadening and peak disappearance in the NMR spectra, whereas the absence of an interaction between the mutated envoplakin and vimentin results in well-resolved peaks in the NMR spectra.

Nuclear Magnetic Resonance to Study Atomic Level Protein-Protein Interactions

This video demonstrates microscale thermophoresis for studying the protein-lipid interaction. The assay detects the interaction between molecules by quantifying the thermophoretic movement of fluorescent-labeled proteins in response to a temperature gradient. The fluorescent molecule is mixed with different concentrations of the non-fluorescent lipid molecules, and the mixture of molecules in the solution is loaded into capillaries. A temperature gradient is applied to the samples in the...

Microscale Thermophoresis to Study Protein-Lipid Interactions in Solution

Microschaal thermophoresis (MST) op grote schaal kunnen worden gebruikt voor de bepaling van de bindingsaffiniteit zonder zuivering van het doelwit eiwit uit cellysaten. Het protocol omvat overexpressie van GFP-gefuseerde eiwit, cellyse in niet-denaturerende omstandigheden en detectie van MST signaal in de aanwezigheid van variërende concentraties van het ligand.

Eiwitzuivering-vrij bindwijze affiniteit Bepaling door Microschaal thermophoresis

MicroScale Thermoforese (MST) is een gevoelige technologie voor het karakteriseren van aptameer-doelinteracties. Dit manuscript beschrijft een MST-protocol voor het karakteriseren van aptameer-kleine molecuulinteracties.

In kaart brengen van de bindingsplaats van een aptameer op ATP gebruik van microschaal Thermophoresis

Structuren van supramoleculaire eiwit samenstellingen met atomaire resolutie zijn van groot belang vanwege hun cruciale rol in een verscheidenheid van biologische fenomenen. Hierin presenteren wij een protocol voor het uitvoeren van high-resolution structurele studies op onoplosbare en niet-kristallijne macromoleculaire eiwit samenstellen door magie-angle spinning solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (MAS SSNMR).

Atoomschaal structurele Studies van macromoleculaire samenstellen door Solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie

Thermoforese op microschaal verkrijgt snel bindingsconstanten tegen lage materiaalkosten. Gelabelde of labelvrije thermoforese op microschaal is in de handel verkrijgbaar; labelvrije thermoforese is echter niet in staat tot de diversiteit aan interactiemetingen die kunnen worden uitgevoerd met behulp van fluorescerende labels. Wij bieden een protocol voor gelabelde thermoforesemetingen.

Gebruik van thermoforese op microschaal om eiwit-lipide-interacties te meten

Een protocol voor de toepassing van paramagnetische relaxatieverbetering NMR-spectroscopie om zwakke en voorbijgaande inter- en intramoleculaire interacties in intrinsiek ongeordende eiwitten te detecteren, wordt gepresenteerd.

Paramagnetische relaxatieverbetering voor het detecteren en karakteriseren van zelfassociaties van intrinsiek ongeordende eiwitten

Hier presenteren we een protocol waarin de verwerving, verwerking en analyse van een reeks NMR-experimenten wordt beschreven die gericht zijn op het karakteriseren van eiwit-glycaaninteracties in oplossing. De meest voorkomende op liganden gebaseerde en op eiwitten gebaseerde methodologieën worden geschetst, die ongetwijfeld bijdragen aan de gebieden van structurele glycobiologie en moleculaire herkenningsstudies.

Ontwarren van glycaan-eiwitinteracties: nucleaire magnetische resonantie (NMR) om te redden

Nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie kan de structurele eiwitdynamica op een residuspecifieke manier karakteriseren. We bieden een hands-on protocol voor het opnemen van NMR 15N, R1 en R2 relaxatie en {1H}-15N heteronucleair Overhauser effect (hetNOE) experimenten, gevoelig voor de picoseconden tot nanoseconden tijdschaal.

NMR 15N relaxatie-experimenten voor het onderzoek van de picoseconde tot nanoseconde structurele dynamica van eiwitten

Dit op NMR gebaseerde protocol onderzoekt zwakke eiwit-glycaaninteracties met behulp van cyanovirine-N en D-mannose. Door ligand- en eiwitgedetecteerde methoden te combineren, brengt het bindingsplaatsen in kaart, detecteert het allosterische effecten en identificeert het ontmoetingscomplexen. De aanpak schetst monstervoorbereiding en gegevensanalyse en biedt structurele en dynamische inzichten die waardevol zijn voor glycaanspecifieke diagnostiek en herkenningsmechanismen.

Onderzoek naar eiwit-glycaaninteracties: vooruitgang in nucleaire magnetische resonantie

Leer hoe je eiwit-eiwitinteracties karakteriseert met NMR-spectroscopie en Microscale Thermophoresis. Dit protocol gebruikt stabiele isotooplabeling voor atomaire inzichten in bindingsaffiniteiten en eiwitdynamica.

Meten van interacties van bolvormige en filamenteuze eiwitten door nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (NMR) en Microscale Thermophoresis (MST) (Video) | JoVE Journal

Meten van interacties van bolvormige en filamenteuze eiwitten door nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (NMR) en Microscale Thermophoresis (MST)

Meer video's verkennen