Name: Een Micro-agar zout Bridge-elektrode voor het analyseren van de Proton Verwerkingsfrequentie van recombinante membraaneiwitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Leer een micro-agar zoutbrug-elektrode maken voor nauwkeurige elektrofysiologische metingen van recombinante membraaneiwitten. Deze methode minimaliseert potentiaalverschuivingen en verbetert de precisie van substraatturnoverbepalingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de Oostenrijkse onderzoeksfonds (P31559-B20 te E.E.P.). De auteurs Sarah Bardakji bedanken voor de uitstekende technische bijstand in de productie en reconstructie van muis UCP1 en UCP3 in proteoliposomes.

1. productie van recombinante afkoppelen eiwitten (UCPs) en de vorming van vlakke dubbelgelaagde membranen
<ol><li>Productie van recombinante UCP1 en UCP3 zoals beschreven door Rupprecht et al. 9 en Hilse et al. 10
</li>
	<li>Vormen van vlakke dubbelgelaagde membranen op de toppen van conventionele overbodig plastic pipetten, zoals beschreven door Beck et al. 7
</li>
</ol>2. voorbereiding van de Micro-agar zout Bridge-elektrode
<ol><li>Aanpassen van een pipet microcapillary tip (Zie Tabel van materialen) om de juiste lengte.<ol>
<li>Markeer de plaats op een lege tip waartegen de buffer-bevattende tip zal worden gehecht aan en een glijdende remklauw gebruiken voor het meten van de lengte van de micro-agar zoutbrug elektrode. Let op: Het microcapillary uiteinde moet lang genoeg om de bufferoplossing voor de metingen.</li>
		<li>Knip het uiteinde van de microcapillary met een scherp mes of blade en het snijvlak met ethanol en water schoon.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiden de AgCl beklede elektrode.<ol>
<li>Een Ag draad van ongeveer 8 cm in lengte afgesneden en schoon met ethanol en water.</li>
		<li>Neem een stukje schuurpapier en glad naar beneden het oppervlak van de lengte van 1 cm aan het einde van de draad, die in contact met het zout oplossing moet.</li>
		<li>Dompel de afgevlakte einde in een 3 M KCl oplossing en jas het elektrochemisch met chloride met behulp van een DC-aanbod op 1,5 V voor 10 s.</li>
		<li>De elektrode met water schoon en droog het aanpassen van de lengte van de AgCl-elektrode van de ongecoate kant, zodat het dringt door in de microcapillary tip zo diep mogelijk. Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid een 3 M KCl zout oplossing met 1% (v/v) agarose.<ol>
<li>Weeg 4,47 g van KCl en los het door het roeren in een maatkolf van 20 ml water.</li>
		<li>Verwijderen van de roerder, weeg 0.2 g van agarose en toe te voegen aan de kolf.</li>
		<li>De oplossing tot 100 ° C verwarmen om te smelten de agarose en bloedstolling voorkomen. Let op: De kolf zullen erg warm. Raak het niet met blote handen. Gebruik handschoenen voor behandeling.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vul de microcapillary tip met het agarose zout oplossing. Let op: De oplossing is warm. Bescherm handen en werk zorgvuldig om te voorkomen dat spatten.<ol>
<li>Als de agarose stolling begint, opwarmen het zout oplossing volledig smelten de agarose opnieuw.</li>
		<li>Geniet van 10 µL van de agar zout oplossing in de microcapillary tip. Geniet van het langzaam en zorgvuldig om te voorkomen dat de lucht bubbels in de tip.</li>
		<li>Verwijderen van het uiteinde van de pipet en druk in de AgCl-elektrode van de bredere kant van de tip. Zorg ervoor dat de elektrode het zout oplossing doordringt.</li>
		<li>De elektrode tot kamertemperatuur afkoelen en sluit deze aan op de versterker.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stel in de buffer voor de meting.<ol>
<li>Weeg 0.710 g van nb2SO4, 0,195 g mes, 0.121 g van TRIS en 0.023 g EGTA, dan toevoegen van 100 mL gedestilleerd water in een bekerglas en roer de oplossing.</li>
		<li>Controleer voor de waarde van de pH van de buffer met behulp van een pH-elektrode en pas de pH-waarde tot 7.32.</li>
		<li>Controleer of de referentie-elektrode en de agar zoutbrug elektrode in elektrisch contact.<ol>
<li>Voeg 1 mL buffer tot een plastic container.</li>
			<li>Duik in de referentie-elektrode en de agar zoutbrug elektrode en controleren op de reactie van een signaal. Als het signaal antwoord juist is, gaat u verder met stap 2.7.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Als er een reactie van de valse signaal of geen elektrisch contact helemaal is, voert u de volgende procedure voor probleemoplossing.<ol>
<li>Controleren of de elektrode in contact met het zout oplossing is en druk op de elektrode in de oplossing. Opmerking: Als de oplossing al te plakkerig is, verwijderen van de micro-agar zoutbrug en voorbereiden van een nieuwe microcapillary-tip.</li>
		<li>Controleer of er luchtbellen in het zout oplossing. Zo ja, bereiden een nieuwe microcapillary-tip.</li>
		<li>Controleer of het zout oplossing in contact met de bufferoplossing is. Als dat niet het geval is, dan een ander 1 mm van het einde van de buis van de tip afgesneden. Let op: Zorg ervoor dat de tip nog lang genoeg om te penetreren de buffer-bevattende tip is. Als er nog steeds geen contact is, bereiden een nieuwe microcapillary-tip.</li>
		<li>Als geen van deze stappen helpen, bereiden een nieuwe microcapillary-tip.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dompel de agar zoutbrug elektrode in een 3 M KCl oplossing voor opslag. Opmerking: Het protocol kan hier gestopt worden. Voor een pauze 's nachts, slaan de elektrode in 3 M KCl zoutoplossing bij 4 ° C.</li>
	<li>De buffer-bevattende plastic tip voor te bereiden. Opmerking: Als de elektrode 's nachts opgeslagen was, neem het uit en laat het warmte tot kamertemperatuur voor 30 min.<ol>
<li>Neem een microcapillary tip en buigen van de buis, 2 cm van de rand van het nauwe gedeelte, ongeveer 90 graden met behulp van een draad van de verwarming.</li>
		<li>Een zeer scherp mes of mes gebruiken en afgesneden van de buis ongeveer 5 mm uit de bocht.</li>
		<li>Reinig het oppervlak aan het eind met ethanol en water en meten van de diameter van het gat van de tip. Bereken de oppervlakte van het oppervlak van dit.</li>
		<li>Coat het oppervlak van het uiteinde met 85:15 (v: v) hexaan: hexadecane.<ol>
<li>Pipetteer 3 µL van het oplosmiddel en het verwijderen van de tip.</li>
			<li>1 min wachten zodat al het resterende oplosmiddel in de tip is verdampt.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vul de tip voor het meten met 3 µL van buffer en sluit deze op de elektrode zoutbrug. Opmerking: Controleer opnieuw als de zoutbrug elektrode en de referentie-elektrode in elektrisch contact door het uitvoeren van stap 2.5.3.</li>
		<li>Als er geen elektrische contact is, Controleer de volgende punten:<ol>
<li>Controleer of de elektrode zoutbrug in contact met de bufferoplossing is. Als dat niet het geval is, dan Verhoog het volume van de buffer in de tip of een langere microcapillary tip voor te bereiden.</li>
			<li>Als er een luchtbel, verwijderen van de tip van de micro-zout brug elektrode, vullen de buffer in de tip, en steek de stekker in de elektrode opnieuw.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. meting van de elektrische Parameters van het membraan gereconstitueerd met Recombinant eiwit
<ol><li>Toepassing van een driehoekige afwisselend spanning signaal met maximale spanning Umax = 50 mV en ΔToprit = 50 ms, waardoor een rechthoekige wisselstroom-reactie. Bereken uit de gemiddelde waarden van de positieve en negatieve stromingen (I+ en ik-), de capaciteit van het membraan volgens de volgende formule: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq1v2.jpg">
</li>
	<li>Toepassing van een spanning helling variërend van -50 mV tot + 50 mV en de huidige record. Past een lineaire functie met de gegevens - de helling is de geleidbaarheid - en bereken het snijpunt van de x-as van de pasvorm.</li>
	<li>De oplossing in het kunststof uiteinde te ontladen en vullen van een nieuwe transactie met een buffer met een verhoogde substraat concentratie.<ol>
<li>Als geen membraan wordt gevormd binnen de eerste 20-30-s, het volume te ontladen en vullen het. Dit garandeert dat het verloop van de concentratie over het membraan aanzienlijk niet tijdens de vorming van het membraan verandert.</li>
		<li>Na de vorming van een membraan, voert u stap 3.1 en 3.2 opnieuw om te controleren of de vorming van de juiste membraan en om het snijpunt van de x-as.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. berekening van het percentage van de omzet substraat
Opmerking: Zie vorige werk voor details3,7.
<ol><li>Schatting van de hoeveelheid eiwitten in het membraan van de moleculaire massa van lipide en eiwit (Mlipide en M-eiwit), het gebied van het membraan en een lipide hoofd groep (eenmembraan en eenlipide) en de massaverhouding van het eiwit per lipide (r). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq2v2.jpg">
</li>
	<li>Bereken de potentiële voor de vervoerde substraat Nernst. R is de gasconstante, T de temperatuur, z de lading van het vervoerde substraat, F van de Faraday constant, en c1 en c2 de concentraties van het substraat van beide zijden van de membraan. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq3v3.jpg">
</li>
	<li>Uit de stroom-spanning-opnamen, nemen de omgekeerde potentiële berekend met het verschil tussen de snijpunten van de x-as van de lineaire past in de aanwezigheid en de afwezigheid van het verloop van het substraat.</li>
	<li>Bereken het percentage van substraat geleidingsvermogen, Gsubstraat, tot de totale membraan geleidingsvermogen, Gtotale, door de verhouding van omgekeerde potentieel Nernst potentiële11. <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq4v2.jpg">
</li>
	<li>Berekenen van het substraat omzet nummer ΔNsubstraat per tijd eenheid ΔT van het substraat geleidbaarheid (Gsubstraat), de toegepaste spanning U en de lading van het substraat-z: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq5v2.jpg">
</li>
	<li>Bereken uit de verhouding van vervoerde substraat per keer aan het aantal eiwitten, de omzet tarief κ. <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq6v2.jpg">
</li>
</ol>

<ol><li>Terstappen, G. C., Reggiani, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11165668">In silico research in drug discovery.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).</li>
<li>Raynauld, J. P., Laviolette, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+silver-silver+chloride+electrode%3A+A+possible+generator+of+offset+voltages+and+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The silver-silver chloride electrode: A possible generator of offset voltages and currents.</a> Journal of Neuroscience Methods. 19 (3), 249-255 (1987).</li>
<li>Urbankova, E., Voltchenko, A., Pohl, P., Jezek, P., Pohl, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+kinetics+of+uncoupling+proteins.+Analysis+of+UCP1+reconstituted+in+planar+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transport kinetics of uncoupling proteins. Analysis of UCP1 reconstituted in planar lipid bilayers.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (35), 32497-32500 (2003).</li>
<li>Beck, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyunsaturated+fatty+acids+activate+human+uncoupling+proteins+1+and+2+in+planar+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Polyunsaturated fatty acids activate human uncoupling proteins 1 and 2 in planar lipid bilayers.</a> The FASEB Journal. 21 (4), 1137-1144 (2007).</li>
<li>Shao, X. M., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-agar+salt+bridge+in+patch-clamp+electrode+holder+stabilizes+electrode+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials.</a> Journal of Neuroscience Methods. 159 (1), 108-115 (2007).</li>
<li>Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+intrapipette+salt+bridge%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple intrapipette salt bridge.</a> Journal of Neuroscience Methods. 46 (1), 11-16 (1993).</li>
<li>Beck, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+automated+technique+for+the+reconstitution+of+hydrophobic+proteins+into+planar+bilayer+membranes.+Studies+of+human+recombinant+uncoupling+protein+1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta-Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">A new automated technique for the reconstitution of hydrophobic proteins into planar bilayer membranes. Studies of human recombinant uncoupling protein 1.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1757 (5-6), 474-479 (2006).</li>
<li>Macher, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mitochondrial+UCP1+and+UCP3+by+purine+nucleotides+and+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mitochondrial UCP1 and UCP3 by purine nucleotides and phosphate.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (3), 664-672 (2018).</li>
<li>Rupprecht, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+transmembrane+potential+in+the+membrane+proton+leak%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Role of the transmembrane potential in the membrane proton leak.</a> Biophysical Journal. 98 (8), 1503-1511 (2010).</li>
<li>Hilse, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+UCP3+directly+correlates+to+UCP1+abundance+in+brown+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The expression of UCP3 directly correlates to UCP1 abundance in brown adipose tissue.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (1), 72-78 (2016).</li>
<li>Fuks, B., Homble, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+and+electrical+properties+of+planar+lipid+membranes+from+thylakoid+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids.</a> Biophysical Journal. 66 (5), 1404-1414 (1994).</li>
<li>Barry, P. H., Lewis, T. M., Moorhouse, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimised+3+M+KCl+salt-bridge+technique+used+to+measure+and+validate+theoretical+liquid+junction+potential+values+in+patch-clamping+and+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">An optimised 3 M KCl salt-bridge technique used to measure and validate theoretical liquid junction potential values in patch-clamping and electrophysiology.</a> European Biophysics Journal. 42 (8), 631-646 (2013).</li>
<li>Huang, D., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+feasibility+and+limitation+of+patch-clamp+recordings+from+neonatal+rat+cardiac+ventricular+slices%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The feasibility and limitation of patch-clamp recordings from neonatal rat cardiac ventricular slices.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. 47 (4), 269-272 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De uitvoering van de micro-agar Zoutbrug met de elektrode minimaliseert de potentiële verspreiding en kunt meer nauwkeurige metingen van de membraanpotentiaal gegenereerd door een pH verloop. In aanwezigheid van verschillende transmembraan pH verlopen, de mogelijke verschuiving van beide elektroden was aanvaardbaar op ΔpH = 0,35 wanneer het vergelijken bij de theoretische waarde van het potentiële Nernst-evenwicht (ΦNernst 23,8 = mV voor ΔpH = 0,4). Echter bij meer fysiologische pH verlopen, als voor aanleg in mitochondriën tussen de matrix en intermembrane ruimte, de standaard AgCl-elektrode niet precies meten de mogelijke verschuiving op ΔpH = 1 (Figuur 3A). De elektrode overbrugd met micro-agar zout geleverd de waarden die veel meer vergelijkbaar met de theorie waren.
Potentiële verspreiding kan ook optreden bij de AgCl-elektrode als bufferoplossing wordt gewijzigd tijdens het experiment. Chloride-vrije bufferoplossing werd gebruikt in de experimenten omdat ontkoppelingseiwit eiwitten werden voorgesteld voor het vervoer van chloride-ionen en de pH werd aangepast met behulp van Tris of MES. De elektrode potentiële, bij gebrek aan een aanzienlijke concentratie chloride, is voornamelijk afhankelijk van chloride onzuiverheden in de bufferoplossing. Als de samenstelling ongewijzigd tijdens de experimenten is, zal het simpelweg resulteren in een constante offset potentieel. Voor de meting van een absolute mogelijke verschil tussen de twee elektroden, kan een eenvoudige agar zout-brug systeem (Ag/AgCl 3 M KCl) echter ook worden gebruikt voor de referentie-elektrode.
Een micro-agar zoutbrug balanceert de potentiële verspreiding door een evenwichtsinstelling van de potentiële elektrode. Om te stabiliseren de zoutoplossing, is 1% (m/v) agarose toegevoegd om te voorkomen dat het mengen van het zout oplossing met de bufferoplossing. Het zout ionen K+ en Cl- hebben soortgelijke mobiliteiten in vloeistof en evenwicht van de potentiële elektrode. Als u wilt goed installeren de zoutbrug, moet de agar zoutoplossing worden voldoende opgewarmd te vullen de microcapillary tip zonder alle luchtbellen en ter dekking van de AgCl-elektrode. Voor verder gebruik moet elektrisch contact tussen de zoutbrug elektrode en de referentie-elektrode worden gecontroleerd. Afhankelijk van de tijd die de zoutbrug wordt gebruikt, moet de zoutoplossing worden voldoende gegeleerde om een vermenging van de zoutoplossing met de buffer te voorkomen. Dit is vooral essentieel als K+ of Cl- transporteurs worden onderzocht. De zoutbrug werd gebruikt voor een zeer korte tijd en de elutie van agarose is te verwaarlozen in deze periode. Een hogere concentratie van agarose van maximaal 5%, of agar (3% - 5%), kan met behulp van de zoutbrug voor een langere periode van tijd6,12.
Met deze methode kunt bepalen van de kinetiek van het vervoer van een membraan transportwagen (i) met lage omzet tarieven en (ii) van mitochondriale proteïnen van de binnenste membraan, dat nauwelijks in standaard patch klem set-ups13kunnen worden onderzocht. De precisie is voornamelijk afhankelijk van de omgekeerde potentiële meting, welke nauwkeurigheid bij een lage totale membraan geleidingsvermogen en kleine concentratie kleurovergangen die ertoe een membraanpotentiaal onder het geluid van de opname bewegen is afgenomen.
Met deze set-up, werden de tarieven van de omzet van UCP1 en UCP3 zoals geproduceerd onder dezelfde voorwaarden gemeten. Als gevolg van de hogere pH verloop, de verkregen tarieven lijken te zijn meer precieze en onverstoorbaar door artefacten als gevolg van de kleine elektrode potentiële verschuiving. Het kan worden gebruikt om verder te analyseren en vergelijken van de mitochondriale membraan vervoerders geproduceerd onder vergelijkbare omstandigheden.

Membraaneiwitten zijn doelwit van maximaal 60% van alle bekende farmaceutische geneesmiddelen1. Elektrofysiologische metingen van membraaneiwitten zijn een krachtige maar gevoelige instrument om het analyseren van het electrogenic vervoer van substraten gemedieerd door vervoerder membraaneiwitten. De modulatie van de transmembrane stroom door de toepassing van constante spanningen of spanning hellingen kunt beoordelen van de farmacologische en fysische eigenschappen van de vervoerders, bijvoorbeeld, de activering en de remming door substraten of het vervoer kinetiek. Van bijzonder belang is het substraat omzet nummer, waarin de hoeveelheid substraat dat is translocated door een membraan eiwit per tijdseenheid. Het is een belangrijke parameter bij het vergelijken van de kinetiek van de verschillende membraaneiwitten. Tot oprichting van een gradiënt van de concentratie van het geladen substraat over het membraan genereert een elektromotorische kracht waaruit het nummer van de omzet van het substraat wordt afgeleid.
Met behulp van een AgCl-elektrode, creëert de aanwezigheid van een buffer chloride-vrije een diffusie-potentieel dat verandert elektrode potentiële en leidt tot een verschuiving van stroom-spanning-metingen2. Hoewel altijd aanwezig is, is het te verwaarlozen voor standaard geleidingsvermogen en capaciteit metingen omdat deze parameters zijn afhankelijk van de helling van de stroom-spanning-opname (geleidbaarheid) of zijn het verschil van een enkele opname (capaciteit), die Hiermee annuleert u het potentieel. Echter, de opname van het omgekeerde potentieel, dat door het vervoer van substraat is gemaakt, kan aanzienlijk worden verstoord door de potentiële verspreiding. Dus, voor nauwkeurige metingen van het omgekeerde potentieel, het potentieel van de elektrode moeten constant worden gehouden.
De potentiële verspreiding kan worden geminimaliseerd door twee methoden: (i) in aanwezigheid van een dubbelgelaagde membraan, een substraat-concentratie moet worden verhoogd aan de ene kant van het membraan3,4, of (ii) een zoutbrug balanceert de elektrode potentiële 5. de eerste methode is sterk afhankelijk van de stabiliteit van de metingen. Het membraan heeft om te overleven voor enkele minuten, uit de toevoeging van substraat onder roeren totdat het substraat is bijna gelijk verdeeld over de oplossing. Als het membraan tussendoor breuken, het verloop van het substraat wordt gewijzigd door de vrije uitwisseling van geladen moleculen, en metingen schakelt onjuist. De laatste methode saldi van de potentiële verspreiding maar wordt beperkt door de grootte van de set-up. Uitvoering van een klein maar werking zoutbrug in een micro bereik tot een elektrofysiologische set-up is uitdagend6. Voor de laatste methode, is het zout oplossing in een microcapillary tip afgevuld en gestabiliseerd door de toevoeging van agarose ter voorkoming van verspreiding van het zout oplossing aan de bufferoplossing.
In dit protocol, wordt een eenvoudige productie van een micro-agar zoutbrug en uitvoering in een elektrofysiologische set-up op basis van de pipet set-up7 beschreven. Een tip van microcapillary wordt aangepast naar een 3 M KCl oplossing met 1 mol % (m/v) agarose bevatten zowel te overbruggen een AgCl-elektrode en buffer-oplossing. Het voordeel van de brug van de micro-zout wordt weergegeven door tijd-opnamen van de potentiële verschuiving van de elektrode en de exacte afmetingen van de membraanpotentiaal op verschillende pH verlopen. In het modelsysteem van recombinante eiwitten gereconstitueerd in liposomen, zijn de tarieven van de omzet van mitochondriale vervoerders, UCP1 en UCP3 geproduceerd onder soortgelijke voorwaarden onderworpen en in vergelijking met vorige resultaten3,8.

<table><tbody><tr><td>Microloader tips</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td>Microcapillary pipette tip</td></tr><tr><td>Ethanol 99%</td><td>AustrAlco &Ouml;sterr. Agrar-Alkohol Handelsges.m.b.H</td><td>AAAH-5020-07025-230317</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td><td>6781.3</td><td></td></tr><tr><td>DC supply</td><td>Voltcraft</td><td>V10/CPG 1940 -01</td><td></td></tr><tr><td>Agarose Standard</td><td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td><td>3810.2</td><td></td></tr><tr><td>Patch Clamp Amplifier</td><td>Heka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sample tube</td><td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td><td>5863.1</td><td></td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td><td>8560.3</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td><td>4256.2</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td><td>AE15.2</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td><td>3054.1</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296090-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Hexadecane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296317-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Heating wire</td><td>Voltcraft</td><td>USPS-2250</td><td></td></tr></tbody></table>

een micro-agar zout bridge-elektrode voor het analyseren van de proton verwerkingsfrequentie van recombinante membraaneiwitten

A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins

Tot op heden richten meer dan 50% van alle farmacologische drugs de vervoer-kinetiek van membraaneiwitten. Het elektrofysiologische karakterisering van membraaneiwitten vervoerder gereconstitueerd in lipide dubbelgelaagde membranen is een krachtige maar gevoelige methode voor de beoordeling van de fysisch-chemische en farmacologische eigenschappen. Het substraat omzet nummer is een unieke parameter waarmee de vergelijking van de activiteit van verschillende membraaneiwitten. In een electrogenic-vervoer creëert het verloop van het translocated substraat een membraanpotentiaal die direct met de Verwerkingsfrequentie van substraat van het eiwit correleert. Met behulp van zilverchloride elektroden, wordt een diffusie potentieel, een afkorting voor vloeibare kruising potentieel, veroorzaakt, die verandert elektrode potentieel en aanzienlijk verstoort precieze membraan potentiële metingen. Mogelijke verspreiding kan worden geminimaliseerd door een zoutbrug, die elektrode potentieel balanceert. In dit artikel wordt is een zoutbrug micro-agar ontworpen ter verbetering van het elektrofysiologische set-up, die gebruik maakt van micropipetten voor de vorming van het membraan. Het zout oplossing wordt in een microcapillary Pipetteer tip, gestabiliseerd door de toevoeging van agarose, afgevuld en kan eenvoudig worden gemonteerd op een standaard-elektrode. Het potentieel van de elektrode van een micro-zout brug elektrode is stabieler in vergelijking met een standaard-elektrode. De implementatie van dit systeem elektrode potentiële stabiliseert en laat meer nauwkeurige metingen van de membraanpotentiaal gegenereerd door een pH verloop. Met behulp van dit systeem, zijn de proton omzet tarieven van de mitochondriale vervoerders, UCP1 en UCP3 onderworpen en in vergelijking met eerdere metingen.

Om te controleren of de minimalisering van de potentiële verspreiding, werd de stabiliteit van de stroom-spanning-metingen van een intact membraan gemeten. In Figuur 2,zijn vertegenwoordiger-stroom-spanning-opnamen afgebeeld in (witte puntjes) als zonder (zwarte puntjes) van een pH verloop. Volgens de vergelijking van Nernst induceert de pH verloop een verschuiving van spanning. Uit de x-as snijpunt van een lineaire aanpassen aan de gegevens, wordt de mogelijke verschuiving berekend. Om te testen beide elektroden, was de verschuiving in het snijpunt van de x-as geanalyseerd voor een standaard AgCl-elektrode (Figuur 2B; witte stippen) en een zoutbrug micro-agar (Figuur 2B; zwarte stippen). Een spanning helling tien keer werd opgenomen in een rij en de gemiddelde verschuiving in de x-as wordt afgebeeld tegen de klok. Overwegende dat de agar zoutbrug elektrode had een maximale verschuiving van minder dan 5 mV zelfs na 300 seconden van de meting, de standaard elektrode gevarieerd maximaal 30 mV in onvoorspelbare, random, gedrag.
Vervolgens werden beide elektroden getest op verschillende pH verlopen (Figuur 3A). Voor de standaard-elektrode, is een pH verloop van 0.35 en 1.0 (witte puntjes) gegenereerd; voor de agar zoutbrug elektrode, pH gradiënten van 0.35, 0.7 en 1.0 (zwarte puntjes). De verschuiving van potentieel werd geanalyseerd in drie onafhankelijke metingen. In tegenstelling tot een helling van 0.35, waar de gemeten verschuiving alleen enigszins verschilt, wijzigt de spanning verschuiving aanzienlijk op het verloop van de pH voor 1.0 in de afwezigheid van de micro-agar zoutbrug. Van een lineaire aanpassen aan de gegevens is de helling van de functie 26,4 ± 2,3 mV/ΔpH voor de standaard elektrode en 50.1 ± 4.6 mV/ΔpH voor de elektrode micro-agar zoutbrug. Volgens de Nernst-vergelijking, is de berekende potentiële verschuiving 60.7 mV/ΔpH op T = 32 ° C.
Met behulp van de micro-agar zoutbrug, het proton omzet nummer, werd κ, van mitochondriale UCP1 en UCP3 gemeten en vergeleken met eerdere metingen (Figuur 3B). Vergelijkbaar met Figuur 3A, ΔpH = 1.0 werd gegenereerd en het omgekeerde potentieel werd gemeten. De hoeveelheid eiwitten in het membraan was geraamd volgens de formule bedoeld in deel 4 van het protocol, met een eiwit lipide/ratio van 4 µg / (mg van lipide), een molecuulmassa van 33.000 en 750 Da voor de eiwitten en lipiden, de oppervlakte van een membraan van 3.53 x 10 -4 cm2inwoners en een oppervlakte per lipide van 7,8 x 10-15 cm2. De verkregen κwas 5,56 ± 0.38 s-1 en 4,10 ± 0.71 s-1 voor UCP1 en UCP3, respectievelijk (Figuur 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58552/58552fig1.jpg"> Figuur 1 : Het elektrofysiologische set-up met de micro-agar zoutbrug. (A) dit paneel toont een schets van de set-up. Het uiteinde van de microcapillary met de agar-zoutoplossing (afgebeeld in oranje) wordt geplaatst tussen de elektrode (zwart) en de buffer-bevattende tip (blauw). Het membraan is gevormd aan de oppervlakte aan het einde van de buffer-bevattende tip (aangegeven door de pijl). (B) dit deelvenster bevat een afbeelding van het elektrofysiologische set-up met de uitvoering van de micro-agar zoutbrug. De pijlen wijzen naar de elektrode, de micro-agar zoutbrug, de referentie-elektrode en de container met bufferoplossing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58552/58552fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58552/58552fig2.jpg"> Figuur 2 : De vergelijking van een zoutbrug micro-agar en een standaard AgCl-elektrode. (A) dit paneel toont een representatieve stroom-spanning meten in de aanwezigheid (grijze stippen) en gebrek aan (witte stippen) de gradiënt van een pH van 1. De lijnen geven een lineaire pasvorm aan de gegevens, welke geleidbaarheid en de x-as snijpunt waarden zijn verkregen. De verschuiving van spanning wordt geëvalueerd door het verschil tussen de waarden van het snijpunt van beide opnames. (B) dit paneel toont de verschuiving van de membraan potentieel van een standaard AgCl-elektrode (witte puntjes) tot een micro-agar zoutbrug elektrode (zwarte puntjes) in tijd. Tien stroom-spanning-metingen werden opgenomen in een rij en de verschuiving van de gemiddelde spanning door diffusie potentiële wordt uitgezet tegen de tijd. In alle experimenten, is het membraan gemaakt van 45:45:10 mol % DOPC:DOPE:CL gereconstitueerd met 15 mol % arachidonzuur bij een concentratie van 1,5 mg/mL. De buffer bevat 50 mM nb2SO4, 10 mM MES, 10 mM TRIS en 0,6 mM EGTA bij pH = 7.34 en T = 32 ° C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58552/58552fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58552/58552fig3.jpg"> Figuur 3 : Proton omzet aantal UCP1 en UCP3 berekend op basis van het omgekeerde potentieel in de aanwezigheid van een pH verloop. (A) dit paneel toont de verschuiving in potentieel van een UCP1-bevattende membraan van verschillende pH gradiënten van een standaard AgCl-elektrode (witte stippen) en een zoutbrug micro-agar-elektrode (zwarte puntjes). De lijnen geven een lineaire pasvorm aan de gegevens. (B) dit paneel toont het proton omzet aantal UCP1 (eerste gegevensset) en UCP3 (tweede gegevensverzameling) zo berekend op basis van de verhouding van spanning verschuiving Nernst potentieel berekend volgens de formules in punt 4 van het protocol. De eerste balk van elke set geeft omzet tarieven gemeten met de micro-agar zoutbrug. De tweede staaf van elke gegevensset vertegenwoordigt eerdere metingen met behulp van een standaard AgCl-elektrode. Waarden voor UCP1 en UCP3 werden gehaald uit Urbankovaet al. 3 en Macher et al. 8. in alle maten, het membraan is gemaakt van 45:45:10 mol % DOPC:DOPE:CL gereconstitueerd met 15 mol % AA en UCP1/UCP3. De concentratie van lipiden en eiwitten was 1,5 mg/mL en 4 µg/mg van lipide, respectievelijk. De buffer bevat 50 mM nb2SO4, 10 mM MES, 10 mM TRIS en 0,6 mM EGTA bij pH = 7.34 en T = 32 ° C. De pH van de buffer voor de kleurovergang metingen werd verhoogd tot 7.66, 8,00 of 8.33 door toevoeging van TRIS en werd veranderd in de oplossing-bevattende pipet. De waarden zijn de gemiddelde ± standaardafwijking van drie onafhankelijke metingen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58552/58552fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

In elektrofysiologische metingen stoort de aanwezigheid van een potentiële verspreiding de nauwkeurige meting van het omgekeerde potentieel door een wijziging van de potentiële elektrode. Met behulp van een micro-agar zoutbrug, is de impact van de potentiële verspreiding geminimaliseerd, waardoor een nauwkeuriger meting van substraat omzet aantallen gereconstitueerde recombinante membraaneiwitten.

Een Micro-agar zout Bridge-elektrode voor het analyseren van de Proton Verwerkingsfrequentie van recombinante membraaneiwitten

To date, more than 50% of all pharmacological drugs target the transport kinetics of membrane proteins. The electrophysiological characterization of ...

Deze methode kan helpen bij het onderzoek van membraaneiwitten zoals transporters en kanalen. De informatie over substraatomzetverlies dat eiwitactiviteit en specificiteit vergelijkt met de verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het minimaliseert potentiële verschuiving variatie en chloride vrije buffer voorwaarden.En verhoogt de nauwkeurigheid van de bepaling van de omloopsnelheid aanzienlijk als gevolg van nauwkeurigere membraanpotentieelmetingen. Verzamel de elementen voor de vuiststappen. Deze omvatten twee micro-capillaire pipet tips, een scherp mes en een schuifklauw.Voor de elektrode hebben zilverdraad, zand papier en een drie molaire kaliumchloride oplossing bij de hand. Daarnaast hebben ethanol en water voor reiniging en een DC voeding. Ga verder door te werken met de twee micro-pipet tips.Begin met de tip die de buffer zal bevatten. Plaats de tweede tip naast de eerste. Verplaats de tweede tip, dus, wanneer ingevoegd het smalle deel zal uitbreiden ten minste vijf millimeter in het smalle deel van de eerste.Markeer de positie waar de eerste buffer met tip zal worden bevestigd. Gebruik vervolgens de remklauw om de lengte van de micro-agar zoutbrugelektrode te meten. Gebruik het mes om de punt op de juiste lengte te snijden.Reinig het snijoppervlak met ethanol, gevolgd door water. Vervolgens krijgt u een lengte van ongeveer acht centimeter zilverdraad voor de elektrode. Reinig de draad op doekjes met ethanol, gevolgd door water.Gebruik na het reinigen zandpapier om het oppervlak aan één centimeter lengte aan één uiteinde glad te maken. Deze draad met zijn gladgestreken uiteinde is klaar om elektrochemisch gecoat te worden. Plaats het gladgemaakte uiteinde in de kaliumchlorideoplossing met het andere uiteinde aangesloten op een DC-voeding voor coating.Wanneer gecoate, los de elektrode en schoon te maken met water. Na het drogen, bepaal de lengte die het mogelijk maakt om de micro capillaire tip zo diep mogelijk te penetreren. Snijd de elektrode van de ongecoate kant tot de juiste lengte.Ga nu verder met het bereiden van een zoutoplossing met agarose. In een kolf met water oplossen kaliumchloride en gebruik een magnetische roerder om te helpen mengen. Voeg na het verwijderen van de roerder agarose toe aan de kolf.Neem de fles naar een magnetron en verwarm het om de agarose smelten op ongeveer 100 graden Celsius. Neem het uit om visueel te controleren of de agarose volledig is opgelost. Zodra de agarose is opgelost pipet 10 microliters in de micro-capillaire langzaam om luchtbellen te voorkomen.Het is belangrijk om de agar zoutoplossing zorgvuldig in de micro capillaire punt te pipetten, vooral bij hoge agarconcentraties. Als niet goed gedaan luchtbellen zijn gemakkelijk geproduceerd in de tip en blokkeren elektrische stroom. Na het verwijderen van de tip van de pipet duw de elektrode in.Zorg ervoor dat de elektrode de zoutoplossing binnendringt. Wanneer de elektrode zich bij kamertemperatuur aansluit, wordt deze aangesloten op een referentieelektrode in een versterker. Steun de referentie-elektrode, zodat het kan worden verlaagd in een plastic container met een milliliter buffer.Vervolgens dompel de zoutbrugelektrode in de oplossing. Breng een spanning aan en controleer of er een huidige reactie is voordat u verdergaat. Als de test succesvol is, koppelt u de elektroden los.Bewaar indien nodig de zoutbrugelektrode door deze onder te dompelen in een driekiesterige kaliumchlorideoplossing. Bereid vervolgens de buffer met plastic punt. Neem een micro capillaire tip en identificeer een punt twee centimeter van het smalle deel.Gebruik een verwarmingsdraad om de buis 90 graden te buigen op deze positie. Met een scherp mes snijd de buis vijf millimeter van de gebogen. Reinig het gebied dat werd gesneden met ethanol, gevolgd door water.Gebruik voordat u verdergaat een lichtmicroscoop met een weegschaal om de diameter van het gat aan de punt te meten. Verplaats vervolgens de pipet om in de buurt van een container van oplosmiddel en een andere van buffer. Pipette drie microliters van het oplosmiddel in en uit de tip.Vul vervolgens de meettip met drie microliters buffer. Haal nu de zoutbrug uit de kaliumchlorideoplossing. Sluit de meettip met de buffer aan op de zoutbrugelektrode.Sluit de zoutbrugelektrode en de referentieelektrode aan op een versterker. Hang op dit punt de zoutbrugelektrode in de bufferoplossing op met de referentieelektrode. Een weergave van de configuratie voor het experiment bevindt zich in dit schema.Tijdens het experiment vormt het membraan zich aan het einde van de buffer met pipet. Verzamel gegevens om de membraancapaciteit te vinden. Doe dit door een driehoekig wisselspanningssignaal toe te passen om een rechthoekige wisselstroomrespons te creëren.Zoek vervolgens de geleiding en spanning op nul stroom. Automatiseer de toepassing van een spanningshelling variërend van min 50 tot 50 millivolt en neem de stroom vast. Pas een lineaire functie aan op de gegevens.De helling is de geleiding, de x-intercept is de spanning op nul stroom. Verwijder bij gebruik de meettip van de zoutbrug. Vul een nieuwe meettip met buffer, pas deze aan op verschillende pH-waarde om een protongradiënt over het membraan in te stellen.Stel de experimentele opstelling opnieuw in met de nieuwe meetpunt en elektroden om de metingen te herhalen. Hier zijn representatieve stroomspanningsopnamen in aanwezigheid van een pH-verloop. En, bij afwezigheid van een pH-gradiënt.De lijnen vertegenwoordigen een lineaire pasvorm aan de gegevens. De verschuiving in het x-assige snijpunt voor de verschillende pH-waarden wordt voorspeld door de Nernst-vergelijking. Deze gegevens vertegenwoordigen de verschuiving in het membraanpotentieel in de tijd voor een standaard zilverchlorideelektrode in wit, en de micro-agar zoutbrugelektrode in zwart.De agar zoutbrug elektrode was stabieler met een maximale verschuiving van minder dan vijf millivolt over 300 seconden van de meting. In dit plot van de potentiële verschuiving als functie van pH gradiënt worden de twee elektroden gezien om zich aanzienlijk verschillend te gedragen als de pH-gradiënt toeneemt. De protonomzet is te vinden en te vergelijken voor de twee elektrodetypes.Hier zijn protonomzetaantallen die voor mitochondriale ontkoppelingseiwit worden bepaald UCP1 die door de zoute brugelektrode wordt gemeten in vergelijking met een standaardelektrode. Er zijn ook gegevens voor het eveneens voorbereide UCP3. De tarieven lijken nauwkeuriger met de agar zout brug elektrode.Tijdens een poging tot deze procedure is het belangrijk om te onthouden om ervoor te zorgen dat de elektrode doordringt de agar zout oplossing. De zoutbrug moet ook in de bufferoplossing duiken. Zorg er ten slotte voor dat de agar zoutoplossing geen luchtbellen bevat.

a-micro-agar-salt-bridge-electrode-for-analyzing-proton-turnover-rate

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Gereglementeerde endocytose regelt de cel oppervlakte-expressie niveaus van de meerderheid van de membraaneiwitten. Hier maken wij gebruik van herleidbaar, membraan impermeant biotinylatie reagentia aan de endocytische koers van de dopamine transporter (DAT), een membraaneiwit polytopic te meten. De methode maakt een directe benadering van het meten van de endocytische snelheid van de meeste plasma-membraan eiwitten.

Het meten van plasma membraaneiwit endocytische de tarieven door Omkeerbare biotinylatie

Hier presenteren we een elektrofysiologische methode gebaseerd op vaste drager membranen met de nadruk op de toepassing daarvan voor de karakterisering van elektrogene membraan transporters.

Inleiding tot de vaste Ondersteunde Membrane Gebaseerd Electrofysiologie

We presenteren een protocol voor het in vitro onderzoek van effluxpompen van Pseudomonas aeruginosa. Dit protocol maakt het genereren van een sterke, reversibele en afstembare proton gradiënt in het liposoom membraan en dus moet aanpasbaar aan elke membraaneiwit bekrachtigd door protomotive kracht.

In vitro onderzoek naar de MexAB Efflux Pomp Van Pseudomonas aeruginosa

Met behulp van eiwit microarrays met bijna het hele S. cerevisiae proteoom wordt gesondeerd voor snelle onpartijdige ondervraging van duizenden proteïne-proteïne interacties in parallel. Deze werkwijze kan worden gebruikt voor eiwit-kleine molecule, posttranslationele modificatie, en andere assays high-throughput.

Probing hoge dichtheid functioneel eiwit Microarrays om eiwit-eiwit interacties Detect

Surface Plasmon Resonance (SPR) is een label vrij werkwijze voor het detecteren van biomoleculaire interacties in real time. Hierin, een protocol voor een membraaneiwit: wordt receptor interactie experiment beschreven, terwijl de discussie over de voors en tegens van de techniek.

Real Time Metingen van membraaneiwit: Receptor Interacties gebruik Surface Plasmon Resonance (SPR)

Het eerste deel van dit artikel laat zien hoe mutante cellijnen te selecteren zijn die vesiculaire Na+/H+ uitwisselaars in hun plasmamembraan tot expressie brengen. Het tweede deel biedt protocollen gebaseerd op intracellulaire pH-metingen en snelle ionopname, die worden gebruikt om de ionselectiviteit en de kinetische parameters van deze uitwisselaars te bepalen.

Functionele karakterisatie van Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Warmtewisselaars van intracellulaire compartimenten met Proton-doden Selectie om ze te uiten op het plasmamembraan

Het gepresenteerde protocol beschrijft de analyse van membraaneiwitgemedieerde transport op het niveau van enkelvoudige transporteurs met behulp van porie-overspande, oplosmiddelvrije lipide dubbellagen. Dit wordt bereikt door de creatie van in grote aantallen geproduceerde nanopore-arraychips, gecombineerd met zeer parallelle dataverwerving en analyse, waardoor de toekomstige vestiging van membraaneiwiteffectorscreenings mogelijk wordt.

Membraan transportprocessen geanalyseerd door een Highly Parallel Nanopore Chip System aan Single Protein Resolution

Dit protocol beschrijft een snelle en gevoelige kwantificatie van Förster resonantie energieoverdracht (FRET) sensorgegevens met een maat draagbare FRET analyzer. De inrichting werd gebruikt voor maltose binnen een kritisch temperatuurtraject dat detectiegevoeligheid maximaliseert, zodat praktische en efficiënte evaluatie van het suikergehalte detecteren.

Uiterst gevoelige en Rapid fluorescentiedetectie met een Portable FRET Analyzer

Dit manuscript beschrijft de toepassingen van proton-Ionselectieve electroden en patch klemmen van methoden voor het meten van de activiteit van proton vervoerssystemen. Deze methoden zijn sommige beperkingen van technieken gebruikt bij het bestuderen van proton vervoersactiviteit, zoals matige gevoeligheid, resolutie van de tijd en onvoldoende intracellulaire milieu controle.

Toepassing van electrofysiologie meting op het bestuderen van de activiteit van Electro-neutrale Transporters

Hier presenteren we een protocol om te bestuderen van het moleculaire mechanisme van proton translocatie in verschillende lipide membranen van één liposomen, met behulp van cytochroom bo3  als voorbeeld. Het combineren van de elektrochemie en fluorescentie microscopie, pH-veranderingen in het lumen van enkele blaasjes, bevattende één of meerdere enzym, kan worden gedetecteerd en individueel geanalyseerd.

Enkele liposoom metingen voor de studie van Proton-pompende membraan enzymen met behulp van de elektrochemie en Fluorescent microscopie

Dit protocol presenteert een methode voor het meten van adenine nucleotide binding aan receptoren in real time in een cellulaire omgeving. Binding wordt gemeten als Förster resonantie energieoverdracht (FRET) tussen trinitrofenylnucleotidederivaten en eiwit gelabeld met een niet-canoniek, fluorescerend aminozuur.

Het meten van nucleotidebinding aan intacte, functionele membraaneiwitten in realtime

Leer een micro-agar zoutbrug-elektrode maken voor nauwkeurige elektrofysiologische metingen van recombinante membraaneiwitten. Deze methode minimaliseert potentiaalverschuivingen en verbetert de precisie van substraatturnoverbepalingen.

Een Micro-agar zout Bridge-elektrode voor het analyseren van de Proton Verwerkingsfrequentie van recombinante membraaneiwitten

Meer video's verkennen