Name: Directe intrathecale injectie van recombinante Adeno-geassocieerde virussen in volwassen muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Leer een directe intrathecale injectietechniek met lidocaïne voor efficiënte aflevering van adeno-geassocieerde virussen naar het centrale zenuwstelsel van volwassen muizen. Deze methode maakt betrouwbare gentherapie-onderzoek naar ziekten zoals ALS mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van HEBEI provinciale afdeling van menselijke hulpbronnen en sociale zekerheid (CY201605) en een subsidie van Natural Science Foundation Hebei provincie (H2017206101), en we zijn zeer dankbaar Dr Guangping Gao, die de AAV voor Deze studie.

FVB/NJ muizen werden gefokt in de dier faciliteit van sleutel laboratorium van Hebei neurologie. Alle muis experimenten werden goedgekeurd door de tweede ziekenhuis van Hebei medische universiteit ethische Commissie en uitgevoerd volgens de voorschriften van dierlijke Laboratoriumbeheer uitgevaardigd door het ministerie van wetenschap en technologie van de People's Republic van China.
1. bereiding van de stockoplossing van de 20% lidocaïne Hydrochloride
<ol><li>Weeg 2 g van lidocaïne hydrochloride. Voeg 5 – 6 mL steriel water en vortex zachtjes. Verhoog het volume tot een totaal van 10 mL met steriel water.</li>
	<li>1.2 Filtreer de stockoplossing door filters van 0,2 micron. Aliquot de stockoplossing, 1 mL per 1,5 mL microcentrifuge buis, en verzegel het met een verzegeling film. Bewaren bij 4 ° C.</li>
</ol>2. directe intrathecale AAV levering in wakker muizen
<ol><li>Veeg het werkgebied steriel gaas met 70% ethanol en voorbereiden van de vereiste leveringen, zoals vermeld in tabel 1.</li>
	<li>Bereiden van 100 µL AAVrh.10/1% lidocaïne hydrochloride complexe door 95 µL van rAAVrh10 stockoplossing (5 x 1012 genoom kopieën/mL) toe te voegen in een steriele 200 µL microcentrifuge buis, en voeg 5 µL van 20% lidocaïne hydrochloride stockoplossing. Meng goed door pipetteren omhoog en omlaag. Sla de virus oplossing op ijs (4 ° C). Opmerking: 8 µL per muis4 zal worden gebruikt.</li>
	<li>
Voorbereiding van de spuit met AAV oplossing voor injectie
	<ol>
<li>Monteren van een 25 µL Hamilton syringe met een 27 G naald en uitlijnen van de schuine punt van de naald met de volumetrische schaal op de spuit.</li>
		<li>Teken 8 µL met 4 x 1010 genoom kopieën van het virus oplossing voorzichtig in de spuit. Zorg ervoor om luchtbellen te verwijderen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiding van de muis Opmerking: mannelijke of vrouwelijke FVB/NJ muizen (30 – 70 dagen oud) in deze studie werden gebruikt. IT injectie werd geëxploiteerd in de kap.<ol>
<li>Steriliseren van het werkgebied in een kap met 70% ethanol. De wakker muis (man of vrouw, 30-70 dagen oud, 13 – 20 g gewicht) zetten een bedpiece in een liggend in de kap. Betrekking hebben op het bovenlichaam met steriel gaas om te kalmeren de muis en voorkomen zijn gebeten.</li>
		<li>Het oplossen van het dier door aangrijpend op passende wijze en stevig op haar bekkengordel met een duim op één kant en wijsvinger/midden vinger aan de andere kant. Houd de huid tussen bilaterale pelvic Gaines (step-ins) strak met de duim en wijsvinger. Houd zachtjes op het bovenlichaam van het dier met de palm.</li>
		<li>Scheren van de vacht op zijn rug tussen de bilaterale pelvic Gaines (step-ins) en steriliseren van het huidoppervlak met een jodide gebaseerde struikgewas en 70% ethanol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Intrathecale injectie12
	<ol>
<li>Het gevoel van de lat. ruimte langs de middelste lijn tussen de bilaterale pelvic Gaines (step-ins) met een duim of wijsvinger van de andere hand en druk op een kuiltje met een nagel om aan te geven van de L5-L6 lat. ruimte (Zoek de injectieplaats).</li>
		<li>De basis van de staart licht en zachtjes draaien om aan te geven van de middellijn van de wervelkolom. Aanpassen van de naald schuine kant naar het hoofd van het dier vóór injectie (vermeld in stap 2.3.1).</li>
		<li>Zorg ervoor dat de dieren stevig vast en uitlijnen van de naald langs de middellijn van de wervelkolom.</li>
		<li>De naald voorzichtig en verticaal invoegen (of kantelen iets 70-80°) in het snijpunt van inspringen en houd de spuit in een centrale sagittale vlak. Verminderen van de hoek tot ongeveer 30° langzaam wanneer het verbindt het bot en de naald glijden in de lat. ruimte. Opmerking: Een flick duidelijk plotselinge staart is een teken van succesvolle entree in de intradural ruimte. Zodra de naald de lat. ruimte gaat, zal de naald tip voelt stevig geklemd. De 27 G naald gebruikt in deze studie is geschikt voor IT levering in muizen maar niet ratten.</li>
		<li>Injecteer de oplossing van de vector (vermeld in stap 2.2). Start de timer en injecteren 8 µL van de vector-oplossing bij een snelheid van 1 µL/4 s. behouden de naald ongeveer 1 min. na het beëindigen van levering. De naald met zachte rotatie om te voorkomen dat lekkende trekken.</li>
		<li>De tijdelijke zwakte van de muis ledematen onmiddellijk na de levering te evalueren van de injectie kwaliteit4scoren. Opmerking: De standaard is als volgt:4 Score van 0: geen zwakte; Score van 1: minor zwakte van de ledematen hind zonder gait abnormaliteit; Score van 2: matig zwakte van de ledematen hind met voor de hand liggende gait abnormaliteit; Score van 3: volledige verlamming van de ledematen van hind; Score van 4: volledige verlamming van de ledematen hind, kortademigheid en gematigde zwakte van de fore ledematen; en score 5: volledige verlamming van alle vier ledematen en duidelijk kortademigheid.</li>
		<li>Verplaats de muis terug naar de kooi voor het herstel van verlamming.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Opruimen
	<ol>
<li>Spoel de injectiespuit met 1 mL steriel water. Laboratorium benodigdheden sorteren en verzamelen van alle niet-disposable materialen voor gesteriliseerde met autoclaaf sterilisatie. Reinig de Bank met 70% ethanol.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. de weefsels voorbereiding immunohistochemische kleuring
<ol><li>
Weefsel collectie
	<ol>
<li>Anesthetize muizen op 21 dagen na injectie met 3% Chloraalhydraat (0,1 mL/10 g) diep door intraperitoneale injectie.</li>
		<li>Perfuse transcardially met 20 mL ijskoud 0,01 M PBS (NaCl 147 mM; NaH2PO4 1.9 mM; K2HPO4 8.1 mM, pH 7.4) om te beginnen, dan 4% ijskoude paraformaldehyde (in 0,01 M PBS) met pomp (10 mL/min voor 1 min en vervolgens 5 mL/min voor 9 min). Let op: Paraformaldehyde is kankerverwekkend en giftig. Omgaan alleen in de zuurkast terwijl het dragen van handschoenen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dissectie van het ruggenmerg en de hersenen
	<ol>
<li>Herstellen van de ledematen en hoofd van elk dier in een liggend op een vak van schuimstof met de spuit naalden, dan strippen en verwijderen van de huid van het hoofd naar heiligbeen met een schaar.</li>
		<li>Clip van de schedel tussen ogen, naast de middelste route van de schedel en de horizontale lijn op het cerebellum knipt en daarna de schedel aan beide zijden te openen.</li>
		<li>Til het achterhoofdsbeen met een pincet en open het spinale kanaal bilateraal met ophthalmic schaar. Afgesneden van de ribben aan weerszijden en zorgvuldig verwijderen van de bovenste helft van de wervels.</li>
		<li>Lift van de hersenen met gebogen pincet en verbreken van de zenuwen van de schedel basis, dan ontleden zorgvuldig uit de hele hersenen en het ruggenmerg. Na correctie van de weefsels in 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiding van weefsel segmenten
	<ol>
<li>Cryoprotect de hersenen en cervicale en lumbale ruggenmerg in 30% sacharoseoplossing overnacht bij 4 ° C. Insluiten van het weefsel in optimale snijden temperatuur (OCT) samengestelde en bevriezen snel met vloeibare stikstof.</li>
		<li>Knip het weefsel op 25 µm met behulp van een cryostaat en opslaan van de bevroren secties in 0,01 M PBS bij 4 ° C voor gebruik.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Immunohistochemistry
<ol><li>Voorbehandeling van de vrij zwevende secties in 1% H2O2 voor 10 min, dan wassen in PBS voor 10 min. Incubate in een blokkerende oplossing met serum van 5% en 0,3% niet-ionogene wasmiddel in PBS gedurende 1 uur.</li>
	<li>Incubeer de plakjes met corresponderende primaire antilichamen 's nachts bij 4 ° C. Wassen van de secties in PBST (0,2% Tween 20 in PBS) voor 30 min. (3 keer voor elke 10 min).</li>
	<li>Incubeer de plakjes met bijbehorende Biotine-secundair antilichaam bij kamertemperatuur voor 1 h. wassen in PBST voor 30 min. (3 keer voor elke 10 min).</li>
	<li>Incubeer de secties met affiniteit Biotine peroxidase complex voor 40 min en vlek met achromogenic agent. Monteren van de secties in dia's en goed droog.</li>
	<li>Geniet van de dia's in watervrij ethanol voor 5 min en xyleen gedurende 10 minuten, en vervolgens zegel van de dia's met een montage-medium. Ten slotte, het imago van de dia's met een microscoop voorzien van een charge - coupled apparaat (CCD) op 100 x, 200 x en 400 x vergrotingen.</li>
</ol>

<ol><li>Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+adeno-associated+viral+vectors+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76(2014).</li>
<li>Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22001604">Viral vectors for gene delivery to the central nervous system.</a> Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+CNS+transduction+of+adult+mice+by+intravenously+delivered+rAAVrh.8+and+rAAVrh.10+and+nonhuman+primates+by+rAAVrh.10%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10.</a> Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Single+Injection+of+Recombinant+Adeno-Associated+Virus+into+the+Lumbar+Cistern+Delivers+Transgene+Expression+Throughout+the+Whole+Spinal+Cord%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord.</a> Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).</li>
<li>Hastie, E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+at+50%3A+a+golden+anniversary+of+discovery%2C+research%2C+and+gene+therapy+success--a+personal+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success--a personal perspective.</a> Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).</li>
<li>Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-Associated+Virus-Based+Gene+Therapy+for+CNS+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases.</a> Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).</li>
<li>Tanguy, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+AAVrh10+provides+higher+transgene+expression+than+AAV9+in+the+brain+and+the+spinal+cord+of+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36(2015).</li>
<li>Federic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+spinal+motor+neuron+transduction+following+intrathecal+delivery+of+AAV9+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs.</a> Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).</li>
<li>Ayers, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+and+efficient+transduction+of+spinal+cord+and+brain+following+neonatal+AAV+injection+and+potential+disease+modifying+effect+in+ALS+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice.</a> Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+Intrathecal+Injection+of+rAAVrh10+Enhances+its+Transduction+of+Spinal+Cord+and+Therapeutic+Efficacy+in+a+Mutant+SOD1+Model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS.</a> Neuroscience. 365, 192-205 (2017).</li>
<li>Borel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+rAAVrh10+Mediated+SOD1+Silencing+in+Adult+SOD1%28G93A%29+Mice+and+Nonhuman+Primates%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates.</a> Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).</li>
<li>Fairbanks, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+delivery+of+analgesics+in+experimental+models+of+pain+and+analgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).</li>
<li>Hylden, J. L., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+morphine+in+mice%3A+a+new+technique%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Intrathecal morphine in mice: a new technique.</a> European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+spinal+cord+transduction+by+intrathecal+injection+of+rAAV+delivers+efficacious+RNAi+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scAAV9-VEGF+prolongs+the+survival+of+transgenic+ALS+mice+by+promoting+activation+of+M2+microglia+and+PI3K%2FAkt+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway.</a> Brain Research. 1648, Pt A 1-10 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Technisch, zijn er verschillende kritische stappen tijdens de injectie van de IT in wakker muizen. Eerste, goede gebaar en firma controle van de muizen gedurende de hele operatie is een voorwaarde voor succesvolle levering. Ten tweede is het moeilijkste punt de lat. ruimte met de naald tip, gevoel als er moet niet te diep invoegen zonder weerstand of invoegen onder dwang onder sterke weerstand in het geval van de dieren verwonden of buigend van de naald-tip. Ten derde, hoewel de tijdelijke verlamming als gevolg van lidoc...

AAV langdurige en wijdverbreide genexpressie in de signaaltransductie CNS met weinig bijwerkingen kan bemiddelen, en daarom is uitgegroeid tot een van de meest veelbelovende voertuigen voor gentherapie om CNS ziekten met inbegrip van Amyotrofische laterale sclerose (ALS), Huntington van te behandelen ziekte (HD), de ziekte van Alzheimer (AD), opslag Lysosomale ziekten (LSD), de ziekte van Gaucher (GD) en neuronale ceroid lipofuscinose (NCL)1. Momenteel werden meer dan 100 AAV serotypen geïsoleerd van mens en dier. Onder deze, ten minste 12 zijn gebruikt in preklinische en klinische proeven, met inbegrip van de meest gebruikte gebruikt gene vectoren zoals AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 en rAAVrh.101,2,3,4, 5,6.
Verschillende CNS aandoeningen vereisen verschillende strategieën van de levering van de AAV als gevolg van de verschillende getroffen regio's van de CNS en celtypes. De CNS regio's en de cel typen die AAV kan transduce is afhankelijk van het serotype evenals leveringsmethode. RAAVrh10 heeft bijvoorbeeld aangetoond dat transduce overwegend astrocyten wanneer geleverd door systemische intraveneuze injectie (IV), terwijl het getransduceerde neuronen én glia wanneer geleverd door intrathecale injectie4,7. Bovendien resulteerde parenchym injectie in lokale transductie tot de omgeving van de injectieplaats, overwegende dat de injectie in de cerebrospinale vloeistof (CSF) via intraventricular of intrathecale injectie in wijdverbreide CNS transductie8 resulteerde . Studies hebben ook aangetoond therapeutische werkzaamheid van gentherapie in neurodegeneratieve aandoeningen AAV-geleverd door beheer9,10,11. Ziekten die invloed hebben op gebieden van het centraal zenuwstelsel zoals ALS, intrathecale injectie in het CB gebleken ter dekking van de meeste gebieden die zijn getroffen door de ziekte met een lagere dosis, in vergelijking met een systemische levering methode4,10. Recente studies hebben ook aangetoond dat Lumbaalpunctie kan worden gebruikt voor het injecteren van AAV in Muismodellen voor ALS, die mogelijke verwondingen laminectomie en intrathecale catheterisatie4is gekoppeld vermijdt.
Experimentele directe Lumbaalpunctie werd eerst gebruikt voor agenten, vooral anesthetica, naar het ruggenmerg voor analgesie en verdoving in 188512,,13. In dit verslag illustreren we de lumbale punctie IT injectie methode in volwassen muizen met behulp van 1% lidocaïne hydrochloride, een lokale amide afkomstige verdovingsmiddel, in de injectie-oplossing te evalueren en controleren van de kwaliteit van de injectie. Succesvolle injecties werden gekenmerkt door lidocaïne-geïnduceerde tijdelijke verlamming, overwegende dat mislukte injecties geen dit gedrag vertonen. We ingedeeld het niveau van voorbijgaande zwakte als één van de vijf klassen om te helpen de efficiëntie van de injectie te voorspellen. Tot slot laten we zien dat het niveau van de transductie rAAVrh10 kan worden voorspeld door de rang van verlamming. Daarom is deze methode voor het bezorgen van de intrathecale AAV inzetbaar verbeteren AAV-gemedieerde gen-voor experimentele therapie van CNS ziekten.

<table><tbody><tr><td>FVB/NJ muizen</td><td>Charles River Laboratories China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine hydrochloride monohydraat</td><td>HEOWNS</td><td>73-78-9</td><td></td></tr><tr><td>AAV</td><td>Viral Vector Core van het Gene Therapy Center aan de University of Massachusetts Medical School</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 &micro;L&nbsp; Hamilton spuit/27-30 G naald</td><td>GASTIGHT</td><td>1702</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T compond</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>H 2O 2</td><td>SHUI HUAN PAI</td><td>170401</td><td></td></tr><tr><td>Geitenserum</td><td>Solarbio</td><td>S9070</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>LIFE SCIENCES</td><td>T8200</td><td></td></tr><tr><td>Konijn anti-GFP</td><td>Life tech</td><td>G10362</td><td>1:333 verdunning</td></tr><tr><td>Het tweede antilichaam (geit-anti konijn)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>111-005-144</td><td>1:1.000 verdunning</td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABC REAGENT</td><td>Vector Lab</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB Peroxidase Substraat Kit</td><td>Vector Lab</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Montagemedium voor fluorescentie met DAPI</td><td>Vectorshield</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Yong Da Chemical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot;2H2O</td><td>Yong Da Chemical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot;12H2O</td><td>Yong Da Chemical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Yong Da Chemical</td><td>307699</td><td></td></tr><tr><td>Adhesie Microscoopglazen</td><td>CITOGLAS</td><td>17083</td><td>25 mm x 75 mm</td></tr><tr><td>SUPER-SLIP MICRO-GLAS</td><td>Electro Microscopy Siences</td><td>72236-60</td><td>24 mm x 60 mm</td></tr><tr><td>15 mL Centrifugeerbuisje</td><td>CORNING</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>96 wel celcultuur cluster</td><td>Coster</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>24 wel celcultuur cluster</td><td>Coster</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>WEN ZHI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gaas</td><td>Wei AN</td><td>05171112</td><td>8 cm x 10 cm x 12 cm</td></tr><tr><td>1 mL spuit</td><td>Hong Da</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microbuisjes</td><td>Plasmed</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipet&nbsp;</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peppet tips</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>eppendorf</td><td>5427R</td><td></td></tr><tr><td>Regerator</td><td>Haier</td><td>BCD-539WT</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>MILLEX GP</td><td>R4PA42342</td><td></td></tr><tr><td>Pomp</td><td>LongerPump</td><td>BT-100-2J/YZ1515X</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>Freezing-microtoom</td><td>Leica</td><td>CM1520</td><td></td></tr></tbody></table>

directe intrathecale injectie van recombinante adeno-geassocieerde virussen in volwassen muizen

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Intrathecale (IT) injectie van adeno-associated virus (AAV) heeft veel belangstelling in de therapie van het gen van de CNS uit hoofde van haar veiligheid, noninvasiveness en uitstekende transductie werkzaamheid getrokken in het VNV. Eerdere studies hebben aangetoond de therapeutische werkzaamheid van gentherapie AAV-geleverd in neurodegeneratieve aandoeningen door het bestuur. Echter zijn hoge tarieven van onvoorspelbare falen als gevolg van de technische beperking van IT-beheer in kleine dieren gemeld. Hier, wij opgericht een scoresysteem om aan te geven van de omvang van het succes van Lumbaalpunctie in kleine dieren door 1% lidocaïne waterstofchloride toe te voegen in de injectie-oplossing. Verder laten we zien dat de omvang van de tijdelijke zwakte na injectie de signaaltransductie efficiëntie van AAV kan voorspellen. Dus, is dit IT injectie methode kan worden gebruikt voor het optimaliseren van therapeutische proeven in muismodellen van CNS ziekten die grote regio's van de CNS teisteren.

Muizen toonde verschillende graden van tijdelijke zwakte direct na het injecteren van AAV oplossing in 1% lidocaïne hydrochloride als gevolg van verschillende kwaliteit van intrathecale injectie. Volgens het semi-kwantitatieve 5-grade scoresysteem, we hebben vastgesteld, wij de patronen van de transductie van AAV getest in muizen met verschillende graden van lidocaïne-geïnduceerde ledemaat zwakte (score van 0, n = 2; score 1, n = 1; score 4, n = 4; score 5, n = 3). EGFP immunokleuring van...

Hier presenteren we een directe intrathecale injectietechniek gebruik van 1% lidocaïne waterstofchloride in een virale oplossing om te zorgen voor efficiënte adeno-associated virus levering aan kleine dieren en een scoresysteem te voorspellen transductie efficiëntie in het midden zenuwstelsel volgens de graad van tijdelijke zwakte veroorzaakt door lidocaïne.

Directe intrathecale injectie van recombinante Adeno-geassocieerde virussen in volwassen muizen

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Deze methode vergemakkelijkt de efficiënte intrathecale levering van adeno-geassocieerde virale transgenes in wakkere kleine dieren voor de experimentele behandeling van ziekten van het centrale zenuwstelsel zoals ALS. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat de virale oplossing 1% lidocaïnehydrochloride bevat dat een voorbijgaande verlamming veroorzaakt na een succesvolle injectie. Hoewel deze methode een visuele indicator biedt voor het beoordelen van het succes van de intrathecale geautomatiseerde situatie, is voldoende praktijk essentieel om het slagingspercentage van de levering te verbeteren.Voordat u met de procedure begint, bevestigt u een naald van 27 meter aan een 25 microliter Hamilton-spuit en lijnt u de schuine punt van de naald uit met de volumetrische schaal op de spuit. Laad vervolgens voorzichtig 8 microliter van 4 x 10 tot de 10e genoomkopieën van de virusoplossing in de spuit, waarbij u ervoor zorgt dat bellen worden vermeden. Plaats vervolgens een wakkere 30 tot 70 dagen oude 12 tot 30 gram muis op een bed stuk in de gevoelige positie in een bioveiligheid kap en bedek het bovenlichaam met steriel gaas om de muis te kalmeren en om te voorkomen dat gebeten.Stevig grip op de muis op zijn bekkengordel met de duim aan de ene kant en de wijsvinger en middelvinger aan de andere kant houden van de huid tussen de bilaterale bekkengordels strak met een duim en wijsvinger. Scheer vervolgens de vacht tussen de bilaterale bekkengordels en steriliseer de blootgestelde huid met een jodiumgebaseerde scrub en 70% ethanol. Voor directe intrathecale levering van de adeno-geassocieerde virusoplossing, palpate de intervertebrale ruimte langs de middellijn tussen de bilaterale bekkengordels en gebruik een vingernagel om een inkeping in de huid te drukken om de L5 aan L6 tussenwervelruimte aan te geven.Draai de basis van de staart lichtjes en voorzichtig om de middellijn van de wervelkolom te onthullen en pas de schuine kant van de naald aan de kop van het dier aan. Met de muis stevig in positie, lijn de naald langs de middellijn van de wervelkolom en steek de naald voorzichtig en verticaal in het midden van de inkeping houden van de spuit in een centraal sagittale vlak. Wanneer de naald in contact komt met het bot, langzaam verminderen van de hoek tot ongeveer 30 graden en schuif de naald in de tussenwervel ruimte.Een plotselinge staart flick is een teken van een succesvolle binnenkomst in de intradurale ruimte. Wanneer de naald de tussenwervelruimte binnenkomt, voelt de punt stevig vastgeklemd. Injecteer de vectoroplossing en houd de naald gedurende één minuut in de intradurale ruimte.Trek vervolgens langzaam de naald met rotatie om lekkage te minimaliseren. Scoor onmiddellijk de voorbijgaande zwakte van de muisledematen om de injectiekwaliteit te evalueren en de muis terug te brengen naar zijn kooi voor herstel van de verlamming. Bevestig op het juiste experimentele eindpunt de ledematen en het hoofd van de geïnjecteerde muis in de gevoelige positie op een schuimdoosdeksel en gebruik een schaar om de huid van het hoofd naar het heiligbeen te strippen en te verwijderen.Klem de schedel tussen de ogen, snijd langs de middellijn van de schedel en de horizontale lijn boven het cerebellum en open de schedel aan elke kant. Gebruik een pincet om het occipitaal bot te verwijderen en gebruik oogheelkundige schaar om het ruggenmergkanaal bilateraal te openen. Snijd de ribben aan beide zijden en verwijder voorzichtig het bovenste deel van de wervels.Gebruik gebogen pincet om de hersenen op te heffen en de zenuwen van de schedelbasis te verbreken. Dan zorgvuldig extraheren van de hele hersenen en het ruggenmerg en bevestig de weefsels in 4%paraformaldehyde voor 24 uur. Aan het einde van de fixatieperiode beschermt cryoprotect de hersenen en het rug- en lumbale ruggenmerg in 30% sacharoseoplossing 's nachts bij 4 graden Celsius, gevolgd door inbedden in een optimale snijtemperatuursamenstellingsamenstelling voordat de vrieskou in vloeibare stikstof wordt ingevroren.Gebruik vervolgens een cryostat om 25 micrometer dikke delen van elk weefsel te verkrijgen, waarbij de bevroren secties in 0,01 molaire PBS worden opgeslagen bij 4 graden Celsius zoals ze worden verkregen. Voor immunohistochemische analyse van de weefsels, pretreat de vrij zwevende secties met 1% waterstofperoxide gedurende 10 minuten, gevolgd door een 10 minuten wassen in PBS. Vervolgens broeden de monsters in het blokkeren van oplossing met 5% serum en 0,3% niet-ionisch wasmiddel in PBS gedurende 1 uur, gevolgd door 's nachts etikettering op 4 graden Celsius met de juiste primaire antilichamen van belang.De volgende dag was je de secties met 3 10 minuten wasbeurten in PBS plus Tween en broed de glijbanen uit met de juiste bijbehorende biotinylated secundaire antilichamen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur na de laatste wasbeurt. Aan het einde van de incubatie, was de secties 3 keer in verse PBST zoals net aangetoond en incubeer de monsters met oneindig biotine peroxidase complex gedurende 40 minuten, gevolgd door vlekken met een geschikte chromogene agent. Monteer de gelabelde secties op glazen microscoopplaten en laat de glijbanen 5 minuten in watervrije ethanol weken zodra de gemonteerde secties volledig zijn opgedroogd.Vervolgens weken de glijbanen in xyleen gedurende 10 minuten en verzegelen ze met een geschikte montage medium. Beeld vervolgens de dia's met een lichtmicroscoop uitgerust met een lading gekoppeld apparaat op 100, 200, en 400 keer vergrotingen. eGFP immunostaining van cervicale en lumbale dwarslaesieweefsel secties onthult weinig of geen transductie in het lumbale ruggenmerg van muizen met een zwakte score van 0, licht verbeterde transductie bij muizen met een zwakte score van 1, en sterke en wijdverspreide transducties bij muizen met een zwakte score van 4 of 5.Kwantificering van de GFP-kleurintensiteit van dwarslaesie van dwarslaesie van muizen met verschillende gradaties van voorbijgaande ledematen, geeft aan dat de ernst van de zwakte na de injectie met virusoplossing nauw correleert met de omvang van de dwarslaesie. In de hersenen worden robuuste eGFP-signalen gedetecteerd in de olfactorische bol, dorsolaterale prefrontale cortex, dentate gyrus en de CA3-zone van de hippocampus, cerebellaire cortex en marginale gebieden van de hersenstam, waaronder de gezichtskern, choroid plexus en de ependymale epitheliale cellen. Motorneuronen in de voorste hoorns worden ook sterk omgezet in verschillende niveaus van het ruggenmerg.Bovendien, in de cortex, GFP positieve neuronen met inbegrip van piramidale cellen worden gedetecteerd, evenals verschillende glia celtypes, waaronder microglia, astrocyten, en oligodendrocyten. Deze techniek stelt onderzoekers in de neurologie veld in staat om de therapeutische effecten van directe intrathecale levering bij kleine wakkere dieren op ziekten van het centrale zenuwstelsel te verkennen.

direct-intrathecal-injection-recombinant-adeno-associated-viruses

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier presenteren we de intracraniële injectie van AAV-vectoren voor TL-etikettering van neuronen en glia in de visuele cortex.

Intracraniële Injectie van adeno-geassocieerde virale vectoren

Source: Li, D., et al. Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the procedure for the intrathecal injection of adeno-associated viruses (AAV) into the cerebrospinal fluid (CSF) of an awake mouse, covering syringe preparation, spinal alignment, and precise needle insertion. This method validates targeted gene delivery, supporting its potential for CNS therapies.

Intrathecal Delivery of Viruses in a Mouse Model for Treating Central Nervous System Diseases

Source:Pourshafie, N., et al. Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents. J. Vis. Exp. (2018).In this video, a spinal and bulbar muscular atrophy or SBMA-affected mouse undergoes tail vein injection of recombinant AAV (Adeno-associated vectors) vectors carrying a plasmid encoding therapeutic microRNA. The vector produces microRNA that binds to mutant AR (Androgen receptor)-mRNA (messenger ribonucleic acid),...

Injecting Recombinant Adeno-Associated Vectors in a Spinal and Bulbar Muscular Atrophy Mouse Model

Source: Grames, M. S., et al. Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the tail vein injection of recombinant adeno-associated virus (AAV) in rats. After injection into the lateral tail vein, the virus enters the bloodstream, circulates through the heart, and reaches the brain, where it enters neurons and facilitates target protein production for...

 Intravenous Administration of Recombinant Adeno-Associated Virus Vectors in a Rat Model 

Hier demonstreren we een techniek voor wijdverspreide neuronale transductie door intraventriculaire injectie van adeno-geassocieerd virus in de neonatale muisbrein. Deze methode biedt een snelle en eenvoudige manier om levenslange expressie van vireel aangeboden transgenen te bereiken.

Intracerebroventriculaire Viral Injectie van de Neonatale Mouse Brain voor persistent en wijdverbreide Neuronale Transduction

Het doel van de huidige studie was het ontwikkelen en valideren van de kracht en de veiligheid van de lever-adeno-geassocieerde virus 9 (AAV9) -gemedieerde genafgifte door gebruik te maken van een nieuwe subpiale genafgifte techniek bij volwassen muizen.

Subpiaal Adeno-geassocieerde Virus 9 (AAV9) Vector Levering in Volwassene Muizen

Het huidige protocol schetst stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van intrathecale injecties bij neonatale muizen voor genbewerking en medicijnafgifte.

Intrathecale injectie van pasgeboren muis voor genoombewerking en medicijnafgifte

Een chirurgische ingreep wordt beschreven om injecties uit te voeren in de lumbale stortbak van de jonge rat. Deze benadering is gebruikt voor de intrathecale toediening van gentherapievectoren, maar er wordt verwacht dat deze benadering kan worden gebruikt voor een verscheidenheid aan therapieën, waaronder cellen en medicijnen.

Intrathecale vectortoediening bij jonge ratten via lumbale stortbakinjectie

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol voor laterale staartaderinjectie bij muizen om adeno-geassocieerd virus (AAV) systemisch toe te dienen bij volwassen muizen. Daarnaast beschrijven we protocollen van veelgebruikte assays om AAV-transductie te beoordelen.

Consistente toediening van adeno-geassocieerd virus via laterale staartaderinjectie bij volwassen muizen

Een lumbale intrathecale injectie vertegenwoordigt een translationeel relevante toedieningsweg voor het toedienen van gentherapie aan het centrale zenuwstelsel. Dit uitgebreide gestandaardiseerde protocol voor lumbale intrathecale injecties bij neonatale, juveniele en volwassen muizen en ratten is bedoeld om onderzoekers te begeleiden bij het toepassen van deze techniek voor preklinische gentherapiestudies.

Lumbale intrathecale injectie van gentherapievectoren voor targeting van het centrale zenuwstelsel bij muizen en ratten

Er wordt een nieuwe techniek beschreven voor wijdverbreide toediening van adeno-geassocieerd virus waarbij gebruik wordt gemaakt van infusie van subarachnoïdaal virus. Deze methode zorgt niet alleen voor wijdverspreide transductie van neocorticale neuronen van muizen in oppervlakkige lagen, maar resulteert ook in selectieve expressie van het transgen in laag vijf piramidale neuronen, zelfs bij gebruik van een niet-selectieve promotor.

Wijdverbreide transductie van neocorticale neuronen van muizen door subarachnoïdale injectie van AAV2

Leer een directe intrathecale injectietechniek met lidocaïne voor efficiënte aflevering van adeno-geassocieerde virussen naar het centrale zenuwstelsel van volwassen muizen. Deze methode maakt betrouwbare gentherapie-onderzoek naar ziekten zoals ALS mogelijk.

Directe intrathecale injectie van recombinante Adeno-geassocieerde virussen in volwassen muizen

Meer video's verkennen