Meten van interacties van bolvormige en filamenteuze eiwitten door nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (NMR) en Microscale Thermophoresis (MST)

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied met eiwitinteractie, zoals of eiwit zich direct bindt aan een klein of een groot molecuul. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het eenvoudige en snelle manier is om directe interacties op atomair niveau te detecteren. Zet de luchtstroom aan met het uitwerpcommando ej.

Dit brengt het monster van de magneet. Plaats het monster nu in een spinner bovenop de magneet in de opening. Invoegen met de opdracht ij.

Wacht tot het monster zich in de magneet nestelt voordat u verdergaat. Maak een nieuwe gegevensset met behulp van de opdracht edc en laad standaard proton NMR-parameters door het experiment ZGPR te selecteren. Vul de velden NAAM, experimentnummer en verwerkte gegevensmapnummer in.

Selecteer het oplosmiddel in het veld Oplosmiddel instellen en klik op Getprosol uitvoeren om standaard probehead- en oplosmiddelafhankelijke parameters uit te lezen. Vergrendel het monster naar het ontwijdende oplosmiddel met behulp van het vergrendelingscommando en wacht tot het is voltooid vegen en bereikt slot. Corrigeer de resonantiefrequentie van de magneet door het monster af te stemmen met behulp van het automatische stemcommando atma.

Controleer de wiebelcurve totdat de automatische afstemming is voltooid. Shim het magnetisch veld met behulp van topshim. Shimming maakt aanpassing aan het magnetisch veld.

Bereik uniformiteit rond het monster. Het is een goede gewoonte om dit op te slaan in waarden met de opdracht wsh, en lees ze met behulp van rsh voor topshim, indien het gebruik van dezelfde of soortgelijke monsters. Pas nu de ontvangsttoename aan met het rga-commando om de maximale signaal-ruisverhouding te bereiken.

Plaats het midden van het spectrum op de waterresonantie offset, en stel de 90 graden proton puls op hoog vermogen met behulp van calibo1p1. Verzamel het protonspectrum met behulp van de zero go zg-commando en -proces met efp. Dit omvat exponentiële vermenigvuldiging, de vrije inductie verval waarin lijn verbreding, Fourier transformatie van FID, en pk toe te passen fasecorrectie.

Pas de automatische fasecorrectie apk en de automatische basiscorrectie absn met behulp van de polynomial zonder integratie optie. Maak een nieuwe gegevensset voor het HMBC-experiment sofast door SFHMQC3GPPH in experiment te selecteren. Kopieer de geoptimaliseerde P1 en O1 uit het protonspectrum en vul P1-afhankelijke pulsen met behulp van de opdracht getprosol 1H p1 plw1, waar p1 de geoptimaliseerde P1-waarde is, en plw1 is het vermogensniveau voor P1. Optimaliseer nu de CNST54-constante om de compensatie in te stellen voor een chemische verschuiving temidden.

Optimaliseer ook CNST55 om de bandbreedte te definiëren om de spectrale regio's van belang te omvatten, waardoor de ontvangeraanwinst kan worden geoptimaliseerd. Als u deze parameters wilt selecteren, haalt u de eerste FID uit het tweedimensionale spectrum en zoekt u naar het waargenomen signaal om ze te definiëren. Bovendien, variëren de ontspanning vertraging, het aantal scans, en dummy scans om aanvaardbare signaalgevoeligheid te verkrijgen met de commando gs, die het mogelijk maakt gaan en scannen om de kwaliteit van de gegevens te controleren in real time.

Tot slot, neem de spectra met behulp van Zero Go zg. Stel de verwerkingsparameters in op de grootte van de directe F2- en indirecte F1-dimensies van het spectrum, met optionele lineaire voorspelling in de indirecte dimensie. Selecteer QSINE als vensterfunctie en voer een Sinusbelverschuiving van twee in om het tweedimensionale spectrum te verwerken.

Voer de opdracht xfb in om de gegevens in beide richtingen te verwerken met de vensterfunctie en de Fourier-transformatie. Gebruik de opdracht apk2d om automatische fasecorrectie in beide richtingen uit te voeren. Corrigeer de basislijn met de automatische basiscorrectiefunctie abs2 voor 2D-gegevens.

Dit past een polynomiale functie toe tussen de ppm-waarden die in de verwerkingsparameters zijn gedefinieerd en zal een 2D-spectrum produceren voor verdere analyse. Als u van plan bent seriële verwerking uit te voeren voor de vergelijking van interactiegegevens met een ander molecuul, slaat u de verwerkingsparameters op met de opdrachtwpar en roept u deze terug met rpar. Voer de opdracht pp om het proces van piekpicking te beginnen.

Definieer het ppm-bereik, de minimale intensiteit en het maximum aantal pieken op basis van verwachte pieken. Klik vervolgens op OK. Controleer de resultaten door visuele inspectie. Indien nodig, opnieuw uitvoeren van het proces totdat de resultaten bevredigend zijn op basis van spectra kwaliteit.

Een pieklijst genereren met de opdracht PP. Deze pieklijst bevat standaard gegevenshoogte en piekintensiteitsinformatie. De pieklijst kan worden geëxporteerd naar volgende spectrums en kan worden gelezen door andere programma's.

Observeer nu het eiwit HSQC spectra voor veranderingen in piekintensiteiten of beweging in chemische verschuivingen die duiden op interactie met een ander molecuul. Als de interactie molecuul is groot, verwachten vermindering van de piekintensiteiten, samen met het verdwijnen van een aantal pieken. Importeer de pieklijst naar de volgende gegevensset door op het tabblad Pieken te klikken en importeren te selecteren met een klik met de rechtermuisknop in het piekvenster.

Visualiseer de pieken over het spectrum en verplaats ze indien nodig naar nieuwe posities. Klik op resetintententie voor de volledige tabel om een pieklijst voor het spectrum te genereren met intensiteiten. Deze pieklijst zal de positiegegevens van de opgeslagen pieklijst overdragen.

Exporteer de pieklijsten van verschillende gegevenssets naar een spreadsheet of ander wiskundig programma voor analyse door de functie Exporteren te selecteren. Bereken de verandering in piekintensiteiten met de functiepiekintensiteit in complex spectrum, piekintensiteit in eiwitspectrum voor elke piek. Waarden kunnen worden omgezet in procentuele verandering door vermenigvuldiging met 100.

Merk op dat piekvolumes ook nuttig zijn, hoewel piekintensiteiten gemakkelijker te meten zijn voor pieken die dicht bij elkaar zijn geplaatst, zoals meestal het geval is voor eiwitten met een hoge dichtheid van relatief brede pieken. De N15HSQCs werden verworven voor het wilde type E-PRD, evenals de R1914E mutant, in aanwezigheid of afwezigheid van VimRod. Het spectrum van het wilde type E-PRD toont het verwachte aantal goed opgeloste pieken, wat wijst op een goed gevouwen eiwit.

In aanwezigheid van VimRod toont het spectrum een uitgebreide lijn verbreding en piekvermissing, wat overeenkomt met binding tussen E-PRD en VimRod. Er wordt weinig verandering waargenomen tussen het spectrum van de R1914E mutant op zichzelf en op aanvulling van VimRod, wat wijst op een gebrek aan binding aan deze mutant E-PRD. Hier werden de E-PRD-piekintensiteiten in aanwezigheid en afwezigheid van VimRod vergeleken en uitgezet als de relatieve piekintensiteiten om het bereik van piekverbreeding in het E-PRD-complex aan te geven.

Om de binding van VimRod en E-PRD te valideren en te kwantificeren, werd de MST-analyse met behulp van His6-VimRod gelabeld met fluorescerende RED-tris-NTA-kleurstof als doelwit uitgevoerd met behulp van afnemende concentraties van de E-PRD ligand. De gegevens waren geschikt voor een standaardmodel van one-site ligand binding en gaven een KD van 25,7 plus of min 2,1 micromolar. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om identieke acquisitie- en verwerkingsvoorwaarden te gebruiken.

zal worstelen vanwege de toegang tot isotoop gelabelde eiwitmonsters voor het verzamelen van NMR-spectra. De implicaties van deze techniek uit te breiden tot therapie van kanker, infectie, of neurodegeneratieve ziekte, omdat ze betrekking hebben op de vorming van eiwit interacties die zijn aangetast in de ziekte.