Isolatie van de Glomeruli en In Vivo Labeling van glomerulaire cel oppervlakte-eiwitten
18 januari 2019
Hier presenteren we een protocol voor het lymfkliertest in vivo labelen van glomerulaire cel oppervlakte eiwitten met biotine. Dit protocol bevat informatie over hoe perfuse muis nieren, het isoleren van de glomeruli, en het uitvoeren van endogene immunoprecipitation van de proteïne van belang.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het nefrologieveld over de rol van celoppervlakte-eiwithandel in eiwit- en niet proteinurische nierziekte. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het de studie van celoppervlakte-eiwithandel in vivo vergemakkelijkt en dat meer dan één eiwit per experiment kan worden geanalyseerd. Hoewel deze methode inzicht kan geven in glomerular celoppervlakhandel, kan deze ook worden toegepast op andere orgaansystemen die zijn geperfundeerd en toegankelijk zijn met isolatietechnieken.
Begin met het bevestigen van een gebrek aan respons op teenknijpen en het ontsmetten van de ventrale kant van de verdoofde muis met 70% isopropyl. Maak een mediaan snijden door de huid van het bekken naar het borstbeen en gebruik pincet om de huid te verwijderen uit de buik fascia. Snijd de huid aan beide zijden van de buikmiddelijn en maak een medium via de buikspierlaag van de blaas naar de xiphoid.
Gebruik de schaar en tang om de spieren te verdelen in vier kwadranten en gebruik twee chirurgische klemmen om de bovenste twee kwadranten vast te zetten naar de nek van de dieren. Plaats het dier onder een ontledenmicroscoop en gebruik een steriele swap om de viscerale organen opzij te schuiven. Snijd met een fijne schaar de leverfic ligament door.
Met behulp van fijne chirurgische pincet, plaats een hechting rond de lever mesenterische slagader branial van de nierslagaders. En rond de aorta, proximaal aan de nierslagaders, bij de bijnier. Bevrijd de distale aorta van de fascia, vet en ander weefsel.
Klem vervolgens de vena cava en de aorta op de hoogte van de splitsing en plaats een andere hechting rond de aorta distaal van de nierslagaders. Gebruik een pincet om de proximale aorta hechting aan te spannen, de bloedstroom te verzachten en snijd een klein gaatje de helft van de diameter van de aorta in de aorta, distaal tot de nierslagaders. Steek een 10 centimeter katheter bevestigd aan een 10 milliliter spuit met vijf milliliter ijskoude PBS plus calcium en magnesium in de aorta.
En bevestig de katheter met de voorbereide ligaturen. Dan beginnen perfusing de nieren op een twee milliliter per minuut stroomsnelheid. Met behulp van fijne schaar om een gat te snijden in de nierader op de nierslagaders en aanscherping van de hechting rond de lever en mesenterische slagaders.
Nadat het volledige volume van PBS is geleverd vervang het perfusaat met vijf milliliter ijskoude PBS plus calcium en magnesium aangevuld met 0,5 milligram per milliliter biotine voor oppervlakte etikettering. Blijf de nieren doorsmen met een stroomsnelheid van twee milliliter per minuut. Wanneer het volledige volume is geleverd, bevestigt u een spuit met vijf milliliter ijskoude PBS plus calcium en magnesium aangevuld met 100 milliglar glycine aan de katheter.
Blus de glomeruli met alle vijf milliliter van de glycineoplossing met een stroomsnelheid van twee milliliter per minuut. Dan doorsneed de nieren met vijf milliliter van ijskoude PBS plus calcium en magnesium aangevuld met 200 microliters van magnetische kralen per milliliter op een twee milliliter per minuut stroomsnelheid. De embolisatie van de glomeruli met de bruine magnetische kralen zal zichtbaar zijn op het nieroppervlak.
Wanneer alle kralen zijn geleverd verwijder de capsule van de nieren en oogst de nieren in het hilum. Plaats de nieren in een 10 centimeter cel cultuur schotel met 15 milliliter PBS plus calcium en magnesium. Gebruik een nieuw dubbelsnijdend mes om de nieren in de kleinste stukken te snijden.
Breng het weefsel in een twee milliliter buis met een milliliter collagenase A gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius, het mengen van de weefseloplossing voorzichtig voor en na de spijsvertering met een gemodificeerde 1000 microliter pipette tip. Filtreer aan het einde van de incubatie het verteerde weefsel door een 100 micron celzeef. Gebruik een cel schraper en ijskoude PBS plus calcium en magnesium om het resterende weefsel mash via de cel zeef.
Breng het uiteindelijke volume van de nier eencellige suspensie tot 50 milliliter met verse ijskoude PBS plus calcium en magnesium en verzamel de niercellen door centrifugatie. Verwijder de supernatant en zet de pellet opnieuw op met iets minder dan 1,5 milliliter ijskoude PBS plus calcium en magnesium tijdens het vortexen en breng de glomerulaire suspensie over in een nieuwe twee milliliter buis. Om de glomeruli te wassen, plaats de buis in een magneet om de glomeruli te aggregeren.
Gebruik na een minuut een pipet van 1000 microliter om de supernatant te verwijderen. En haal de buis uit de magneet. Voeg een milliliter PBS plus calcium en magnesium toe aan de weefsels.
Pipette de glomeruli op en neer een keer en vortex de cellen. Breng de buis terug naar de magneet en was de glomeruli weer zoals net aangetoond. Totdat een monsterzuiverheid ten minste 90% heeft bereikt door lichtmicroscoopanalyse bij een vergroting van 40 tot 100 x.
Verzamel vervolgens de magnetische kraal gezuiverde glomeruli door centrifugatie. Om een grotere zuiverheid van meer dan 95% te bereiken, moest de glomeruli grondig worden gewassen zoals aangetoond. Biotine perfusie vergemakkelijkt etikettering van de capillaire lussen in biotine, maar niet gecontroleerd geperfundeerde muisnieren.
Immuunneerslag van de biotinefractie van glomerulaire extracten laat zien dat de glomerulaire transmembranen-eiwitten nefrofine en podocalyxine immuunprecipiteerd zijn met de biotine, maar niet met de controlefractie. Vlekken van de immuunprecipitated fractie met streptavidin bevestigt verder de aanwezigheid van biotine laded nefrofine in de biotine geperfundeerd, maar geen controle geperfuseerde dieren. Endotheel eiwit vasculaire endotheel cadherine en intracellulaire adhesie molecuul twee zijn ook immuunprecipitated binnen de biotine fractie.
In de vroege fase van nefrotoxische nefritis wordt een verminderde expressie van celoppervlakdrofries waargenomen bij nefrotoxische nefrotisdieren in vergelijking met controles. Inderdaad densitometische analyse toont een aanzienlijke vermindering van biotine laded nefroin in nefroxische nefritis dieren in vergelijking met controllers. Kwantitatieve analyse van de totale nefrin-verhouding aan actin onthult geen significante verschillen tussen de controle en nefrotoxische nefrotismuizen.
Bovendien worden gelijke hoeveelheden podocyten waargenomen bij nefrotoxische nefritis en controledieren. Bij late nefrotoxische nefritis vertonen nefrotoxische nefrotische dieren een herstel van nefrotische expressie zonder significante verschillen in celoppervlakdige nefrotische gemeten tussen controle en nefrotoxische nefrotische nefrotische muizen en een totale totale nefrotische vermindering van nefroxische nefrotische dieren. Verder worden de podocyte-aantallen verminderd in vergelijking met controledieren.
Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om de spuiten bubble vrij te houden tijdens hun verbinding om luchtembolie van de glomeruli te voorkomen en om te werken onder ijskoude omstandigheden zodra de nierperfusie is begonnen. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals de isolatie van glomeruli RNA en eiwit worden uitgevoerd om aanvullende vragen over eiwitexpressie of interacties in gezonde en zieke nieren te beantwoorden.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor in vivo labelen van glomerulaire celoppervlakte-eiwitten bij muizen met behulp van biotin. Het beschrijft de stappen voor het perfunderen van muizennieren, het isoleren van glomeruli en het uitvoeren van immunoprecipitatie.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Nefrologie
- Celbiologie
- Eiwittransport
Achtergrond
- Begrip van eiwittransport op het celoppervlak is cruciaal in nierziekteonderzoek.
- Deze methode kan op verschillende orgaansystemen worden toegepast.
- Het maakt de analyse van meerdere eiwitten in één experiment mogelijk.
- In vivo studies bieden inzichten die niet mogelijk zijn met in vitro methoden.
Doel van de studie
- Om de rol van eiwittransport op het celoppervlak in nierziekten te onderzoeken.
- Om een betrouwbaar protocol te ontwikkelen voor het onderzoek van glomerulaire eiwitten.
- Om het begrip van proteinurie en non-proteinurie niercondities te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Perfusie van muizennieren met biotin.
- Isolering van glomeruli uit de nieren.
- Endogene immunoprecipitatie van doeleiwitten.
- Bevestiging van anesthesie en chirurgische voorbereiding van de muis.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol labelt met succes glomerulaire celoppervlakte-eiwitten.
- Meerdere eiwitten kunnen tegelijkertijd worden geanalyseerd.
- Inzichten in eiwittransportmechanismen werden verkregen.
- De methode is aanpasbaar voor gebruik in andere orgaansystemen.
Conclusies
- Dit protocol is een waardevol hulpmiddel voor nefrologieonderzoek.
- Het biedt een raamwerk voor het bestuderen van eiwittransport in vivo.
- Toekomstige studies kunnen de toepassing ervan uitbreiden naar andere ziekten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Studying glomerular cell surface protein trafficking in vivo provides mechanistic insights into kidney disease pathogenesis, supporting target validation in nephrology. This method enables semi-quantitative analysis of surface protein abundance under physiologic and pathophysiologic conditions, enhancing predictive confidence in preclinical models. It facilitates biomarker discovery and pathway clarification relevant to proteinuric disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking cell surface protein dynamics in intact glomeruli.
- Operational Value: Supports functional target validation through direct observation of nephrin and podocalyxin trafficking in disease models.
- Predictive Value: Provides quantitative readouts for assessing target engagement and pathway modulation in vivo.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates purified glomerular fractions suitable for downstream immunoprecipitation and protein interaction analysis.
- Reproducibility: Standardized perfusion and magnetic bead isolation yield consistent glomerular preparations across experiments.
- Multiplex Capability: Allows simultaneous analysis of multiple surface proteins per experiment, increasing screening efficiency.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Captures dynamic changes in nephrin expression during early and late phases of nephrotoxic nephritis.
- Translational Continuity: Links in vivo protein trafficking observations to podocyte loss and disease progression.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed protein changes reflect surface trafficking versus total expression shifts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical evaluation by providing functional, in vivo data on glomerular protein behavior.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on protein trafficking mechanisms in kidney disease models.
- Screening: Delivers quantitative, biotin-dependent immunoprecipitation outputs for comparing protein surface exposure.
- Analytics: Enables semi-quantitation of glomerular cell surface abundance via streptavidin-based detection.
- Translational Research: Connects surface protein dynamics to histologic and functional outcomes in nephritis models.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other perfused organ systems, supporting cross-indication target validation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by distinguishing surface trafficking from total protein expression changes.
- Operational Value: Standardized perfusion and isolation workflows improve reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by revealing target accessibility and modulation in physiologic contexts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on in vivo surface protein behavior.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine surgery, vascular perfusion, and tissue dissection under sterile conditions.
- Dependent on perfusion equipment, magnetic separation tools, and immunoprecipitation reagents.
- Necessitates standardization of biotin perfusion timing, flow rate, and quenching steps for consistent labeling.
- Adaptation to other organ systems requires validation of accessibility and perfusion efficiency.
- Practical limitations include tissue fragility during digestion and the need for high-purity glomerular isolation (>95%) for reliable downstream analysis.
