Name: Planten groei en Agrobacterium-gemedieerde Floral-dip transformatie van de Extremophyte Schrenkiella parvula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Leer de Agrobacterium-gemedieerde floral-dip transformatie voor Schrenkiella parvula. Deze methode maakt stabiele transgene lijnen mogelijk om extremofytadaptaties aan zoutstress te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door een award van de National Science Foundation MCB 1616827.

1. de plantengroei
<ol><li>
Zaad sterilisatie (optioneel)
	<ol>
<li>Bereiden van 50% bleekwater in tweemaal gedestilleerd water (ddH2van O) met 1 of 2 druppels van een niet-ionogene detergens (Zie Tabel van materialen) in een tube van 50 mL. Omkeren van de buis meerdere malen te mengen van de oplossing. Opmerking: Het verdient de voorkeur om te voeren zaad sterilisatie in een laminaire flow-kast met een UV gesteriliseerde oppervlak voor 15 min.</li>
		<li>De bleekwater oplossing toevoegen aan ~ 100 – 200 S. parvula zaden in een 1,5 mL-buis. Meng en laat de buis zitten voor 5 minuten.</li>
		<li>Verwijder het bleekmiddel uit de buis en voeg 70% ethanol. De zaden door pipetteren meerdere malen wassen en verwijder de ethanol-oplossing onmiddellijk.</li>
		<li>Wassen van de zaden in gesteriliseerd water om teveel bleekmiddel en ethanol te verwijderen en deze vervolgens verwijdert van het water. Herhaal deze stap 5 tot 6 keer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zaad stratificatie
	<ol>
<li>De zaden in gesteriliseerd water dompelen, en op te slaan voor 5 tot 7 dagen bij 4 ° C. Als alternatief, gedroogde unsterilized zaaien rechtstreeks op natte bodem, en plaats de lade van de bodem voor 5 tot 7 dagen bij 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Groeiende planten in voorbereiding van transformatie
	<ol>
<li>Vul de bodem mix (Zie Tabel van materialen) in 7 x 6 cm2 potten, geniet van de potten in water, en spuiten van water vanaf de bovenkant om een uniform natte groeimedium. Voeg toe 5-meststof kralen (Zie Tabel van materialen) op het bodemoppervlak van elke pot. Opmerking: Voor zover we hebben meegemaakt, groeit S. parvula goed op elke bodem mix waar A. thaliana kan groeien.</li>
		<li>Met behulp van een natte tandenstoker, transfer 20 ~ 25 zaden per pot op het bodemoppervlak. Opmerking: Een handige praktijk is om een partij van 4 – 5 zaden in de vier hoeken en het midden van de pot (Figuur 1, dag 15, linkerpaneel).</li>
		<li>Dekking van het Dienblad van de pot met een duidelijke koepel om te houden van de zaden onder hoge luchtvochtigheid tijdens kieming.</li>
		<li>Houd de plant schaaltjes in een zaal van de groei met een lage intensiteit vastgesteld op 130 µmol m−2 s−1 licht, temperatuur van 22-24 ° C en 14 h per dag/10 h per nacht cyclus. Verwijder de koepels na 7-10 dagen na ontkieming. Voeg water uit de bodem van de lade te houden bodem bevochtigd gelijkmatig op een gewenst niveau.</li>
		<li>Onkruid uit extra zaailingen en laat enige 4 – 5 gezonde zaailingen per pot goed gescheiden van elkaar (Figuur 1, dag 15, rechter paneel).</li>
		<li>Zachtjes de planten om de twee dagen water en bemesten met 0,2 x Hoagland de oplossing16 eenmaal per twee weken. Opmerking: Houden van het bodemvocht op een uniform niveau is de sleutel tot een toenemende S. parvula consequent en gezond.</li>
		<li>Blijven groeien de planten voor 8-10 weken tot meerdere bloeiwijzen 100 – 150 floral toppen per plant (Figuur 1, dag 60-80 produceren). Op de dag gepland voor de bloemen-dip op basis transformatie (stap 4.5), alle volwassen als opkomende siliques uit de planten te verwijderen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. het klonen van het gen/Genomic Element van belang in een Vector voor Plant transformatie
<ol><li>Versterken van het fragment van DNA van doel met behulp van polymerase kettingreactie (PCR)17 en isoleren het PCR-product met behulp van een gel-extractie kit (Zie Tabel van materialen) volgens het protocol van kit of een andere geschikte methode voor het zuiveren van DNA met behulp van agarose gel elektroforese17,18. Controleer of de volgorde van de geïsoleerde PCR-product door Sanger sequencing19.</li>
	<li>Kloon het gewenste PCR product in het klonen vector en transformeren de gekloonde constructie in de bevoegde E. coli cellen met behulp van een topoisomerase gebaseerde klonen kit (Zie Tabel van materialen) volgens de richtlijnen van de fabrikant.</li>
	<li>Verspreiden van 50 µL van getransformeerde producten op Luria Bertani20 (LB) agar bacteriegroei media (tabel 1) met de juiste antibiotica, bijvoorbeeld., 50 µg / mL spectinomycine (Zie Tabel of Materials), en Incubeer bij 37 ° C's nachts.</li>
	<li>De volgende dag, selecteer 5 – 10 enkele kolonies beënten tot vloeibare LB medium met de juiste antibiotica en incubeer met zacht schudden bij 37 ° C's nachts.</li>
	<li>Isoleren plasmiden met behulp van een plasmide isolatie kit (Zie Tabel van materialen) en verifiëren via Sanger sequencing19 of de volgorde van de target versterkt in 2.1 goed wordt gekloond.</li>
	<li>Overdracht van de gekloonde en geverifieerde PCR product naar een bestemming vector voor plant transformatie compatibel met recombinatie gebaseerde klonen (Zie Tabel van materialen), met behulp van een recombinase enzym mix kit (Zie Tabel of Materials), volgende instructie van de fabrikant van de kit. Herhaal vanaf stap 2.3 naar stap 2.5 te isoleren en te verifiëren klonen herbergen juiste plasmide constructies.</li>
</ol>3. omzetten van de bouw van de Vector voor Plant transformatie in Agrobacterium tumefaciens
<ol><li>Het plasmide van de constructie van de vector van 2.6 in de A. tumefaciens stam GV3101:pMP90RK21, die havens een rifampicine-resistentie gen voor chromosomale achtergrond selectie omzetten. Gebruik van de juiste antibiotica, vb. gentamycine of kanamycine (Zie Tabel of Materials), voor de selectie van plant transformatie construeren (Ti-plasmide). Een kort protocol voor A. tumefaciens transformatie via electroporation is opgenomen in punt 3.2.</li>
	<li>
A. tumefaciens transformatie door electroporation
	<ol>
<li>Ontdooi de A. tumefaciens bevoegde cellen22 op ijs. Mix 0.1 – 1 µg van de plasmide bereid uit 2.6, opgelost in 1 – 2 µL van ddH2O, met bevoegde cellen op ijs. Breng het mengsel in een cuvet electroporation (Zie Tabel van materialen).</li>
		<li>Electroporation uitvoeren op het mengsel van plasmiden en bevoegde cellen uit 3.2.1, met behulp van een electroporator (Zie Tabel van materialen) volgens de richtlijnen van de fabrikant. Opmerking: Reinig het oppervlak van de Cuvet voordat de electroporation.</li>
		<li>Het reactiemengsel van de Cuvet overbrengen naar een microcentrifuge buis, die 1,5 mL vloeibare LB bevat en meng goed met pipetteren en incubeer gedurende 1 uur bij 28 ° C met zacht schudden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beënt de getransformeerde A. tumefaciens van punt 3.2 op LB platen met de juiste selectie antibiotica (b.v. kanamycine 25 µg / mL, spectinomycine 50 µg / mL, gentamycine 25 µg / mL, en rifampicine 50 µg / mL) en Incubeer bij 28 ° C gedurende 3 dagen.</li>
</ol>4. Agrobacterium-gemedieerde transformatie van S. parvula
<ol><li>De single getransformeerd beënten kolonies van platen in 10 mL vloeibare media LB met antibiotica (gelijk aan 3.3) in een steriel 50 mL conische buis (Zie Tabel van materialen). Incubeer gedurende 24 uur in een schudden incubator (Zie Tabel van materialen) op 250 toeren bij 28 ° C.</li>
	<li>De bacteriële oplossing van 3.4.1 overbrengen in een steriele 250 mL-kolf, voeg 40 mL LB vloeibare media met passende antibiotica en incubeer van 12 h tot de optische dichtheid bij 600 nm golflengte (OD600) ongeveer 2.0 bereikt.</li>
	<li>Centrifugeer de A. tumefaciens cultureat 3100 x g voor 10 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de bacteriecultuur in 40 mL A. tumefaciens infiltratie oplossing (tabel 1).</li>
	<li>Verdun de geresuspendeerde A. tumefaciens met infiltratie oplossing tot een definitieve OD600 van 0,8. 25 µL van oppervlakteactieve stof oplossing (tabel 1) toevoegen aan 50 mL verdunde A. tumefaciens oplossing en meng door het omkeren van meerdere malen.</li>
	<li>Dompel de bloeiwijze van de planten in de A. tumefaciens oplossing bereid in de sectie 4.4 voor 20 s. gebruik een verse bacteriële oplossing na het dompelen bloeiwijze van zes potten. Zorg ervoor dat alle bloemen zijn in contact met de oplossing. Pipetteer bacteriële oplossingen direct op bloemen, gelegen in het onderste deel van de bloeiwijze als zij kunnen niet worden ondergedompeld in de oplossing. Opmerking: Voor de eerste ronde transformatie, zorg ervoor dat alle volwassen als opkomende siliques met een scherpe scalpel of kleine schaar verwijderen. Verwijder siliques niet als transformatie voor de tweede keer uitvoert.</li>
</ol>5. na transformatie Plant zorg en de tweede transformatie
<ol><li>Plaats de planten bloemen gecoat horizontaal in schone bakken met koepels dekking van de planten te plaatsen in een donkere groei kamer voor 1-2 dagen. Opmerking: De bloemen onder hoge-vochtigheid te houden is belangrijk in dit stadium (Figuur 1, planten na transformatie).</li>
	<li>De planten terug naar rechtop en de planten overbrengen in een kamer van de groei met een 14 h per dag/10 h per nacht cyclus, 130 µmol m-2 s lichtintensiteit-1 en 22 tot en met 24 ° C temperatuur.</li>
	<li>Controleren de gedimde bloeiwijzen in de volgende week. Als een groot aantal bloemen afbreken (Figuur 2), herhaalt u de floral dip (stap 4) na ongeveer 4 weken, of na een groot aantal bloemen hebben onlangs ontwikkeld. Opmerking: In tegenstelling tot de bereiding stap voor de eerste transformatie (stap 1.3.7), verwijder geen bestaande of de ontwikkeling van siliques (Figuur 2) voor de tweede ronde van transformatie.</li>
	<li>De planten groeien totdat de zaden rijpen en oogsten van zaden op ~ 21 weken.</li>
	<li>Droge zaden voor 2 – 3 weken bij kamertemperatuur in een luchtdichte verpakking met gevuld met droogmiddelen (Zie Tabel van materialen).</li>
</ol>6. de selectie van positieve Transformants
<ol><li>Plant de zaden van de T1 als beschreven voor het wild type zaden in stappen 1.2 tot en met 1.3.</li>
	<li>Groeien de planten tot de eerste 2 echte bladeren, ongeveer 10-14 dagen na de kieming ontwikkelt.</li>
	<li>
De eerste selectie voor herbicide resistentie (Figuur 3A en 3B) als gedetailleerde hieronder uitvoeren.
	<ol>
<li>Verdun het herbicide glufosinaatammonium (11,3%) (of BASTA) (tabel 1) naar 1:1,000 (v/v). Oplossing van verdunde BASTA spray op de zaailingen en 's nachts de planten met koepels bedekken.</li>
		<li>BASTA spuiten van 2 tot 3 keer herhalen elke 5-7 dagen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Het uitvoeren van de tweede selectie met behulp van een BASTA-valproef zoals hieronder beschreven.
	<ol>
<li>Identificeren van planten die overleven na 3-4 keer met BASTA oplossing wordt gespoten. Groeien de planten voor een ander 2-3 weken tot 3-5 bladeren ontwikkelen een relatief groot oppervlak.</li>
		<li>Selecteer het grootste volwassen blad per plant, wrijf het oppervlak van het blad voorzichtig met een vinger te verwijderen van de wax laag en breng een druppel van de verdunde oplossing BASTA (uit stap 6.3.1). Opmerking: De locatie van het blad met de daling van de BASTA toegepast door het plaatsen van een papieren rompslomp op de dichtstbijzijnde stengel markeren.</li>
		<li>Toezicht op de bladeren toegepast met de daling van de BASTA voor tekenen van verwelking voor maximaal een week. Selecteer de planten met blaadjes niet beïnvloed door de druppels BASTA. Opmerking: Bladeren van meest vals-positieve planten beginnen te verwelken binnen twee dagen, terwijl de bladeren uit true-positieven zijn intact, zelfs nadat de daling van BASTA oplossing (Figuur 3C opdroogt).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Positieve transformants met behulp van genomic PCR te bevestigen.
	<ol>
<li>2 tot 3 bladeren van de overlevende planten bij stap 6.4.5 verzamelen.</li>
		<li>Het uittreksel van genomic DNA van de bladeren met behulp van de methode CTAB23 of elke andere passende DNA-extractiemethode.</li>
		<li>Uitvoeren van PCR met behulp van uitgepakte genomic DNA-monsters uit planten, wild-type planten (als negatieve controles), en de constructie van de plasmide uit de stap 3.1 (zoals een positieve controle). Gebruik een passende combinatie van PCR primers specifiek voor de selectieve marker-gen, bijvoorbeeld, voor BASTA-resistente gen (bar), TCAGCAGGTGGGTGTAGA (in voorwaartse richting) en GTCAACCACTACATCGAGACAA (omgekeerde).<ol>
<li>Voor de voorbeeld PCR inleidingen gericht op de bar -gen, het gebruik van de volgende PCR voorwaarden: de eerste denaturatie stap bij 98 ° C gedurende 30 s; gevolgd door 30 cycli van de denaturering bij 98 ° C gedurende 30 s, gloeien bij 59 ° C gedurende 30 s, en uit te breiden bij 72 ° C gedurende 30 s; en de laatste uitbreiding bij 72 ° C gedurende 5 minuten. Opmerking: Om ervoor te zorgen de invoeging van het gehele T-DNA, is het raadzaam ook het uitvoeren van genomic PCR met behulp van een PCR Inleiding van de selectieve marker-gen en andere PCR primer specifiek voor de opeenvolging van doel gekloond naar de vector transformatie plant bij de stap</li>
		</ol>
</li>
		<li>De aanwezigheid van de verwachte omvang van het PCR-product van versterkte bar bevestigen door agarose gel elektroforese17 voor de doelgroep monsters (Figuur 4A) alsook door de rangschikking van de geïsoleerde PCR product19 met behulp de zelfde procedure als in stap 2.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dassanayake, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21822265">The genome of the extremophile crucifer Thellungiella parvula.</a> Nature Genetics. 43 (9), 913-918 (2011).</li>
<li>Oh, D. -H., Dassanayake, M., Bohnert, H. J., Cheeseman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+at+the+extreme%3A+lessons+from+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Life at the extreme: lessons from the genome.</a> Genome Biology. 13 (3), 241(2012).</li>
<li>Whited, J. <a target="_blank" href="https://www.cell.com/cell/pdf/S0092-8674(15)01125-3.pdf">The Next Top Models.</a> Cell. 163 (1), 18-20 (2015).</li>
<li>Dassanayake, M., Yun, D. O. D., Bressan, R. A., Cheeseman, J. M., Bohnert, J. H. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B978012381466100002X">The scope of things to come: New paradigms in biotechnology.</a> Plant Biotechnology and Agriculture: Prospects for the 21st Century. , 19-34 (2009).</li>
<li>Dittami, S. M., Tonon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomes+of+extremophile+crucifers%3A+New+platforms+for+comparative+genomics+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Genomes of extremophile crucifers: New platforms for comparative genomics and beyond.</a> Genome Biology. 13 (8), 166(2012).</li>
<li>Amtmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+from+evolution%3A+Thellungiella+generates+new+knowledge+on+essential+and+critical+components+of+abiotic+stress+tolerance+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Learning from evolution: Thellungiella generates new knowledge on essential and critical components of abiotic stress tolerance in plants.</a> Molecular Plant. 2 (1), 3-12 (2009).</li>
<li>Oh, D. -H., Hong, H., Lee, S. Y., Yun, D. -J., Bohnert, H. J., Dassanayake, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+structures+and+transcriptomes+signify+niche+adaptation+for+the+multiple-ion-tolerant+extremophyte+Schrenkiella+parvula%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Genome structures and transcriptomes signify niche adaptation for the multiple-ion-tolerant extremophyte Schrenkiella parvula.</a> Plant Physiology. 164 (4), 2123-2138 (2014).</li>
<li>Orsini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+salt+tolerance+parameters+in+11+wild+relatives+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">A comparative study of salt tolerance parameters in 11 wild relatives of Arabidopsis thaliana.</a> Journal of Experimental Botany. 61 (13), 3787-3798 (2010).</li>
<li>Uzilday, B., Ozgur, R., Sekmen, A. H., Yildiztugay, E., Turkan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+alternative+electron+sinks+and+antioxidant+defence+in+chloroplasts+of+the+extreme+halophyte+Eutrema+parvulum+%28Thellungiella+parvula%29+under+salinity%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Changes in the alternative electron sinks and antioxidant defence in chloroplasts of the extreme halophyte Eutrema parvulum (Thellungiella parvula) under salinity.</a> Annals of Botany. 115 (3), 449-463 (2015).</li>
<li>Teusink, R. S., Rahman, M., Bressan, R. A., Jenks, M. A. <a target="_blank" href="https://www.journals.uchicago.edu/doi/10.1086/338825">Cuticular waxes on Arabidopsis thaliana close relatives Thellungiella halophila and Thellungiella parvula.</a> International Journal of Plant Sciences. 163 (2), 309-315 (2002).</li>
<li>Jarvis, D. E., Ryu, C. H., Beilstein, M. A., Schumaker, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+SOS1+in+the+convergent+evolution+of+salt+tolerance+in+Eutrema+salsugineum+and+Schrenkiella+parvula%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for SOS1 in the convergent evolution of salt tolerance in Eutrema salsugineum and Schrenkiella parvula.</a> Molecular Biology and Evolution. 31 (8), 2094-2107 (2014).</li>
<li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Floral+dip%3A+A+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Journal. 16 (6), 735-743 (1998).</li>
<li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20409266">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).</li>
<li>Bai, J., Wu, F., Mao, Y., He, Y. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/protocolexchange/protocols/2769">In planta transformation of Brassica rapa and B. napus via vernalization-infiltration methods.</a> Protocol Exchange. 10, 1028(2013).</li>
<li>Sparrow, P. A. C., Goldsack, C. M. P., Østergaard, L. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/251150135_Transformation_Technology_in_the_Brassicaceae">Transformation technology in the Brassicaceae.</a> Genetics and Genomics of the Brassicaceae. , 505-525 (2011).</li>
<li>Hoagland, D. R., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="https://archive.org/details/watercultureme3450hoag">The water-culture method for growing plants without soil.</a> California Agricultural Experiment Station Circular. 347 (347), 1-32 (1950).</li>
<li>Saiki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-directed+enzymatic+amplification+of+DNA+with+a+thermostable+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.</a> Science. 239 (4839), 487-491 (1988).</li>
<li>Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Quick%2C+cost-free+method+of+purification+of+dna+fragments+from+agarose+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">A Quick, cost-free method of purification of dna fragments from agarose gel.</a> Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/271968">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
<li>Bertani, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14888646">Studies on Lysogenesis I. The mode of phage liberation by lysogenic Eschericia coli.</a> Journal of Bacteriolgy. 62 (3), 293-300 (1951).</li>
<li>Koncz, C., Martini, N., Szabados, L., Hrouda, M., Bachmair, A., Schell, J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-94-011-0511-8_4">Specialized vectors for gene tagging and expression studies.</a> Plant Molecular Biology Manual. , 53-74 (1994).</li>
<li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="https://europepmc.org/abstract/med/22484681">Transformation of Agrobacterium using electroporation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (30), (2006).</li>
<li>Murray, M. G., Thompson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+high+molecular+weight+plant+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.</a> Nucleic Acids Research. 8 (19), 4321-4326 (1980).</li>
<li>Inan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salt+cress.+a+halophyte+and+cryophyte+Arabidopsis+relative+model+system+and+its+applicability+to+molecular+genetic+analyses+of+growth+and+development+of+extremophiles%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Salt cress. a halophyte and cryophyte Arabidopsis relative model system and its applicability to molecular genetic analyses of growth and development of extremophiles.</a> Plant Physiol. 135 (3), 1718-1737 (2004).</li>
<li>Ghedira, R., De Buck, S., Nolf, J., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficiency+of+Arabidopsis+thaliana+floral+dip+transformation+is+determined+not+only+by+the+Agrobacterium+strain+used+but+also+by+the+physiology+and+the+ecotype+of+the+dipped+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">The efficiency of Arabidopsis thaliana floral dip transformation is determined not only by the Agrobacterium strain used but also by the physiology and the ecotype of the dipped plant.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (7), 823-832 (2013).</li>
<li>Shaohong, F. U., Xianya, W. E. I., Yingze, N. I. U., Shixing, G. U. O. <a target="_blank" href="http://gcirc.org/fileadmin/documents/Proceedings/IRCWuhan2007vol2/Biotechnology/45-49.pdf">Transformation of Brassica napus with the method of floral-dip.</a> Biotechnology: Genomics and Its Applications. , 45-49 (2005).</li>
<li>Li, J., Tan, X., Zhu, F., Guo, J. <a target="_blank" href="http://www.ccsenet.org/journal/index.php/ijb/article/view/4778">A rapid and simple method for Brassica napus floral-dip transformation and selection of transgenic plantlets.</a> International Journal of Biology. 2 (1), 127(2010).</li>
<li>Li, H. Q., Xu, J., Chen, L., Li, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+efficient+Agrobacterium+tumefaciens-mediated+leaf+disc+transformation+of+Thellungiella+halophila%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Establishment of an efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated leaf disc transformation of Thellungiella halophila.</a> Plant Cell Reports. 26 (10), 1785-1789 (2007).</li>
<li>Wu, G., Rossidivito, G., Hu, T., Berlyand, Y., Poethig, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+lines%3A+New+tools+for+genetic+analysis+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Traffic lines: New tools for genetic analysis in Arabidopsis thaliana.</a> Genetics. 200 (1), 35-45 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De fysiologische toestand van de plant aanzienlijk invloed op de efficiëntie van transformatie25. Het gebruik van gezonde en krachtige planten voor transformatie is een basisvereiste voor een succesvolle hervorming van S. parvula. Water of lichte gestresst planten zullen hebben minder bloemen in vergelijking met de gezonde planten ideaal voor transformatie (Figuur 1, midden paneel). S. parvula kunnen groeien met een lage intensiteit minder dan 130 µm...

In dit protocol beschrijven we de groei en de totstandbrenging van stabiele transgene lijnen voor het extremophyte model Schrenkiella parvula. De beschikbaarheid van een efficiënte transformatie-systeem is een kenmerk van een veelzijdige genetische model. Planten die bloeien in extreme omgevingen, waarnaar wordt verwezen als extremophytes, bieden een essentiële hulpbron voor het begrijpen van de plant aanpassingen aan milieu benadrukt. Schrenkiella parvula (voorheen Thellungiella parvula en Eutrema parvulum) is een model van dergelijke extremophyte, met het uitbreiden van genomic middelen1,2,3,4,5. Echter, transformatie protocollen hebben nog niet is gerapporteerd voor S. parvula in gepubliceerde studies.
Het genoom van S. parvula is de eerste gepubliceerde extremophyte genoom in kruisbloemenfamilie (mosterd-kool familie) en toont een uitgebreide totale genoom synteny met het niet-extremophyte model, Arabidopsis thaliana1. Dus, vergelijkende studies tussen A. thaliana en S. parvula kon profiteren van de rijkdom aan genetische studies uitgevoerd op A. thaliana om informatieve hypothesen over hoe het genoom S. parvula heeft zich ontwikkeld en geregeld anders om te gaan met benadrukt extreme milieu5,6,7. S. parvula is een van de meest zout-tolerante soorten (gebaseerd op bodem NaCl LD50) onder bekende wilde verwanten A. thaliana8. Naast de NaCl-tolerantie, S. parvula overleeft en voltooit de levenscyclus in de aanwezigheid van meerdere zout ionen bij hoge concentraties giftig voor de meeste planten7. In reactie op de abiotische stress overwegend in zijn natuurlijke habitat, het heeft zich ontwikkeld van verschillende eigenschappen, waaronder zijn verschillende bestudeerd op de biochemische of fysiologisch niveau 8,,9,10, 11.
Sinds 2010 zijn er meer dan 400 publicaties van peer-reveiwed die S. parvula gebruikt als doelsoort of gebruikt in een vergelijking met andere plant genomen. Echter kan een duidelijk knelpunt worden geïdentificeerd met een kijkje van wat voor soort studies zijn uitgevoerd. De meerderheid van deze verslagen bespreken het potentiële gebruik van S. parvula in toekomstige studies of het gebruik in vergelijkende genomic of phylogenomic studies. Als gevolg van het ontbreken van een proof-of-concept transformatie protocol vastgesteld voor S. parvula, het is niet gebruikt in functionele genomische studie, ondanks het feit dat een van de hoogste kwaliteit plant genomen beschikbaar tot op heden (> 5 Mb aanliggend N50) gemonteerd en geannoteerde in pseudomolecules van chromosoom-niveau1.
De Agrobacterium-gemedieerde floral-dip transformatie methode is de meest algemeen gebruikte methode lijnen te maken trasngenic in A. thalianageworden, en de ontwikkeling van een reproduceerbare systeem van transformatie was een kritieke factor in het succes als een genetische model12,13. Niet alle soorten van de Brassicaceae hebben echter aangetoond dat het met succes worden omgezet met behulp van de methode van de bloemen-dip ontwikkeld voor A. thaliana. Speciaal, de Brassicaceae Lineage II-soorten die S. parvula omvatten geweest recalcitrante floral-dip op basis transformatie methoden14,15.
De onbepaalde bloeiende groei gewoonte van S. parvula, gecombineerd met haar smalle blad morfologie heeft gemaakt het uitdagend om de standaard Agrobacterium-gemedieerde floral-dip transformatie methode te hanteren. In deze studie rapporteren we het gewijzigde protocol die wij hebben ontwikkeld voor reproduceerbare transformatie van S. parvula.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>90000-762</td><td>Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics</td></tr><tr><td>B5 vitaminen</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G1019</td><td>Gamborg&rsquo;s Vitamin Solution</td></tr><tr><td>Desiccant</td><td>W A Hammond Drierite, Xenia, OH</td><td>22005</td><td>Indicating DRIERITE 6 mesh</td></tr><tr><td>Destinatie vector voor planttransformatie</td><td>TAIR</td><td>Vector:6531113857</td><td>pKGWFS7</td></tr><tr><td>Electroporatie cuvet</td><td>USA Scientific</td><td>9104-5050</td><td>Electroporation cuvet, ronde dop, 0.2 cm opening</td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA</td><td>1652100</td><td>MicroPulser Electroporator</td></tr><tr><td>Mestkorrels</td><td>Osmocote Garden, Marysville, OH</td><td>N/A</td><td>Osmocote Smart-Release Plant Food&nbsp;Flower &amp; Vegetable</td></tr><tr><td>Gel extractiekit</td><td>iNtRON Biotechnology, Boston, MA</td><td>17289</td><td>MEGAquick-spin Total fragment DNA purificatiekit</td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G1914-5G</td><td>Gentamicine sulfaat</td></tr><tr><td>Glufosinaat-ammonium (11,3%) herbicide (BASTA)</td><td>Bayer Environmental Science, Montvale, NJ</td><td>N/A</td><td>FINALE herbicide</td></tr><tr><td>Kanamycine</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>200004-444</td><td>Kanamycine monosulfaat</td></tr><tr><td>MES</td><td>Bioworld, Dublin, OH</td><td>41320024-2</td><td>MES, vrije zuur</td></tr><tr><td>MS-zout</td><td>MP Biomedicals, Santa Anna, CA</td><td>092621822</td><td>Hoagland's gemodificeerde basale zoutmengsel</td></tr><tr><td>N6-benzylaminopurine (BA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>B3274</td><td>6-Benzylaminopurine oplossing</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Alrich</td><td>S7653</td><td>Natriumchloride</td></tr><tr><td>Niet-ionische detergent</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>9005-64-5</td><td>TWEEN 20&nbsp;</td></tr><tr><td>Plasmid isolatiekit</td><td>Zymo Research, Irvine, CA</td><td>D4036</td><td>Zyppy Plasmid Kits</td></tr><tr><td>Recombinase enzym mix kit</td><td>Life Technology</td><td>11791-020</td><td>Gateway LR Clonase II Enzyme mix</td></tr><tr><td>Rifampicine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>R3501-1G</td><td>Rifampicine, poeder, 
&#8805; 97% (HPLC)</td></tr><tr><td>Schudende incubator</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>SHKE4450</td><td>MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakers</td></tr><tr><td>Grondmix</td><td>Sun Gro</td><td>SUN239223328CFLP</td><td>Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix</td></tr><tr><td>Spectinomycine</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>IC15206705</td><td></td></tr><tr><td>Steriele 50 mL kegelbuizen</td><td>USA Scientific, Ocala, FL</td><td>1500-1811</td><td>50 mL kegelvormige schroefdopbuizen, copolymer, rekken, sterieel</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>57-50-1</td><td>Sucrose, ACS</td></tr><tr><td>Tensioactieve oplossing</td><td>Lehle seeds, Round Rock, TX</td><td>VIS-02</td><td>Silwet L-77</td></tr><tr><td>Topoisomerase-gebaseerde kloningskit</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA</td><td>K240020</td><td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit, met One Shot TOP10 Chemisch competent E. coli</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>90000-282</td><td>BD Bacto Tryptone, BD Biosciences</td></tr><tr><td>Gistextract</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>90000-722&nbsp;</td><td>BD Bacto Yeast Extract, BD Biosciences</td></tr></tbody></table>

planten groei en agrobacterium-gemedieerde floral-dip transformatie van de extremophyte schrenkiella parvula

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

Schrenkiella parvula is een extremophyte aangepast aan verschillende abiotische stress, met inbegrip van meervoudige ion toxiciteit druk. Ondanks hoge kwaliteit genomic middelen beschikbaar om te bestuderen hoe de planten zich aanpassen aan milieu benadrukt, zijn waarde als een model van de functionele genomica en gereedschap heeft is beperkt door het ontbreken van een haalbaar transformatie-systeem. In dit protocol rapporteren we hoe te genereren van stabiele transgene S. parvula lijnen met behulp van een methode met Agrobacterium-gemedieerde floral-dip. We bewerkt de transformatie-protocol dat wordt gebruikt voor A. thaliana ter verantwoording voor de unieke eigenschappen van S. parvula, zoals de gewoonte van een onbepaalde bloei en een gehalte aan hoge epicuticular was op Bladeren. S. parvula zaden waren kort, gelaagde bij 4 ° C voor vijf dagen voor het planten. Planten zijn geteeld op een fotoperiode van een 14 h licht en 10 uur donker en een 130 µmol m-2s-1 lichtintensiteit, bij 22 ° C tot 24 ° C. Acht tot negen weken oude planten met meerdere bloeiwijzen werden geselecteerd voor transformatie. Deze bloeiwijzen werden ondergedompeld in een oplossing van de infiltratie van Agrobacterium tumefaciens GV3101 uitvoering van de pMP90RK -plasmide. Wij uitgevoerd twee rondes van de bloem dompelen met een interval van drie tot vier weken de transformatie-efficiëntie te verhogen. De T1 zaden werden verzameld en gedroogd voor vier weken in een container met droogmiddelen alvorens kiemkracht aan het scherm voor kandidaat getransformeerd lijnen. Weerstand tegen BASTA werd gebruikt om het scherm T1 planten. Wij de oplossing BASTA gespoten driemaal met een tussenpauze van drie dagen vanaf twee weken oude planten om valse positieven. Een valproef BASTA werd uitgevoerd op het overleven van de individuele planten te identificeren waar positieve transformants. De efficiëntie van de transformatie was 0.033%, opbrengst 3 – 4 transgene planten per 10.000 T1 zaden gekweekt.

Ontwikkelden we een transformatie-protocol waarmee oogsten van T0 zaden binnen 150 dagen, met behulp van een methode van de bloemen-dip aangepast ten opzichte van die voor A. thaliana. Figuur 1 toont een overzicht van de tijdlijn en S. parvula planten die de optimale fase vertegenwoordigen voor het uitvoeren van de transformatie via floral-dip. Wij hebben gekozen S. parvula planten met 70 –80 bloemen in meerdere bloeiwijz...

Agrobacterium-gemedieerde transformatie met een bloemen-dip-methode kan met succes worden gebruikt om het creëren van stabiele transgene lijnen van het extremophyte model Schrenkiella parvula. We presenteren een protocol aangepast ten opzichte van die voor Arabidopsis thaliana, overwegen verschillende groei gewoonten en fysiologische kenmerken van de extremophyte.

Planten groei en Agrobacterium-gemedieerde Floral-dip transformatie van de Extremophyte Schrenkiella parvula

Schrenkiella parvula is an extremophyte adapted to various abiotic stresses, including multiple ion toxicity stresses. Despite high-quality genomic ...

Deze methode, een reproduceerbare transformatie protocol voor Schrenkiella parvula, kan helpen bij het beantwoorden van vragen op het gebied van plantaardige vergelijkende en functionele genoming, met name studies onderzoeken van plantaardige aanpassingen aan barre omgevingen. Deze techniek maakt het mogelijk om routinefuncties in Schrenkiella-parvula op het extremofyte te onderzoeken, aangepast aan multi-ionzoutspanningen. Het maakt ook vergelijkende studies mogelijk die ook naar zijn naaste verwant kijken, de moederouder Aribidopsis Thaliana.Schrenkiella Parvula vergelijken met Aribidopsis Thaliana kan inzicht geven in varianties in genregulatie en functie die de unieke aanpassing van Schrenkiella parvula mogelijk maken. Het transformatieprotocol voor Arabidopsis Thaliana is al goed ingeburgerd. De methode maakt nu vergelijkende studies met behulp van transgene Schrenkiella Parvula planten.Over het algemeen onderzoekers nieuw op deze methode zal worstelen vanwege de bloeiende gewoonte en de bladmorfologie van Schrenkiella Parvula planten die effectieve transformatie met behulp van een flora dip evenals de selectie van echte transformatoren moeilijk. Om te beginnen, gebruik maken van een natte tandenstoker om ongeveer 20 tot 25 S.Parvula zaden over te brengen op natte grond. Dan stratificeren de zaden op vier graden Celsius gedurende vijf tot zeven dagen.Na de gelaagdheid, terug de zaden naar de groeikamer voor zeven tot 10 dagen. Zodra alle zaailingen hebben ontkiemd, laat slechts een zaailing in elk van de vier hoeken en in het midden van de potten. Kweek de planten gedurende acht tot tien weken in de groeikamer tot ze bloeien.Selecteer op de dag van transformatie S.Parvula-planten volgens het tekstprotocol. Gebruik tangen en kleine schaar om alle bestoven bloeiwijzen die zich al ontwikkelen tot siliques te verwijderen. Nadat de planten klaar zijn, bereidt u een agrobacterium-infiltratieoplossing voor.Daarna dip je de S.Parvula-bloeiwijze in agrobacterium-infiltratieoplossing gedurende 20 seconden. Hier wordt het vroegste stadium van de planten getoond die kunnen worden gebruikt voor transformatie, zolang reeds ontwikkelde siliques worden verwijderd voordat de transformatie wordt verwijderd, kunnen oudere planten met meer bloemen worden gebruikt. Na de transformatie, plaats bloem gedoopt planten horizontaal in schone trays met koepels om de planten te dekken.Plaats de planten vervolgens één tot twee dagen in een donkere groeiruimte. Breng de planten terug naar een rechtopstaande positie en breng ze over naar de groeiruimte. In de volgende week, monitor de gedoopte bloeiwijzen.Tien dagen na de eerste bloemendip blijven S.Parvula planten nieuwe bloeiwijzen en siliques produceren. Een tweede ronde van florale dip kan worden uitgevoerd om de nieuwe opkomende bloeiwijzen verder te transformeren. Kweek de planten tot zaden rijpen, en oogst de zaden ongeveer 21 weken.Droog de zaden twee tot drie weken bij kamertemperatuur in een luchtdichte container gevuld met drooggezwoken. Plant de T een zaden volgens het tekstprotocol. Kweek de planten tot de eerste twee tot drie echte bladeren ontwikkelen.Om de eerste selectie voor herbicideweerstand uit te voeren, verdun je glufosinate ammoniumherbicide en spuit je het op de zaailingen. Bedek de zaailingen met de koepels 's nachts. Zet de trays terug naar de groeiruimte en verwijder de koepel.Wacht tot de meeste zaailingen worden geselecteerd door het herbicide. Om te beginnen met de tweede selectie, identificeer de planten die overleven na drie tot vier keer bespoten met de BASTA-oplossing. Na het kweken van de planten voor twee tot drie weken, selecteert u de grootste volwassen blad op elke plant.Wrijf vervolgens het oppervlak van het blad voorzichtig met een vinger om de waslaag te verwijderen. Plaats vervolgens een druppel van de verdunde BASTA-oplossing op het blad. Controleer de bladeren die met de BASTA-oplossing worden behandeld voor tekenen van verwelking tot een week.Selecteer ten slotte de planten met bladeren die niet door de BASTA-druppels worden beïnvloed voor verdere analyse. In dit protocol werd S.Parvula getransformeerd met agrobacterium met behulp van een floral dip methode. Infectie met agrobacterium resulteerde in abortus van sommige bloemen.Nochtans bleven de installaties S.Parvula nieuwe bloemen na het eerste bloemdompelen produceren, en konden opnieuw worden omgezet. Met behulp van de BASTA spray en drop tests kunnen echte positieve transformatoren nauwkeurig worden geïdentificeerd. Het aantal monsters getest met behulp van PCR bevestiging kan worden verminderd.Hoewel deze methode vergelijkbaar is met de transformatie van Arabidopsis Thaliana, is het belangrijk om de verschillen in groei en morfologie van Schrenkiella Parvula te onthouden. Het wijzigen van het protocol om deze verschillen weer te geven is essentieel voor een succesvolle transformatie. Deze techniek kan onderzoekers helpen de evolutie van genomische variaties te verkennen die leiden tot meerdere zoutstressaanpassingen in het extremofytemodel, Schrenkiella Parvula.Door deze techniek te combineren met de informatie over de functies van Aradopsis Thaliana, een andere fabriek die nauw verwant is aan Schrenkiella Parvula. Onderzoekers kunnen de variaties in de verordening en functies bestuderen dat dit twee verschillende structuren tussen deze twee soorten zijn. Tijdens het transformatieproces is het belangrijk om alle agrobacterium infiltratieoplossing in autoclaveable containers te bevatten.Steriliseren en veilig weggooien van alle materialen die in contact kwamen met agrobacterium met inbegrip van handschoenen, macro pipet tips, en papieren handdoeken.

plant-growth-agrobacterium-mediated-floral-dip-transformation

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Dit artikel illustreert de bloemen-dip methode...

Bloemen-dip Transformatie van Arabidopsis thaliana Om te onderzoeken PTSO2:: β-glucuronidase Reporter Gene Expression

Source: Lee, H. et. al., Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates a method for monitoring bacterial infection and effector protein delivery in plant cells using split superfolder green fluorescent protein (sfGFP) complementation combined with confocal microscopy. The approach enables precise visualization of effector translocation into the host cell cytosol.

Monitoring Bacterial Infection and Effector Protein Delivery in Plant Cells

In this video, we demonstrate generation of transgenic Arabidopsis plants expressing stable transgene through Agrobacterium-mediated binary bacterial artificial chromosome-based gene transformation.

Binary Bacterial Artificial Chromosome Vector Based Gene Transformation in Arabidopsis Plants: A Technique to Generate Transgenic Plants With Single-Copy Insertion

Hier presenteren we een protocol om vlas te transformeren met behulp van Agrobacterium-gemedieerde transformatie van planten via florale-dip. Dit protocol is eenvoudig uit te voeren en goedkoop, maar levert een hogere transformatie tarief dan de huidige beschikbare methoden voor vlas transformatie.

Bloemen-Dip Transformatie van vlas ( Linum usitatissimum) Om Transgene progenies Genereer met een High Transformation Rate

Met behulp van een pBIBAC-GW binaire vector maakt genereren van transgene planten met intact single-kopie invoegingen, een eenvoudig proces. Hier is een reeks van protocollen die leiden de lezer door het proces van het genereren van transgene planten van Arabidopsis en testen van de planten voor INTACTHEID en aantal kopieën van de inserts gepresenteerd.

Genereren van transgene planten met Single-kopie invoegen met behulp van de binaire Vector BIBAC-GW

Fluorescerende eiwit gebaseerde benaderingen te controleren effectoren uitgescheiden door bacteriën in de cellen van de gastheer zijn uitdagend. Dit is te wijten aan de incompatibiliteit tussen fluorescente proteïnen en het type III secretie systeem. Hier, wordt een geoptimaliseerde split superfolder GFP-systeem gebruikt voor visualisatie van effectoren uitgescheiden door bacteriën in de fabriek van de gastheercel.

Split groen Fluorescent proteïne systeem te visualiseren effectoren verlost van bacteriën tijdens de infectie

Hier presenteren we twee protocollen te transformeren aardappelplanten. De transformatie van het Agrobacterium tumefaciens leidt tot een volledige transgene plant terwijl het Agrobacterium rhizogenes produceert transgene harige wortels in een wild type shoot die zelf gekweekte kunnen. We detecteren dan promotor activiteit door GUS vlekken in het getransformeerde wortels.

Agrobacterium tumefaciens en Agrobacterium rhizogenes-gemedieerde transformatie van aardappel- en de activiteit van de promotor van een gen suberine door GUS Staining

Hier presenteren we gemakkelijk te gebruiken protocollen voor het produceren en zuiveren van diterpenoid metabolieten door de combinatorische expressie van biosynthetische enzymen in Escherichia coli of Nicotiana benthamiana, gevolgd door chromatografische product Zuivering. De resulterende metabolieten zijn geschikt voor verschillende studies, waaronder moleculaire structuur karakterisering, enzym functionele studies, en bioactiviteitentesten.

Een aanpasbare aanpak voor de enzymatische productie en zuivering van Diterpenoid natuurlijke producten

Dit protocol schetst het gebruik van Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde transformatie (AMT) voor het integreren van gen(en) van belang in het nucleaire genoom van de groene microalg Chlorella vulgaris, wat leidt tot de productie van stabiele transformatoren.

Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde genetische manipulatie van groene microalgen, Chlorella vulgaris

We presenteren een efficiënt, geoptimaliseerd protocol voor Agrobacterium-gemedieerde transformatie van een aseksuele amfibische Brassicaceae-soort, Rorippa aquatica, zonder resource-intensieve steriele weefselkweekprocedures. Het gebruik van een visuele transformatiemarker en een scheutregeneratiepijpleiding genereerde succesvol bijna klonale transformanten, waardoor toekomstige studies van de aanpassing van planten aan de onderwateromgeving werden bevorderd.

Efficiënte regeneratie-gebaseerde agrobacterium-gemedieerde transformatie van een aseksuele amfibische Brassicaceae-soort, Rorippa aquatica

We presenteren een eenvoudig, effectief en reproduceerbaar protocol voor Agrobacterium-gemedieerde transformatie van Phytophthora palmivora, dat ook toepasbaar is op P. capsici.

Een vereenvoudigde methode voor agrobacterium-gemedieerde transformatie van Phytophthora palmivora

Leer de Agrobacterium-gemedieerde floral-dip transformatie voor Schrenkiella parvula. Deze methode maakt stabiele transgene lijnen mogelijk om extremofytadaptaties aan zoutstress te bestuderen.

Planten groei en Agrobacterium-gemedieerde Floral-dip transformatie van de Extremophyte Schrenkiella parvula

Meer video's verkennen