Een zuivering en In Vitro activiteit Assay voor een (p) ppGpp Synthetase van Clostridium difficile

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over fosforenzymen, waaronder enzymsubstraatspecificiteit en reactiekinetiek. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het zorgt voor een snelle verzameling van meerdere gegevenssets die zeer consistent zijn, waardoor statistisch robuuste kwantificering van enzymactiviteit mogelijk is. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang omdat het spotten van de reacties op de TLC-platen en het kwantificeren van de radioactieve soorten in de reacties veel gemakkelijker aan te tonen is dan uit te leggen.

Naast Astha, het aantonen van de procedure zal worden Azië Poudel, een andere afgestudeerde student van mijn laboratorium. Begin dit protocol met inducible overexpressie van een histidine-gelabeld eiwit zoals beschreven in het tekstprotocol. Bereid een milliliter nikkel nitriloacetische zuur hars in een zwaartekracht kolom om het eiwit te zuiveren.

De dag voor gebruik, equilibrate de kolom 's nachts op vier graden Celsius met twee milliliter van evenwicht buffer. De volgende dag breng de kolom van vier graden Celsius op kamertemperatuur voorafgaand aan het laden van de verduidelijkt lysate en laat het staan voor ongeveer twee tot drie uur. Dan resuspend de pellet in de lyse buffer.

Sonicate de cellen op ijs voor 10 keer 10-seconden intervallen, pauzeren 30 seconden tussen pulsen. Verhelder het lysaat door centrifugatie op 3, 080 keer g gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius met behulp van een microcentrifuge. Bereid het verduidelijkte lysaat voor met gelijke volumes lysisbuffer, pas vervolgens het voorbereide, verduidelijkt lysaat toe op de kolom en verzamel de doorstroom.

De opgehelderde lysaatstroom opnieuw doorzetten naar de kolom en de secundaire doorstroom verzamelen. Was vervolgens de kolom met vijf milliliter wasbuffer een en het verzamelen van de flow-through. Was de kolom opnieuw met vijf milliliter wasbuffer twee en verzamel de flow-through.

Breng nu twee milliliter elutie buffer. Verzamel flow-through in twee fracties van een milliliter per stuk. Tijdens de eiwitzuivering is opname van magnesiumchloride in de zuiveringsbuffers, een wijziging van het protocol van de fabrikant, essentieel voor enzymatische activiteit.

Om eiwitzuivering door SDS-PAGE kwalitatief te beoordelen, voer 20 microliter aliquots van alle kolomfracties uit op een stapeling van 4%, 10% lopende polyacrylamide gel gedurende 60 minuten op 170 volt. Vlek de gel met 0,1%Coomassie blauw op kamertemperatuur gedurende vijf uur, zachtjes schommelen op een benchtop rocker. Dan destain de gel in 40% methanol-10%glaciale azijnzuur 's nachts bij kamertemperatuur, schommelen op de benchtop rocker.

Dialyze de eluted fractie twee tegen dialyse buffer op een 200:1 verhouding met behulp van een een-milliliter dialyse apparaat met een 20-kilodalton moleculair gewicht cutoff 's nachts op vier graden Celsius. Bepaal de concentratie van dialyseerd eiwitmonster door absorptie op 280 nanometer te meten en de berekende molaire extinctiecoëfficiënt te gebruiken. Bewaar 100-microliter aliquots van het dialyseerde eiwitmonster bij min 80 graden Celsius tot gebruik.

Bereid de reactie vóór het uitvoeren van de reactie pei cellulose dunne laagchromatografieplaten door ze in gedeïsatiseerd water te wassen. Plaats de platen in een glazen kamer met dubbel gedestilleerd water tot een diepte van ongeveer 0,5 centimeter. Nadat het water naar de bovenkant van de plaat is gemigreerd, brengt u de platen uit de glazen kamer en laat u 's nachts op een banktoprek drogen.

Markeer de gedroogde platen twee centimeter van één rand met een zacht potlood om aan te geven waar de monsters voor TLC worden aangebracht. Voor monsters met twee microliter, breng monsters niet minder dan een centimeter uit elkaar. Bij het plannen van experimenten, altijd laat een plek op elke plaat ongebruikt om te dienen als een lege baan voor monster kwantificering.

Om de enzymactiviteitstest uit te voeren, bereidt u individuele reacties voor met behulp van gamma P32 ATP zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg de RSH toe nadat de andere componenten zijn gemengd, omdat de toevoeging van RSH aan de nucleotide-bevattende mix de enzymatische activiteitstest initieert. Om atp hydrolyse te controleren tegen vervuilende nuclease-activiteit, verzamelt u een 10-microliterreactie die geen eiwit bevat en parallel uitbroedt.

Spot twee-microliter monsters op T gelijk nul en aan het einde van het experiment om ervoor te zorgen dat ATP niet werd gehydrolyseerd in de afwezigheid van eiwitten. Onmiddellijk na toevoeging van RSH, verwijder twee microliters en spot het op de gelabelde PEI-cellulose plaat als de T gelijk is aan nul minuten monster. Broed de reactie op 37 graden Celsius, het verwijderen van twee-microliter aliquots op de gewenste tijdstippen.

Nadat alle aliquoten zijn verzameld, voert u dunne laagchromatografie uit door de chromatografiekamer te vullen met 1,5-molaire monobasische kaliumfosfaat tot een diepte van 0,5 centimeter. Dompel de onderkant van de plaat onder in oplosmiddel en laat het oplosmiddel gedurende ongeveer 90 minuten naar de bovenkant van de plaat migreren. Haal de plaat uit de chromatografietank en leg deze 's nachts op een droogrek van benchtop om 's nachts aan de lucht te drogen.

Nadat de plaat droog is, wikkel de plaat in plastic folie om de overdracht van radioactief materiaal naar de beeldvorming cassette te voorkomen en analyseren door autoradiografie. Leg de PEI-celluloseplaat met gescheiden reacties op een fosforimagercassette vier uur lang bloot bij kamertemperatuur. Na blootstelling, beeld de cassette op een fosforimager.

Met behulp van imaging software met een grafische gebruikersinterface, trekken regio's van belang of ROI's door eerst draw a Rectangle te selecteren, gebruik dan de muis om rechthoekige ROI's te tekenen rond een hele rijstrook en de ATP en guanosine-tetraphosfate vlekken in die rijstrook. Gebruik de opdrachten Selecteren, Kopiëren en Plakken om identieke ROI's binnen de andere rijstroken te tekenen om ervoor te zorgen dat de ROM's signaal meet binnen identieke gebieden in elke rijstrook. Neem ROI's op van een ongebruikte rijstrook die als losse flodders moet worden gebruikt.

Selecteer met behulp van de analyse, hulpmiddelen, ROI Manager, Opdrachten toevoegen van de imaging-software alle ROI's die op de PEI-celluloseplaat zijn getekend. Gebruik nu de opdrachten Analyseren, Metingen instellen, Meten om de signaalintensiteit binnen elke ROI te kwantificeren en de metingen te exporteren als een spreadsheeet. Trek in de spreadsheet lege ROI-waarden af van experimentele signalen.

Het omzetten van de gegevens naar het percentage guanosine-tetraphosfat gesynthetiseerd is van cruciaal belang, omdat het ervoor zorgt dat gegevenssets verzameld op verschillende dagen met verschillende partijen eiwit of verschillende gamma P32 ATP consistent zijn en kunnen worden samengevoegd voor statistische strengheid. Deze cartoon laat zien hoe bezienswaardigheden worden gebruikt om een rijstrook te definiëren die het totale radioactieve signaal in een monster bevat en de component radioactieve ATP en guanosine tetraphosfate regio's van belang. ATP- en guanosine-tetrapsfatesignalen worden genormaliseerd tot het totale signaal in plaats van de absolute waarden te rapporteren omdat pipettingfout of verval van het radioactieve substraat het totale signaal in het monster kan beïnvloeden, maar geen invloed hebben op de enzymactiviteit.

Hier getoond is een werkelijke TLC plaat van een reactie uitgevoerd met behulp van gezuiverde C.difficile RSH. Een controlereactie die geen eiwit bevat, maakt kwantificering van niet-gekatalyseerde ATP hydrolyse mogelijk, terwijl een lege rijstrook nauwkeurige signaalkwantificering mogelijk maakt. In de ATP- en guanosine-tetraphosfat-vlekken brengt het enzym het radioactieve fosfaat van ATP-substraat over naar bbp-voorloper, waardoor radioactief guanosine tetraphosfat ontstaat.

Dit bevestigt dat de vermeende guanosine tetraphosfate synthetase van C.difficile een actief enzym is. Door de reactie met tussenpozen te bemonsteren, kan de voortgang worden waargenomen. Hier wordt het ruwe signaal waargenomen op elk tijdstip.

ATP neemt af en guanosine tetraphosfat neemt toe. Hier worden de genormaliseerde gegevens weergegeven. De foutbalken zijn veel kleiner omdat normalisatie rekening houdt met een pipettingfout.

Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om voorzichtig te zijn niet te krassen op de hars op de TLC-plaat, omdat dit kan interfereren met oplosmiddel migratie. Dit is een zeer toegankelijke techniek met eenvoudige data-analyse die snel een robuuste kwantificering van enzymactiviteit kan bieden. We hebben het gebruikt om te bevestigen dat Clostridium difficile guanosine tetraphosfat synthetiseert, wat nooit eerder is gemeld.

Vergeet niet dat het werken met radioactiviteit zeer gevaarlijk kan zijn en dat u de regels van uw instelling voor de opslag en het gebruik van radioactieve materialen moet volgen tijdens het uitvoeren van deze procedure. Deze methode kan inzicht geven in guanosine tetraphosfaetsynthese, maar kan ook worden toegepast op andere fosforreacties, waaronder eiwitkinaseactiviteit en cyclische diguanyaatsynthese.