In Vitro Methode voor controle concentraties van gehalogeneerde gassen in gekweekte alveolaire epitheliale cellen
23 oktober 2018
Beschrijven we een eenvoudig protocol speciaal ontworpen voor het bereiken van nauwkeurige en gecontroleerde concentraties van Sevofluraan of Isofluraan in vitro ter verbetering van ons begrip van de mechanismen die betrokken zijn bij de epitheliale long letsel en voor het testen van de roman therapieën voor acute respiratory distress syndrome.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van de belangrijkste vraag op het gebied van longletsel en reparatie, zoals het testen van gehalogeneerde aanvulling als potentiële nieuwe therapieën voor acute respiratoire noodsyndroom. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het afhankelijk is van een zeer eenvoudige methode om de cellen te kweken en bloot te stellen aan gehalogeneerde stoffen om nauwkeurige en gecontroleerde concentraties te bereiken. Gebruik voor de bouw van de luchtdichte kamer een hermetische polypropyleendoos met een inhoud van 6,5 liter.
Boor een gat met een diameter van 2,5 centimeter aan de onderkant van de zijwand van de doos. Steek vervolgens een golfplaten buis met een groene markering die zal dienen als het gas lucht mengsel input pijp. En verzegel het met siliconen.
Boor vervolgens een tweede gat met een diameter van 2,5 centimeter aan de bovenzijde van de tegenoverliggende zijwand. Steek een andere golfplaten buis met een rode markering en sluit deze met een houtskoolfilter die zal dienen als de gaslucht mengsel output pijp. Sluit het dan af met siliconen.
Boor vervolgens een strak gat met een diameter van vier millimeter in het midden van de muur. Plaats de korte infuusbuizen die op een spruitstuk zijn verbonden met een roterend mannelijk lokslot. Sluit het aan op een gasanalyzer en sluit het af met siliconen.
Plaats vervolgens een digitale thermometer in de luchtdichte kamer. Onder een laboratorium afzuigkap, aanpassen van een verdovingsmachine circuit om de lachgas gasleiding te schakelen door kooldioxide. Steek een verwarmde bevochtiger in de pijp tussen de verdovingsmachine en de luchtdichte kamer om het gasstroommengsel op te warmen tot ongeveer 37 graden Celsius.
Sluit de luchtdichte kamer met de groene gemarkeerde golfkarton aan op het aangepaste verdovingsmachinecircuit. Plaats vervolgens de luchtdichte kamer op een hete plaat ingesteld op 37 graden Celsius. Plaats een zes put plaat met menselijke alveolaire epitheelcellen in de luchtdichte kamer en verzegel het deksel.
Regel de gasstroom om snel 5% CO2 te verkrijgen. Open vervolgens de gehalogeneerde verdamper en pas het gewenste percentage aan. Zodra de streefwaarden zijn bereikt, verlaag de verse gasstroom tot een liter per minuut.
De luchtdichte kamer kan met deze gasstroom zo lang worden gehandhaafd als nodig is voor het experiment. De cursussen van sevoflurane en isoflurane concentraties in het middel waren gelijkaardig in tijd. Onmiddellijk nadat de vereiste concentratie van gehalogeneerd agens was ingesteld, stegen de concentraties gedurende het eerste uur.
Een plateau werd toen bereikt dat bleef bestaan tot de toediening van het gehalogeneerde middel werd tegengehouden. Na onderbreking van de toediening daalden de concentraties binnen een uur. Hier worden de fracties van gehalogeneerd middel na verloop van tijd in de luchtdichte kamer gemeten door de gasanalyzer.
Deze procedure is relatief goedkoop en zeer gemakkelijk te nemen, zelfs wanneer onderzoekers nog nooit een luchtdichte kamer hebben gemanipuleerd. Na deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd, zoals eiwit- en RNA-kwantificering, immunofluorescentie, meting van eiwitdoorlatendheid en gratis transport om vragen te beantwoorden over de specifieke effecten van de gehalogeneerde middelen tijdens epitheliale longletsel en de resolutie ervan. Na de ontwikkeling ervan kan deze techniek de weg vrijmaken voor onderzoek op het gebied van acuut ademhalingsnoodsyndroom om het mechanisme dat betrokken is bij epitheliale longletsel tijdens ARDS verder te bestuderen en nieuwe therapieën te testen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een eenvoudig protocol voor het bereiken van nauwkeurige concentraties sevofluraan of isofluraan in vitro. De methode is bedoeld om het begrip van de mechanismen van epitheliale longschade te verbeteren en nieuwe therapieën voor het acute respiratoire distress syndroom te evalueren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Respiratoire geneeskunde
- Farmacologie
Achtergrond
- Acute respiratory distress syndrome (ARDS) is een kritieke aandoening die nieuwe therapeutische benaderingen vereist.
- Gehalogeneerde middelen zoals sevofluraan en isofluraan kunnen potentieel hebben bij de behandeling van longletsel.
- Inzicht in de mechanismen van longletsel is essentieel voor de ontwikkeling van effectieve behandelingen.
- Deze studie richt zich op een methode om de blootstelling aan deze middelen in een laboratoriumsetting te beheersen.
Doel van de studie
- Om een betrouwbaar protocol te ontwikkelen voor het bestuderen van longletsel en herstel.
- Om gehalogeneerde additieven te testen als potentiële therapieën voor ARDS.
- Om het begrip van de mechanismen van epitheliaal longletsel te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Constructie van een luchtdichte kamer met behulp van een hermetische polypropyleen doos.
- Boren van een gat voor de toevoer van het gasmengsel en het afdichten hiervan met silicone.
- Celkweektechnieken om cellen bloot te stellen aan gehalogeneerde middelen.
- Het bereiken van gecontroleerde concentraties sevofluraan of isofluraan.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt een nauwkeurige controle over de concentratie van gehalogeneerde middelen mogelijk.
- Faciliteert de studie naar mechanismen van longletsel in vitro.
- Biedt een platform voor het testen van nieuwe therapieën voor ARDS.
- Demonstreert de eenvoud en effectiviteit van het protocol.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol is een waardevolle tool voor onderzoek naar longletsel.
- Het opent wegen voor het verkennen van nieuwe therapeutische opties voor ARDS.
- Verdere studies zijn nodig om de bevindingen te valideren en klinische toepassingen te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Deze methode maakt een nauwkeurige in vitro controle van gehalogeneerde gasconcentraties mogelijk om mechanismen van epitheliale longbeschadiging bij ARDS te bestuderen. Het biedt een reproduceerbaar platform voor de evaluatie van nieuwe therapeutica die gericht zijn op alveolaire beschadiging en ontsteking. De aanpak ondersteunt vroege targetvalidatie en mechanistische risicoanalyse bij de ontwikkeling van pulmonale geneesmiddelen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken met betrekking tot gehalogeneerde middelen in pathways van longletsel.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerd systeem voor functionele targetvalidatie van epitheliale responsen op anesthetica.
- Voorspellende waarde: Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid door kwantificeerbare, tijdsopgeloste concentratiegegevens in het kweekmedium te leveren.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream compound-screening middels gecontroleerde gasblootstelling.
- Reproduceerbaarheid: Garandeert consistente mediumconcentraties van sevofluraan en isofluraan, wat een betrouwbare evaluatie van compounds mogelijk maakt.
- Schaalbaarheid: Maakt gebruik van een eenvoudig, luchtdicht kamerontwerp dat geschikt is voor multi-well plate-formaten en herhaalde experimenten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeeld: Modelleert alveolaire epitheliale beschadiging onder fysiologische omstandigheden die relevant zijn voor de pathofysiologie van ARDS.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen en preklinische validatie door blootstellingsdrempels te definiëren die gekoppeld zijn aan biologische effecten.
- Risicogebaseerde voortgang: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door concentratie-effectrelaties vast te stellen voor screening op veiligheid en werkzaamheid.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van target engagement tot lead-optimalisatie, in het bijzonder voor pulmonale therapeutica gericht op inflammatoire en letselveroorzakende pathways.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van gehalogeneerde middelen als modulatoren van mechanismen voor epitheliale beschadiging en herstel.
- Screening: Maakt assay-standaardisatie mogelijk door stabiele, meetbare gasconcentraties in de vloeistoffase over tijd.
- Analytics: Genereert kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen (bijv. mediumconcentratie mg/L) via gasmassaspectrometrie voor de vergelijking van condities.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt blootstellingsdynamiek met biologische uitkomsten, wat bijdraagt aan preklinische continuïteit in lijn met biomarkers.
- Enterprise Reuse: Biedt een herbruikbaar, kostenefficiënt platform voor iteratieve tests van anesthetica of gasgebaseerde therapeutica over verschillende projecten heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in longbeschadigingsmodellen door gecontroleerde, reproduceerbare blootstellingscondities aan gas te bieden.
- Operationele waarde: Zorgt voor standaardisatie en reproduceerbaarheid door het ontwerp van een afgesloten kamer en real-time gasmonitoring.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege risicoreductie van gehalogeneerde adjuvansen mogelijk te maken vóór kostbare in vivo studies.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van pulmonale drugcandidates via gedefinieerde blootstellings-respons-profilering.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in celkweek aan het lucht-vloeistofgrensvlak en in gasbehandelingssystemen.
- Toegang tot circuits van anesthesieapparatuur, gasanalyzers en massaspectrometrie is nodig voor de validatie van de mediumconcentraties.
- Vereist standaardisatie tussen teams van blootstellingsprotocollen, afdichtingstechnieken en omgevingscontroles (37°C, 5% CO2).
- Omvat overwegingen voor adaptatie voor verschillende celtypen, plaatformaten en gehalogeneerde middelen naast sevofluraan en isofluraan.
- Praktische beperkingen omvatten beperkingen in het kamervolume en de equilibratietijd (~1 uur) om plateauconcentraties in het medium te bereiken.
