Een Micro-agar zout Bridge-elektrode voor het analyseren van de Proton Verwerkingsfrequentie van recombinante membraaneiwitten

Deze methode kan helpen bij het onderzoek van membraaneiwitten zoals transporters en kanalen. De informatie over substraatomzetverlies dat eiwitactiviteit en specificiteit vergelijkt met de verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het minimaliseert potentiële verschuiving variatie en chloride vrije buffer voorwaarden.

En verhoogt de nauwkeurigheid van de bepaling van de omloopsnelheid aanzienlijk als gevolg van nauwkeurigere membraanpotentieelmetingen. Verzamel de elementen voor de vuiststappen. Deze omvatten twee micro-capillaire pipet tips, een scherp mes en een schuifklauw.

Voor de elektrode hebben zilverdraad, zand papier en een drie molaire kaliumchloride oplossing bij de hand. Daarnaast hebben ethanol en water voor reiniging en een DC voeding. Ga verder door te werken met de twee micro-pipet tips.

Begin met de tip die de buffer zal bevatten. Plaats de tweede tip naast de eerste. Verplaats de tweede tip, dus, wanneer ingevoegd het smalle deel zal uitbreiden ten minste vijf millimeter in het smalle deel van de eerste.

Markeer de positie waar de eerste buffer met tip zal worden bevestigd. Gebruik vervolgens de remklauw om de lengte van de micro-agar zoutbrugelektrode te meten. Gebruik het mes om de punt op de juiste lengte te snijden.

Reinig het snijoppervlak met ethanol, gevolgd door water. Vervolgens krijgt u een lengte van ongeveer acht centimeter zilverdraad voor de elektrode. Reinig de draad op doekjes met ethanol, gevolgd door water.

Gebruik na het reinigen zandpapier om het oppervlak aan één centimeter lengte aan één uiteinde glad te maken. Deze draad met zijn gladgestreken uiteinde is klaar om elektrochemisch gecoat te worden. Plaats het gladgemaakte uiteinde in de kaliumchlorideoplossing met het andere uiteinde aangesloten op een DC-voeding voor coating.

Wanneer gecoate, los de elektrode en schoon te maken met water. Na het drogen, bepaal de lengte die het mogelijk maakt om de micro capillaire tip zo diep mogelijk te penetreren. Snijd de elektrode van de ongecoate kant tot de juiste lengte.

Ga nu verder met het bereiden van een zoutoplossing met agarose. In een kolf met water oplossen kaliumchloride en gebruik een magnetische roerder om te helpen mengen. Voeg na het verwijderen van de roerder agarose toe aan de kolf.

Neem de fles naar een magnetron en verwarm het om de agarose smelten op ongeveer 100 graden Celsius. Neem het uit om visueel te controleren of de agarose volledig is opgelost. Zodra de agarose is opgelost pipet 10 microliters in de micro-capillaire langzaam om luchtbellen te voorkomen.

Het is belangrijk om de agar zoutoplossing zorgvuldig in de micro capillaire punt te pipetten, vooral bij hoge agarconcentraties. Als niet goed gedaan luchtbellen zijn gemakkelijk geproduceerd in de tip en blokkeren elektrische stroom. Na het verwijderen van de tip van de pipet duw de elektrode in.

Zorg ervoor dat de elektrode de zoutoplossing binnendringt. Wanneer de elektrode zich bij kamertemperatuur aansluit, wordt deze aangesloten op een referentieelektrode in een versterker. Steun de referentie-elektrode, zodat het kan worden verlaagd in een plastic container met een milliliter buffer.

Vervolgens dompel de zoutbrugelektrode in de oplossing. Breng een spanning aan en controleer of er een huidige reactie is voordat u verdergaat. Als de test succesvol is, koppelt u de elektroden los.

Bewaar indien nodig de zoutbrugelektrode door deze onder te dompelen in een driekiesterige kaliumchlorideoplossing. Bereid vervolgens de buffer met plastic punt. Neem een micro capillaire tip en identificeer een punt twee centimeter van het smalle deel.

Gebruik een verwarmingsdraad om de buis 90 graden te buigen op deze positie. Met een scherp mes snijd de buis vijf millimeter van de gebogen. Reinig het gebied dat werd gesneden met ethanol, gevolgd door water.

Gebruik voordat u verdergaat een lichtmicroscoop met een weegschaal om de diameter van het gat aan de punt te meten. Verplaats vervolgens de pipet om in de buurt van een container van oplosmiddel en een andere van buffer. Pipette drie microliters van het oplosmiddel in en uit de tip.

Vul vervolgens de meettip met drie microliters buffer. Haal nu de zoutbrug uit de kaliumchlorideoplossing. Sluit de meettip met de buffer aan op de zoutbrugelektrode.

Sluit de zoutbrugelektrode en de referentieelektrode aan op een versterker. Hang op dit punt de zoutbrugelektrode in de bufferoplossing op met de referentieelektrode. Een weergave van de configuratie voor het experiment bevindt zich in dit schema.

Tijdens het experiment vormt het membraan zich aan het einde van de buffer met pipet. Verzamel gegevens om de membraancapaciteit te vinden. Doe dit door een driehoekig wisselspanningssignaal toe te passen om een rechthoekige wisselstroomrespons te creëren.

Zoek vervolgens de geleiding en spanning op nul stroom. Automatiseer de toepassing van een spanningshelling variërend van min 50 tot 50 millivolt en neem de stroom vast. Pas een lineaire functie aan op de gegevens.

De helling is de geleiding, de x-intercept is de spanning op nul stroom. Verwijder bij gebruik de meettip van de zoutbrug. Vul een nieuwe meettip met buffer, pas deze aan op verschillende pH-waarde om een protongradiënt over het membraan in te stellen.

Stel de experimentele opstelling opnieuw in met de nieuwe meetpunt en elektroden om de metingen te herhalen. Hier zijn representatieve stroomspanningsopnamen in aanwezigheid van een pH-verloop. En, bij afwezigheid van een pH-gradiënt.

De lijnen vertegenwoordigen een lineaire pasvorm aan de gegevens. De verschuiving in het x-assige snijpunt voor de verschillende pH-waarden wordt voorspeld door de Nernst-vergelijking. Deze gegevens vertegenwoordigen de verschuiving in het membraanpotentieel in de tijd voor een standaard zilverchlorideelektrode in wit, en de micro-agar zoutbrugelektrode in zwart.

De agar zoutbrug elektrode was stabieler met een maximale verschuiving van minder dan vijf millivolt over 300 seconden van de meting. In dit plot van de potentiële verschuiving als functie van pH gradiënt worden de twee elektroden gezien om zich aanzienlijk verschillend te gedragen als de pH-gradiënt toeneemt. De protonomzet is te vinden en te vergelijken voor de twee elektrodetypes.

Hier zijn protonomzetaantallen die voor mitochondriale ontkoppelingseiwit worden bepaald UCP1 die door de zoute brugelektrode wordt gemeten in vergelijking met een standaardelektrode. Er zijn ook gegevens voor het eveneens voorbereide UCP3. De tarieven lijken nauwkeuriger met de agar zout brug elektrode.

Tijdens een poging tot deze procedure is het belangrijk om te onthouden om ervoor te zorgen dat de elektrode doordringt de agar zout oplossing. De zoutbrug moet ook in de bufferoplossing duiken. Zorg er ten slotte voor dat de agar zoutoplossing geen luchtbellen bevat.