Digitale analyse van immunokleuring van ZW10 interactie eiwit in menselijke Long weefsels

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de pathologische en de immunohistochemie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat sneller genoeg en dat produceert digitale media met hoge kwaliteit. Begin met het vaststellen van een drie-bij-drie centimeter kung weefsel monster in 4%paraformaldehyde gedurende 24 uur bij kamertemperatuur.

De volgende dag dehydrateert u het weefsel in oplopende ethanolonderdompelingen bij kamertemperatuur, gevolgd door drie onderdompeen in 100% xyleen gedurende 20 minuten per behandeling. Na de laatste xylene onderdompeling, plaats het weefsel in 63-graden Celsius paraffine gedurende 30 minuten, gevolgd door een tweede 45 minuten onderdompeling in verse 63-graden Celsius paraffine, verander dan de paraffine nog een keer voor een laatste een uur incubatie. Wanneer de paraffine is afgekoeld, gebruik dan een roterende microtome om vijf micrometer dikke delen van het paraffine-ingebedde weefselmonster te verwerven, waarbij de secties op 20 microgram per milliliter poly-L-lysine-gecoate glijbanen worden vastgelegd.

Voor het dewaxen, plaats de dia's in een 65-graden Celsius oven voor twee uur, gevolgd door onderdompeling in dimethylbenzeen gedurende 15 minuten en weken in 100% xyleen gedurende 15 minuten, dan rehydrateren van de dia's in een dalende ethanol onderdompeling serie. Voor antigeenreparatie plaatst u de glijbanen in een antigeenreparatiebox en voeg 300 milliliter citroenzuurreparatievloeistof aan de doos toe. Verwarm de doos in een magnetron op hoog vermogen gedurende twee minuten, gevolgd door verwarming op een laag vermogen te ondersteunen koken gedurende zes minuten.

Wanneer de glijbanen zijn afgekoeld tot kamertemperatuur, was de weefselmonsters met drie vijf minuten durende PBS-molaire wasbeurten in een roterende shaker bij kamertemperatuur. Om de endogene peroxidase te elimineren, incubeer de glijbanen met 3%waterstofperoxide in dubbel gedestilleerd water gedurende 30 minuten in een natte doos bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, was de dia's zoals aangetoond en sluit elke niet-specifieke binding op elke sectie met 100 microliters van 10% geitenserum gedurende 39 minuten bij 37 graden Celsius.

Label vervolgens de weefsels met 100 microliters anti-ZWINT-antilichaam per dia bij vier graden Celsius 's nachts, gevolgd door drie wasbeurten in 0,01 molaire PBS. Na de laatste wasbeurt, incubeer de dia's met een geschikte secundaire antilichaam gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius, gevolgd door drie 0,01 molaire PBS wast. Voeg na de laatste wasbeurt de glijbanen gedurende 10 minuten toe aan 300 microliters verse DAB, gevolgd door een wasbeurt van 10 seconden met kraanwater bij kamertemperatuur.

Tellers bevlekken de weefsels met hematoxyline kleuring oplossing gedurende twee minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door het wassen in leidingwater gedurende 15 minuten, dan uitdrogen van het weefsel weer in oplopende ethanol onderdompelingen, gevolgd door twee 15 minuten onderdompelingen in xyleen bij kamertemperatuur. Na de laatste 100% ethanol onderdompeling, monteer de secties met 15 microliter van een 5% xyleen in neutrale gomoplossing en bedek elk weefselmonster met een afdekglas. Voor het automatisch scannen van de secties in de hele glijbaan, laat u de dia's eerst 12 uur drogen bij kamertemperatuur om de weefselmonsters uit te drogen.

Selecteer vervolgens in de automatische hele diascanner Brightfield handmatig en voer de handmatige scaninterface in. De naam van de dia's herzien en een opslagpad voor de afbeeldingen selecteren. Stel het scangebied in en selecteer de scanvoorbeelden met de optie Drempelwaarden instellen door de gebruiker.

De drempel is ongeveer 50 met een scanoppervlakte uitbreidingswaarde van 200 micrometer. Stel de focuswaarde voor het scannen in en selecteer Automatische focus- en enkele laagmodus, laad de dia's op het werkstation en start het automatisch scannen. Wanneer alle dia's zijn gescand, slaat u de afbeeldingen op voor latere analyse.

Als u de afbeeldingen van de longweefselsecties wilt analyseren, opent u de histopathologische beeldanalysesoftware en selecteert u Lokale computer om het bestand te openen met de scangegevens. Selecteer het juiste zoomniveau en gebruik Kleur aanpassen in- en uitschakelen om de kleur in te stellen op het optimale contrast en vervolgens de interessegebieden voor elke afbeelding te omcirkelen en een naam te geven. Selecteer vervolgens onder plug-ins de optie QC. De Scenario Builder verschijnt.

Selecteer Density Quant en pas de detectiebalk aan. Pas de scoreniveaus aan totdat de kleurintensiteit van de omcirkelde gebieden vergelijkbaar is met die van de oorspronkelijke afbeeldingen en sla het model op als een nieuw bestand, pas het model toe op andere dia's en selecteer Geselecteerde annotatie om de software automatisch de APE-score te laten berekenen voor de regio's die in elke afbeelding van belang zijn. Whole-slide digitale scannen van longweefsel secties van tumor en aangrenzende niet-tumor weefsels van niet-kleincellige longkanker specimens produceert digitale beelden van een hoge kwaliteit.

APE scores berekend op basis van deze vormen van longkanker monsters zijn meestal aanzienlijk hoger dan die bepaald voor de aangrenzende niet-kanker weefsels. Bovendien worden zwint-expressieniveaus in plaveiselcelcarcinoomweefselsecties vaak vastgesteld dat ze aanzienlijk hoger zijn dan die welke worden gemeten in abnocarcinoomweefselmonsters. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden voor te bereiden met een hoge kwaliteit van de tumor of tumor gebieden tijdens het maken van pathologische scannen.

Na deze procedure kunnen andere methoden van de microscopie worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden. Noch de of andere methode voor pathologisch scannen. Na deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van pathologisch scannen om digitale diagnostiek in het onderzoeksdoel te verkennen.

Vergeet niet dat het werken met paraformaldehyde zeer gevaarlijk kan zijn en voorzorgsmaatregelen zoals maskers moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.