Name: Kristalstructuur van de N-terminale domein van Ryanodine Receptor vanaf Plutella xylostella (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Leer röntgencristallografie om de kristalstructuur van het N-terminale domein van de ryanodine-receptor van Plutella xylostella te bepalen. Deze methode onthult het mechanisme van kanaalregulatie en ondersteunt de ontwikkeling van soortspecifieke insecticiden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Financiering voor dit onderzoek werd verstrekt door: nationale sleutel onderzoek en ontwikkeling programma van China (2017YFD0201400, 2017YFD0201403), nationale aard Science Foundation van China (31320103922, 31230061) en Project van nationale basis (973) onderzoeksprogramma van China (2015CB856500, 2015CB856504). We zijn dankbaar voor het personeel op de beamline BL17U1 in Shanghai Synchrotron Radiation Facility (SSRF).

1. gen klonen, eiwit expressie en zuivering
<ol><li>PCR vergroot DNA overeenkomt met proteïne van belang (residuen 1-205 van DBM RyR, Genbank acc. Neen. AFW97408) en kloon in huisdier-28a-HMT vector door afbinding-onafhankelijke klonen (LIC)25. Deze vector bevat een tag histidine, MBP tag en een TEV protease breukzijde op de N-terminus15.
	<ol>
<li>NEDWEB / inleidingen voor versterking van doel gen met LIC-compatibele 5' extensies te ontwerpen: Voorwaartse LIC primer: 5' TACTTCCAATCCAATGCAATGGCGGAAGCGGAAGGGG 3' Omgekeerde LIC primer: 5' TTATCCACTTCCAATGTTATTATATGCCGGTCCCGTACGGC 3'</li>
		<li>Combineren van de reactie onderdelen (50 μl): 1 μL van DNA sjablonen (100 ng/μl), 1 μL van voorwaartse primer (10 μM), 1 μL van omgekeerde primer (10 μM), 0,5 μL van de polymerase van DNA (NEB), 5 μl van 10 x reactie buffer, 1 μL van dNTP (25 mM) , 40.5 μL van RNase gratis ddH2O.<ol>
<li>Plaats het reactiemengsel in een PCR-machine en voer het volgende programma.</li>
			<li>Incubeer bij 95 ° C gedurende 3 minuten en voer 30 cycli van (95 ° C gedurende 30 s, 58 ° C gedurende 15 s, 72 ° C gedurende 1 min). Incubeer bij 72 ° C gedurende 5 minuten en houd vervolgens bij 4 ° C.</li>
			<li>De hele reactie mix (50 μl) worden uitgevoerd op een 2% agarose gel en haal met een Gel extractie Kit. Volg protocol van de fabrikant.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Afbinding-onafhankelijke klonen (LIC)<ol>
<li>Uitvoeren van SspI spijsvertering (60 l): 20 μL van vector DNA (50 ng/l), 6 μL van 10 x 30 μL van ddH2O. Incubate bij 37 ° C gedurende 3 h. lopen de hele reactie reactie buffer en 4 μL van SspI mix op 1% agarose gel en uitpakken met een Gel extractie Kit. Volg protocol van de fabrikant.</li>
			<li>Uitvoeren van de Polymerase van DNA van T4 behandeling van de vector en invoegen van DNA. Combineren van het volgende: 5 μL van vector- of invoegen DNA (50 ng/l), 2 μL van 10 x T4 Polymerase van DNA Buffer, 1 μL van dGTP (25 mM) voor vector- of 1 μL van dCTP (25 mM) voor invoegen DNA, 1 μL van DTT (100 mM), 0.4 μL van T4 Polymerase van DNA (LIC-gekwalificeerd) , en 9.6 μL van ddH2O. Incubate reacties bij kamertemperatuur voor 40 min. inactivering van warmte enzym bij 75 ° C gedurende 20 min. Opmerking: De LIC vector en steek DNA moeten worden behandeld in aparte reacties.</li>
			<li>De LIC gloeien reactie uit te voeren. Combineren van het volgende: 2 μL van T4-behandelde invoegen DNA, 2 μL van T4-behandelde LIC vector DNA. Incubeer reactie bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transformeren van BL21 (DE3) E. coli cellen met deze recombinante plasmide.<ol>
<li>Ontdooi bevoegde cellen (50 μl in micro-centrifuge buis) op het ijs.</li>
		<li>Voeg ongeveer 1 l (50 ng) van plasmide in de buis. Meng de cellen en het DNA door zachtjes flicking de buis 2 tot 3 keer. Plaats de buis op ijs gedurende 20 minuten.</li>
		<li>Warmte schok bij 42 ° C voor 40 s. plaats de buis op ijs weer voor 2 min. Add 1 mL kamertemperatuur LB media aan de buis.</li>
		<li>Plaats de buis van het mengsel in de 250 rpm shaker bij 37 ° C gedurende 45 minuten verspreid 150-200 µL van het mengsel op de platen van de selectie. De plaat omkeren en na een nacht bebroeden bij 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kies een één kolonie en cultuur de cellen in 100 mL 2YT medium met 50 µg Mo/mL kanamycine bij 37 ° C's nachts. Volgende ochtend beënten 1 L 2YT medium met 50 µg Mo/mL kanamycine met 10 mL overnachting cultuur en incubeer in 37 ° C shaker incubator bij 250 omwentelingen per minuut, totdat de OD600 ~ 0.6 bereikt. Daarna de cultuur met IPTG om een eindconcentratie van 0,4 mM induceren en groeien voor een andere 5 h bij 30 ° C.</li>
	<li>Oogsten van de cellen door centrifugeren bij 8.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C, de cellen verzamelen en resuspendeer de cellen van elke 10 g in 40 mL lysis-buffermengsel (10 mM HEPES pH 7.4, 250 mM KCl, 10 mM β-mercaptoethanol, 25 μg/mL lysozym, 25 μg/mL DNase 1 mM PMSF).<ol>
<li>Verstoren met het ultrasoonapparaat bij 65% amplitude gedurende 8 minuten met 1 s op en 1 s af. Verwijderen van het puin van de cel door centrifugeren bij 40.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C. De bovendrijvende vloeistof filteren door het passeren van 0,22 μm filter en het laden in de lus van de steekproef.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zuiveren van de fusieproteïne, klieven van de tag en opnieuw zuiveren het doel-eiwit.<ol>
<li>Zuiveren van de fusieproteïne met Ni-NTA kolom (bindende buffer: 10 mM HEPES pH 7.4, 250 mM KCl; elutie buffer: 10 mM HEPES pH 7.4, 250 mM KCl, 500 mM imidazol) en te zuiveren door een zuiveringsinstallatie, met een lineair verloop van 20 – 250 mM imidazool.</li>
		<li>Klieven van de proteïne geëlueerd doel met TEV protease (1:50 verhouding) overnachting bij 4 ° C.</li>
		<li>Het reactiemengsel decollete zuiveren met behulp van amylose hars kolom (bindende buffer: 10 mM HEPES pH 7.4, 250 mM KCl; elutie buffer: 10 mM HEPES pH 7.4, 250 mM KCl, 10 mM maltose) en Ni-NTA kolom om de label en de TEV protease te verwijderen. De doel-proteïne zal worden in de Fractie doorstroming van deze twee kolommen.</li>
		<li>Dialyze van het monster tegen dialyse buffer (10 mM Tris-HCl pH 8,8, van 50 mM KCl, 10 mM β-mercaptoethanol om de zoutconcentratie. Zuiveren van het monster op een wisselingskolom anion (bindende buffer: 10 mM Tris-HCl pH 8,8, 10 mM β-mercaptoethanol; elutie buffer: 10 mM Tris-HCl pH 8,8, 1 M KCl, 10 mM β-mercaptoethanol) door een lineair verloop van 20-500 mM KCl in de buffer elutie.</li>
		<li>Als laatste stap in het zuiveringsproces, concentreer je het eiwit met centrifugaal concentrator (10 kDa MWCO) en injecteren in een Superdex 200 26/600 gel-filtratie kolom om te controleren de homogeniteit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het onderzoeken van de zuiverheid van het eiwit door het runnen van het op een 15% SDS pagina. Opmerking: Alle kolommen worden uitgevoerd op een eiwit zuivering systeem met een debiet van de binding van 2 mL/min, en een stroomsnelheid van de elutie van 4 mL/min met uitzondering van de gel-filtratie op 1 mL/min.</li>
</ol>2. eiwitten voorbereiding en kristallisatie
<ol><li>Het concentreren van het monster, gezuiverde eiwit tot 10 mg/mL met behulp van centrifugaal concentrator (10 kDa MWCO) en buffer uitwisseling aan kristallisatie buffer voordat u ze opslaat bij-80 ° C.</li>
	<li>Kristallisatie screening uitvoeren (1:1 verhouding, 200 nL van eiwit en 200 nL voor reservoir buffer) door de vergadering drop damp diffusie methode op 295 K met verschillende kristallisatie kits met behulp van een geautomatiseerde vloeistof handling robot systeem in een 96-Wells-indeling. Opmerking: We gebruikten kits van moleculaire afmetingen en Hampton onderzoek en de Gryphon geautomatiseerd liquid handling systeem.</li>
	<li>Verzegel de kristallisatie van de 96-wells-plaat ter voorkoming van verdamping en de evenwichtsinstelling van de daling van de eiwitten met het reservoir buffer inschakelen. Dan houden de platen in de incubator kristal bij 18 ° C.</li>
	<li>Controleer de 96-wells-platen die periodiek met behulp van een lichte Microscoop kristal vorming en groei te volgen.</li>
	<li>Gebruiken om te onderscheiden van eiwit kristallen van zoutkristallen, een eiwit kleurstof. Voeg 1 µL van kleurstof aan de daling van de doelgroep. Wacht ongeveer 1 h en observeren onder Microscoop. De eiwit-kristallen zal draaien blauw.</li>
	<li>De positieve kristallisatie voorwaarden (1,5 M ammoniumsulfaat, 0,1 M Tris pH 8,0) gebruiken voor het verder optimaliseren van de kristallen met behulp van hangende damp-diffusie methode drop in 24-Wells-platen.<ol>
<li>Optimaliseren pH van 7.0 tot 8,5 met 0,5 pH eenheidsinterval elke stap. Optimaliseren van concentratie van ammoniumsulfaat van 1,2 M tot 1,7 M met 0,1 M interval elke stap. (In ons geval was de beste conditie produceren grote plaat-vormige kristallen 0,1 M HEPES pH 7.0 en 1.6 M ammoniumsulfaat)</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Crystal montage, X-Ray gegevensverzameling en structuurbepaling
<ol><li>Mount kristallen in een cryoloop en flash-cool in vloeibare stikstof met reservoir oplossing met 20% glycerol als cryo-protectant. Plaats de kristallen in unipuck voor de opslag en het vervoer.</li>
	<li>Eiwit kristallen met behulp van een Rigaku in-house X-ray diffractor vooraf te controleren. Kies de beste degenen met de hoogste resoluties voor gegevensverzameling bij synchrotron faciliteiten (onze dataset werd bijeengezocht uit BL17U1 op Shanghai Synchrotron Radiation Facility).<ol>
<li>Gebruik de beamline besturingssoftware BluIce26 te monteren en de kristallen door automatische of handmatige centreren functie centreren. Posities van de test om te bepalen van de data collectie strategie, inclusief starten van hoek, belichtingstijd, detector afstand, framebreedte en getallen uitvoeren</li>
		<li>Dataset dienovereenkomstig verzamelen (we verzameld 180 frames met de breedte van het frame van de 1°, 1 s blootstellingstijd en de afstand van de detector van 350 mm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Index, integreren en schaal van de dataset met behulp van HKL2000 suite27. Eerst verricht de piek zoekfunctie om te vinden de diffractie vlekken, en vervolgens het indexeren van de vlekken en selecteert u de juiste ruimte-groep. Na de integratie van de piek, schalen van de dataset met het juiste fout model en sla het uitvoerbestand voor de .sca.</li>
	<li>De fase-probleem oplossen door moleculaire vervanging Phaser28 met PHENIX29.<ol>
<li>Bereken de mogelijke exemplaaraantal van eiwitmolecules in de asymmetrische eenheid door Xtriage30.</li>
		<li>Kijk voor de juiste structuur templates met hoge sequentie identiteit en structurele gelijkenis als het doel eiwit met behulp van de bekende structuren van literatuur of de modellen die zijn gegenereerd door structuur voorspelling server zoals Phyre231 (we gebruikten konijn RyR1 NTD als een zoek model, VOB-ID 2XOA).</li>
		<li>Uitvoeren van Phaser met behulp van de diffractie-gegevensbestand, het sjabloonbestand voor de structuur en het eiwit sequentie-bestand om de oplossing te vinden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voer AutoBuild32 in PHENIX29 voor het genereren van het eerste model met behulp van de output file van Phaser en het bestand van de reeks van de doel-eiwit.</li>
	<li>Handmatig de structuur te bouwen in de dichtheid van de gewijzigde experimentele elektron met behulp van Coot33 en verfijnen met behulp van phenix.refine34 in iteratieve cycli.</li>
	<li>Het uiteindelijke model met behulp van de validatiemiddelen in PHENIX18te valideren.</li>
</ol>

<ol><li>Giannini, G., Sorrentino, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+and+tissue+distribution+of+ryanodine+receptors+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Medicinal+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Molecular structure and tissue distribution of ryanodine receptors calcium channels.</a> Medicinal Research Reviews. 15 (4), 313-323 (1995).</li>
<li>Takeshima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+a+gene+for+a+ryanodine+receptor%2Fcalcium+release+channel+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of a gene for a ryanodine receptor/calcium release channel in Drosophila melanogaster.</a> FEBS Letters. 337 (1), 81-87 (1994).</li>
<li>Sattelle, D. B., Cordova, D., Cheek, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+ryanodine+receptors%3A+molecular+targets+for+novel+pest+control+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebrate+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Insect ryanodine receptors: molecular targets for novel pest control chemicals.</a> Invertebrate Neuroscience. 8 (3), 107-119 (2008).</li>
<li>Steinbach, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geographic+spread%2C+genetics+and+functional+characteristics+of+ryanodine+receptor+based+target-site+resistance+to+diamide+insecticides+in+diamondback+moth%2C+Plutella+xylostella%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Geographic spread, genetics and functional characteristics of ryanodine receptor based target-site resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 63, 14-22 (2015).</li>
<li>Wang, X., Khakame, S. K., Ye, C., Yang, Y., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+field-evolved+resistance+to+chlorantraniliprole+in+the+diamondback+moth%2C+Plutella+xylostella%2C+from+China%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Characterisation of field-evolved resistance to chlorantraniliprole in the diamondback moth, Plutella xylostella, from China.</a> Pest Management Science. 69 (5), 661-665 (2013).</li>
<li>Liu, X., Wang, H. Y., Ning, Y. B., Qiao, K., Wang, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+Selection+and+Characterization+of+Chlorantraniliprole+Resistance+in+Plutella+xylostella+%28Lepidoptera%3A+Plutellidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Economic+Entomology%22%5BJournal%5D)">Resistance Selection and Characterization of Chlorantraniliprole Resistance in Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae).</a> Journal of Economic Entomology. 108 (4), 1978-1985 (2015).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+a+point+mutation+in+the+ryanodine+receptor+of+Plutella+xylostella+%28L.%29+associated+with+resistance+to+chlorantraniliprole%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of a point mutation in the ryanodine receptor of Plutella xylostella (L.) associated with resistance to chlorantraniliprole.</a> Pest Management Science. 70 (7), 1083-1089 (2014).</li>
<li>Troczka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+diamide+insecticides+in+diamondback+moth%2C+Plutella+xylostella+%28Lepidoptera%3A+Plutellidae%29+is+associated+with+a+mutation+in+the+membrane-spanning+domain+of+the+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) is associated with a mutation in the membrane-spanning domain of the ryanodine receptor.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (11), 873-880 (2012).</li>
<li>Roditakis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+receptor+point+mutations+confer+diamide+insecticide+resistance+in+tomato+leafminer%2C+Tuta+absoluta+%28Lepidoptera%3A+Gelechiidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Ryanodine receptor point mutations confer diamide insecticide resistance in tomato leafminer, Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae).</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 80, 11-20 (2017).</li>
<li>Borko, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+human+RyR2+N-terminal+region+involved+in+cardiac+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the human RyR2 N-terminal region involved in cardiac arrhythmias.</a> Acta Crystallographica Section D. 70 (Pt 11), 2897-2912 (2014).</li>
<li>Sharma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determination+of+the+phosphorylation+domain+of+the+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural determination of the phosphorylation domain of the ryanodine receptor.</a> FEBS Journal. 279 (20), 3952-3964 (2012).</li>
<li>Kimlicka, L., Lau, K., Tung, C. C., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+mutations+in+the+ryanodine+receptor+N-terminal+region+couple+to+a+mobile+intersubunit+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Disease mutations in the ryanodine receptor N-terminal region couple to a mobile intersubunit interface.</a> Nature Communications. 4, 1506(2013).</li>
<li>Lau, K., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+wild+type+and+disease+mutant+forms+of+the+ryanodine+receptor+SPRY2+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of wild type and disease mutant forms of the ryanodine receptor SPRY2 domain.</a> Nature Communications. 5, 5397(2014).</li>
<li>Amador, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+type+I+ryanodine+receptor+amino-terminal+beta-trefoil+domain+reveals+a+disease-associated+mutation+%26%2334%3Bhot+spot%26%2334%3B+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation &#34;hot spot&#34; loop.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).</li>
<li>Lobo, P. A., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+the+N-terminal+domains+of+cardiac+and+skeletal+muscle+ryanodine+receptors%3A+insights+into+disease+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of the N-terminal domains of cardiac and skeletal muscle ryanodine receptors: insights into disease mutations.</a> Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).</li>
<li>des Georges, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Basis+for+Gating+and+Activation+of+RyR1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural Basis for Gating and Activation of RyR1.</a> Cell. 167 (1), 145-157 (2016).</li>
<li>Efremov, R. G., Leitner, A., Aebersold, R., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+and+conformational+switch+mechanism+of+the+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Architecture and conformational switch mechanism of the ryanodine receptor.</a> Nature. 517 (7532), 39-43 (2015).</li>
<li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+gating+mechanism+of+the+type+2+ryanodine+receptor+RyR2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the gating mechanism of the type 2 ryanodine receptor RyR2.</a> Science. 354 (6310), (2016).</li>
<li>Wei, R. S., et al. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/cr201699">Structural insights into Ca2+-activated long-range allosteric channel gating of RyR1.</a> Cell Research. 26 (9), 977-994 (2016).</li>
<li>Yan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+rabbit+ryanodine+receptor+RyR1+at+near-atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the rabbit ryanodine receptor RyR1 at near-atomic resolution.</a> Nature. 517 (7532), 50-55 (2015).</li>
<li>Zalk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+mammalian+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a mammalian ryanodine receptor.</a> Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).</li>
<li>Furlong, M. J., Wright, D. J., Dosdall, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diamondback+moth+ecology+and+management%3A+problems%2C+progress%2C+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Diamondback moth ecology and management: problems, progress, and prospects.</a> Annual Review of Entomology. 58, 517-541 (2013).</li>
<li>Amador, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+type+I+ryanodine+receptor+amino-terminal+beta-trefoil+domain+reveals+a+disease-associated+mutation+%26%2334%3Bhot+spot%26%2334%3B+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation &#34;hot spot&#34; loop.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).</li>
<li>Lobo, P. A., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structures+of+the+N-Terminal+Domains+of+Cardiac+and+Skeletal+Muscle+Ryanodine+Receptors%3A+Insights+into+Disease+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal Structures of the N-Terminal Domains of Cardiac and Skeletal Muscle Ryanodine Receptors: Insights into Disease Mutations.</a> Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).</li>
<li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+%28LIC-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).</li>
<li>Stepanov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JBluIce-EPICS+control+system+for+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">JBluIce-EPICS control system for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D. 67 (3), 176-188 (2011).</li>
<li>Minor, W., Cymborowski, M., Otwinowski, Z., Chruszcz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HKL-3000%3A+the+integration+of+data+reduction+and+structure+solution--from+diffraction+images+to+an+initial+model+in+minutes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">HKL-3000: the integration of data reduction and structure solution--from diffraction images to an initial model in minutes.</a> Acta Crystallographica Section D. 62 (Pt 8), 859-866 (2006).</li>
<li>McCoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phaser+crystallographic+software%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Phaser crystallographic software.</a> Journal of Applied Crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li>
<li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENIX%3A+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).</li>
<li>Zwart, P. H., Gross-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. <a target="_blank" href="http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/download?doi=10.1.1.378.2281&rep=rep1&type=pdf">Xtriage and Fest: Automatic assessment of X-ray data and substructure structure factor estimation.</a> CCP4 Newsletter. (43), 27-35 (2005).</li>
<li>Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Phyre2+web+portal+for+protein+modeling%2C+prediction+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis.</a> Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).</li>
<li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+model+building%2C+structure+refinement+and+density+modification+with+the+PHENIX+AutoBuild+wizard%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard.</a> Acta Crystallographica Section D. 64 (Pt 1), 61-69 (2008).</li>
<li>Emsley, P., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coot%3A+model-building+tools+for+molecular+graphics%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">Coot: model-building tools for molecular graphics.</a> Acta Crystallographica Section D. 60, 2126-2132 (2004).</li>
<li>Afonine, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+automated+crystallographic+structure+refinement+with+phenix.refine%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine.</a> Acta Crystallographica Section D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).</li>
<li>Lin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+ryanodine+receptor+N-terminal+domain+from+Plutella+xylostella+reveals+two+potential+species-specific+insecticide-targeting+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of ryanodine receptor N-terminal domain from Plutella xylostella reveals two potential species-specific insecticide-targeting sites.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 73-83 (2018).</li>
<li>Qi, S., Casida, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+differences+in+chlorantraniliprole+and+flubendiamide+insecticide+binding+sites+in+the+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Pesticide+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Species differences in chlorantraniliprole and flubendiamide insecticide binding sites in the ryanodine receptor.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 321-326 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit artikel beschrijven we de procedure om te recombinantly express, zuiveren, kristalliseren en bepalen de structuur van de DBM RyR NTD. Voor de kristallisatie is een cruciale eis te verkrijgen van eiwitten met hoge oplosbaarheid, zuiverheid en homogeniteit. In ons protocol, we gekozen voor het huisdier-28a-HMT vector gebruiken omdat het bevat een hexahistidine tag en MBP tag, die beide kunnen worden gebruikt voor de zuivering te verkrijgen van een hogere zuiverheid van de vouw. Bovendien, de MBP Label aids in de opl...

Ryanodine receptoren (RyRs) zijn specifieke ionenkanalen, die de permeatie van Ca2 + ionen in de membranen van sarcoplasmic reticulum (SR) in spiercellen bemiddelen. Daarom spelen ze een belangrijke rol in de excitatie-contractie koppeling proces. In zijn functionele vorm, assembleert RyR als een homo-tetrameer met een molecuulmassa van > 2 MDa, met elke subeenheid bestaande uit ~ 5000 aminozuurresidu's. Bij zoogdieren, er zijn drie isoforms: skeletspieren type RyR1 -, RyR2 - type van de hartspier en RyR3-overal uitgedrukt in verschillende weefsels en1.
Bij insecten is er slechts één soort RyR, die wordt uitgedrukt in spier- en zenuwstelsel weefsel2. Insect RyR is meer vergelijkbaar met zoogdieren RyR2 met de identiteit van een reeks van ongeveer 47%3. Diamide insecticiden gericht op RyR van Lepidoptera en kevers zijn ontwikkeld en verkocht door grote bedrijven zoals Bayer (flubendiamide), DuPont (chlorantraniliprole) en Syngenta (cyantraniliprole). Sinds de relatief recente lancering, diamide insecticiden uitgegroeid tot een van de snelst groeiende klasse van insecticiden. Op dit moment hebben de verkoop van deze drie insecticiden jaarlijks 2 miljard Amerikaanse dollars met een groeitempo op jaarbasis van meer dan 50% overschreden sinds 2009 (Agranova).
Recente studies hebben melding gemaakt van resistentie bij insecten na een paar generaties van gebruik van deze insecticiden4,5,6,7,8. De weerstand mutaties in de transmembrane domein van RyRs vanaf Plutella xylostella (G4946E, I4790M), de koolmot (DBM) en de overeenkomende posities in tomaat trechtervallen, Tuta absoluta (G4903E, I4746M) blijkt dat de regio zou kunnen zijn die betrokken zijn bij diamide insecticide bindend, aangezien deze regio is bekend om zijn cruciaal voor het gating van het kanaal4,8,9. Ondanks uitgebreid onderzoek op dit gebied blijven de exacte moleculaire mechanismen van diamide insecticiden elusive. Bovendien is het onduidelijk of de weerstand mutaties van invloed zijn op de interacties met diamides direct of allosterically.
Eerdere studies hebben melding gemaakt van de structuur van verschillende RyR domeinen van soorten zoogdieren en de structuur van full-length zoogdieren RyR1 en RyR2 door middel van röntgendiffractie en cryo-elektronenmicroscopie, respectievelijk10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Maar tot nu toe geen structuur van insect RyR heeft gemeld, dat verbiedt ons begrip van de moleculaire fijne kneepjes van de receptor functie en de moleculaire mechanismen van insecticide actie en ontwikkeling van insecticide-resistentie.
In dit manuscript presenteren wij een veralgemeende protocol voor de structurele karakterisering van N-terminale β-klaverblad domein van ryanodine receptor van de koolmot, een vernietigende plaag kruisbloemige gewassen wereldwijd22infecteren. De constructie is ontworpen volgens de gepubliceerde konijn RyR1 NTD crystal structuren23,24en de cryo-EM structurele modellen16,17,18,19, 20 , 21. Dit is de eerste met een hoge resolutie structuur gerapporteerd voor insect RyR, die onthult het mechanisme voor het kanaal gating en een belangrijke sjabloon voorziet in de ontwikkeling van soortspecifieke insecticiden gebruik structuur gebaseerde drug design. Voor de opheldering van de structuur werkzaam wij middel van röntgendiffractie, die wordt beschouwd als de 'gouden standaard' voor eiwit structuurbepaling bij in de buurt van atomaire resolutie. Hoewel de kristallisatie proces onvoorspelbaar en arbeidsintensief is, helpt dit stapsgewijze protocol onderzoekers express, zuiveren en karakteriseren van andere domeinen van insect RyR of elke andere eiwitten in het algemeen.

<table><tbody><tr><td>pET-28a-HMT vector</td><td></td><td></td><td>Deze gemodificeerde pET-vector bevat een hexahistidine-tag, een MBP-fusie-eiwit en een TEV-protease-splitsingsplaats aan het N-uiteinde (Lobo en Van Petegem, 2009)</td></tr><tr><td>E. coli BL21 (DE3) stam</td><td>Novagen</td><td>69450-3CN</td><td></td></tr><tr><td>HisTrapHP kolom (5 mL)</td><td>GE Healthcare</td><td>45-000-325</td><td></td></tr><tr><td>Amylose hars kolom</td><td>New England Biolabs</td><td>E8021S</td><td></td></tr><tr><td>Q Sepharose hoge prestatie kolom&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1154-01</td><td></td></tr><tr><td>Amicon concentrators (10 kDa MWCO)</td><td>Millipore</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 26/600 gel-filtratie kolom&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9893-36</td><td></td></tr><tr><td>Geautomatiseerd robotsysteem voor vloeistoffen &nbsp;</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>Gryphon</td><td></td></tr><tr><td>96 Well CrystalQuick</td><td>Greiner bio-one</td><td>82050-494</td><td></td></tr><tr><td>Uni-Puck</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD7-601</td><td></td></tr><tr><td>Gemonteerde CryoLoop - 20 micron</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-955</td><td></td></tr><tr><td>CryoWand</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD7-411</td><td></td></tr><tr><td>Puck dewar laadtool</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD7-607</td><td></td></tr><tr><td>Nano drop</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop One</td><td></td></tr><tr><td>Kristal incubator</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD5-605</td><td></td></tr><tr><td>X-Ray diffractor</td><td>Rigaku</td><td>FRX</td><td></td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>Eppendorf</td><td>Nexus GX2</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid mini-prep kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Gel extractie kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>SspI restrictie-endonuclease</td><td>NEB</td><td>R0132S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA polymerase</td><td>Novagen</td><td>2868713</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Scientific Chemical</td><td>25389940</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Genview</td><td>367931</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Genview</td><td>7365459</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Genview</td><td>60242</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall LYNX 6000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sonnicator</td><td>Scientz</td><td>II-D</td><td></td></tr><tr><td>Eiwit zuiveringssysteem</td><td>GE Healthcare</td><td>Akta Pure</td><td></td></tr><tr><td>Lichtmicroscoop</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>IzIt kristalverf</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-710</td><td></td></tr><tr><td>Elektroforese unit</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005EDU</td><td></td></tr><tr><td>Shaker Incubator</td><td>Zhicheng</td><td>ZWYR-D2401</td><td></td></tr><tr><td>Index kristalscherm</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td></td></tr><tr><td>Structuur kristalscherm</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD1-01</td><td></td></tr><tr><td>ProPlex kristalscherm</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD1-38</td><td></td></tr><tr><td>PACT premier kristalscherm</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD1-29</td><td></td></tr><tr><td>JCSG-plus kristalscherm</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD1-37</td><td></td></tr></tbody></table>

kristalstructuur van de n-terminale domein van ryanodine receptor vanaf plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Ontwikkeling van krachtige en efficiënte insecticiden gericht op insecten ryanodine receptoren (RyRs) is van groot belang op het gebied van landbouw ongediertebestrijding. Tot op heden verschillende diamide insecticiden gericht op pest die ryrs hebben op de markt zijn gebracht, die genereren jaarlijkse inkomsten van 2 miljard VS‑dollar. Maar begrip van het werkingsmechanisme van RyR-targeting insecticiden is beperkt door het gebrek aan structurele informatie met betrekking tot insect RyR. Dit beperkt op zijn beurt inzicht in de ontwikkeling van insecticide resistentie in ongedierte. De koolmot (DBM) is een vernietigende plaag vernietigen kruisbloemige gewassen wereldwijd, die is ook gemeld om te laten zien van de weerstand tegen diamide insecticiden. Het is daarom van groot praktisch belang om roman insecticiden gericht op de DBM RyR, vooral gericht op een regio verschilt van de traditionele diamide bindende site. Hier presenteren we een protocol structureel karakteriseren het N-terminaal gebied van RyR van DBM. De kristalstructuur x-ray werd opgelost door moleculaire vervanging bij een resolutie van 2,84 Å, die toont een bèta-klaverblad opvouwbare motief en een begeleidende alpha-helix. Dit protocol kan worden aangepast voor de expressie, zuivering en structurele karakterisering van andere domeinen of eiwitten in het algemeen.

Zuivering
Het domein van de N-terminal van DBM RyR werd uitgedrukt als een fusieproteïne met een hexahistidine-label, een MBP-tag en de breukzijde van een TEV protease. We hebben gevolgd een strategie van de zuivering van de vijf stappen om te verkrijgen van een zeer zuivere eiwit, geschikt voor kristallisatie doel. Aanvankelijk was de fusieproteïne gezuiverd van de oplosbare fractie van cel lysate door Ni-NTA kolom (HisTrap HP). V...

In dit artikel beschrijven we de protocollen van eiwit expressie, zuivering, kristallisatie en structuur vastberadenheid van het domein van de N-terminal van de ryanodine receptor van de koolmot (Plutella xylostella).

Kristalstructuur van de N-terminale domein van Ryanodine Receptor vanaf Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Het oplossen van de structuur van de ryanodine receptor domein kan helpen met ons begrip van het moleculaire mechanisme van de eiwitfunctie, insecticide actie, en insecticide resistentie ontwikkeling. Deze maatregel impliceert het gebruik van röntgenkristallografie voor structuurillustratie, die wordt beschouwd als een gouden standaard voor de bepaling van de eiwitstructuur bij bijna-atoomresolutie. Deze hoge resolutie structuur van het insect ryanodine receptor domein onthult het mechanisme van kanaal gating en biedt een belangrijk sjabloon voor de ontwikkeling van soorten-specifieke insecticiden met behulp van structuur-gebaseerde drug design benaderingen.Over het algemeen, individuen nieuw op deze methode zal worstelen, omdat potentiële eiwit kristallografen moeten bedreven zijn in biochemie, biofysica, informatica, en wiskunde. Begin met het versterken van het DNA dat overeenkomt met het eiwit van belang door polymerase kettingreactie. Aan het einde van de reactie, voer de gehele 50 microliter van reactie mix op een 2%agarose gel, en extract het DNA met een gel extractie kit volgens de standaard protocollen.Vervolgens lineariseren de LIC vector DNA door het mengen van 20 microliter van de vector DNA met 6 microliters van 10X reactiebuffer en 4 microliters van SspI beperking enzym in 30 microliter van dubbel gedestilleerd water. Broed dit reactiemengsel drie uur lang uit bij 37 graden Celsius. Voer aan het einde van de incubatie de gehele reactiemix uit op een 1%agarosegel, gevolgd door extractie van het lineair gecoriseerde vector-DNA met een gelextractiekit volgens de instructies van de fabrikant.Voer vervolgens afzonderlijke T4 DNA polymerase behandelingen uit op 5 microliter van het lineair gemutiseerde vector-DNA en het PCR-versterkte insert-DNA, volgens standaardprotocollen. Incubeer gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door 20 minuten enzymwarmte-inactivatie bij 75 graden Celsius. Voer de ligatie-onafhankelijke kloononale reactie uit door 2 microliter van het met T4 behandelde insert-DNA te combineren met 2 microliters van het met T4 behandelde LIC-vector-DNA voor een incubatie van 10 minuten bij kamertemperatuur.Om BL21(DE3)E. Coli cellen te transformeren met de recombinant plasmid, ontdooi 50 microliter van bevoegde cellen op ijs en voeg ongeveer 1 microliter van de geannealed plasmid aan de buis. Veeg de buis twee tot drie keer om de cellen en het DNA te mengen en plaats de buis 20 minuten terug op ijs.Aan het einde van de incubatie, warmte-shock de cellen op 42 graden Celsius gedurende 40 seconden, gevolgd door twee minuten terug op ijs. Voeg vervolgens een milliliter kamertemperatuur LB medium aan de buis, en plaats de cellen op een 250 RPM shaker gedurende 45 minuten op 37 graden Celsius. Aan het einde van de schudden incubatie, plaat 150 tot 200 microliter van dit mengsel op selectieplaten, en omkeren de platen 's nachts op 37 graden Celsius.De volgende dag, cultuur een enkele kolonie in 100 milliliter van 2-YT medium, aangevuld met kanamycine, in een shaker incubator op 37 graden Celsius 's nachts. De volgende ochtend, inenting een liter 2-YT medium, aangevuld met kanamycine, met 10 milliliter van 's nachts cultuur, en incubeer op 37 graden Celsius met schudden tot de OD600 lezing bereikt ongeveer 0,6. Dan, induceren de cultuur met IPTG tot een laatste concentratie van 0,4 millimolar, en groeien de cellen gedurende vijf uur op 30 graden Celsius.Aan het einde van de incubatie, oogst de cellen door centrifugatie, en opnieuw schorsen de pellet tot een 10 gram bacteriën per 40 milliliter lyse buffer concentratie. Verstoor de celwanden door sonicatie bij een 65%amplitude, en een seconde op een seconde af, gedurende acht minuten. Verwijder het celpuin door centrifugatie.Vervolgens filtert u de supernatant via een filter van 22 micrometer en laadt u de oplossing in een monsterlus. Om het fusie-eiwit te zuiveren, injecteer je de gefilterde supernatant uit de monsterlus in een vijf milliliter nikkel-nitrolotriacetische kolom op een zuiveringssysteem met een lineair verloop van 20 tot 250 millimolar imidazool. Kleef het geëuterde doeleiwit met tabakseinlaatprotease, bij een verhouding van 1 tot 50, 's nachts bij 4 graden Celsius, en zuiver het decolletéreactiemengsel op een amylose harskolom en een nikkel-nitrolotriacetische kolom om de tag en het tabakse virus protease te verwijderen.Dialyseer de doorstroom van de nikkel-nitrolotriacetische kolom tegen dialysebuffer om de zoutconcentratie te verminderen en zuiver het monster op een anionwisselkolom met een lineair verloop van 20 tot 500 millimolar kaliumchloride in de elutiebuffer. Concentreer het eiwit vervolgens in een centrifugale concentrator. Injecteer het geconcentreerde eiwit in een Superdex 200 26/600 gelfiltratiekolom om de homogeniteit te controleren en beoordeel de zuiverheid van het eiwit met 15% SDS-PAGE.Om het eiwit voor te bereiden op kristallisatie, concentreer het gezuiverde eiwitmonster tot 10 milligram per milliliter in de centrifugale concentrator en bufferuitwisseling naar kristallisatiebuffer vóór 80 graden Celsius opslag. Om kristallisatie screening uit te voeren, gebruik maken van de zitdruppel damp diffusie methode op 295 Kelvin, met verschillende kristallisatie kits, en een geautomatiseerde vloeistof-handling systeem in een 96-well formaat. Verzegel aan het einde van de druppelinstelling de 96-put kristallisatieplaat om verdamping te voorkomen en om de evenwicht van de eiwitval in de reservoirbuffer mogelijk te maken.Plaats de platen in een kristallen couveuse op 18 graden Celsius. Controleer de platen periodiek onder een lichtmicroscoop om de kristalvorming en groei te controleren. Om de eiwitkristallen van de zoute kristallen te onderscheiden, voeg één microliter eiwitkristalverf toe aan de doeldaling, en observeer de kristallen onder de microscoop na één uur.De eiwitkristallen zullen blauw lijken. Om de kristallen verder te optimaliseren, gebruik maken van de positieve kristallisatie voorwaarden en de opknoping druppel damp diffusie methode in 24-well platen, gevolgd door incubatie in het kristal incubator op 18 graden Celsius. Om de eiwitstructuur te bepalen, monteer je de kristallen op een cryoloop onder een lichtmicroscoop voor flashkoeling in vloeibare stikstof en plaats je de kristallen in een unibuck voor opslag en transport.Screen de kristallen vooraf in een röntgendifractor in eigen huis, met behulp van de handmatige centreringfunctie om de kristallen te monteren en te centreren. Gebruik vervolgens de röntgendiffractiesoftware om de gegevens te verzamelen. Als u de gegevensset wilt indexeren, integreren en schalen, moet u eerst met de HKL-2000-suite de detector selecteren en de gegevensset laden.Voer vervolgens de piekzoekfunctie uit om de diffractieplekken te vinden. Indexer de vlekken, selecteer de juiste ruimtegroep en voer piekintegratie uit. Schaal vervolgens de gegevensset.Pas het foutmodel aan en schaal opnieuw. Sla het sca-bestand voor uitvoer op. Maak een nieuw project om de structuur te bepalen met behulp van Phenix-softwaresuite.Voer eerst Extriage uit met het sca-bestand om het mogelijke kopieeraantal eiwitmoleculen in de asymmetrische eenheid te berekenen. Vervolgens, om de fase probleem op te lossen door moleculaire vervanging, run Phaser, met behulp van de diffractie gegevensbestand, de sjabloon structuur bestand met een hoge sequentie identiteit en structurele gelijkenis als het doel eiwit, en de eiwit sequentie bestand, om de oplossing te vinden. Voer automatisch inbouwen in Phenix uit om het oorspronkelijke model te genereren, met behulp van het uitvoerbestand van Phaser en het sequentiebestand van het doeleiwit.Handmatig bouwen van de structuur in de gewijzigde experimentele elektronendichtheid met behulp van COOT, en verfijnen met behulp van Phenix verfijnen in iteratieve cycli. Valideer het uiteindelijke model met behulp van de validatietools in Phenix. In dit representatieve experiment leverde de zuivering van het eindterminaldomein van het diamantrugmot ryanodine receptoreiwit, zoals aangetoond, een enkele band op ongeveer 21 kilodaltons door STS-PAGE analyse.Het elutievolume van de gelfiltratiekolom bevestigde dat het gezuiverde ryanodine receptor end-terminal domein een monomeer was. Voor kristallisatie was de meest optimale omstandigheden waaronder hoogwaardige plaatvormige kristallen werden gevormd in aanwezigheid van 1 molaire HEPES van een pH van 7 en 1,6 molar ammoniumsulfaat. Bepaling van de eiwitstructuur van de diffractie dataset met behulp van software zoals aangetoond bleek de diamondback mot ryanodine receptor end-terminal domein voor residuen 1 tot en met 205.Eiwitten met een grote aandoening, flexibele regio's, of met zwakke affiniteiten zijn een uitdaging om te kristalliseren. In deze scenario's, eiwit engineering strategieën zoals oppervlakte-entropie reductie, lus truncation, en cross-linking, kan de kans op het verkrijgen van betere eiwitkristallen. Naast het onthullen van eiwitstructuren met hoge resolutie, kan röntgenkristallografie ook worden gebruikt om eiwit-pesticideninteracties te bestuderen, wat kan helpen bij het ontwerp van op structuur gebaseerde pesticiden.

crystal-structure-n-terminal-domain-ryanodine-receptor-from-plutella

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dit artikel beschrijft de cryo-elektronenmicroscopie-methodologie, die wordt gebruikt om hoogwaardige microscopische beelden van macromoleculen in hun bijna-native toestand te verkrijgen. De methode levert beelden op die geschikt zijn voor verdere computerverwerking met behulp van de single particle-benadering, bedacht om de 3D-reconstructie van een macromolecuul te genereren.

Do&#39;s en Don&#39;ts van cryo-elektronenmicroscopie: A Primer op Monstervoorbereiding en hoge kwaliteit Data Collection voor Macromolecular 3D Wederopbouw

β-vat buitenmembraaneiwitten (OMP's) hebben veel functies binnen de buitenmembraan van gramnegatieve bacteriën, mitochondriën en chloroplasten. Hier hopen we een bekende knelpunt in structurele studies te verlichten door protocollen te presenteren voor de productie van β-vat OMP's in voldoende hoeveelheden voor structuurbepaling door röntgenkristallografie of NMR-spectroscopie.

Van Constructen naar Crystals - Naar Structuur Bepaling van β-barrel Outer Membrane Proteins

Hier beschrijven we een werkwijze uit te drukken en te zuiveren uitstekende kwaliteit norovirus (P) domeinen in E. coli voor röntgen- kristallografie studies. Deze methode kan worden toegepast op andere calicivirus P domeinen, alsmede niet-structurele eiwitten, bijv., Viraal eiwit-gekoppelde genoom (VPG), protease en RNA-afhankelijke RNA-polymerase (RdRp).

De productie van de mens Norovirus uitstekende Domeinen in<em&gt; E. coli</em&gt; Voor röntgenkristallografie

Oligomerisatie van de ryanodine receptor, een homo-tetramer ionkanaal dat Ca2+ vrijmaakt uit intracellulaire opslag, is cruciaal voor skeletspier- en hartspiercontractie. Hier presenteren we complementaire in vivo en in vitro methoden om eiwit-zelfassociatie te detecteren en homo-oligomeer stoichiometrie te bepalen.

Genetische en biochemische benaderingen voor<em&gt; In Vivo</em&gt; en<em&gt; In Vitro</em&gt; Evaluatie van Protein Oligomerisatie: De ryanodinereceptor Case Study

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is een uitgescheiden metalloprotease en veelbelovend geneesmiddel-doelwit van de humane ziekteverwekker Clostridium difficile. Hier beschrijven we alle methoden die nodig zijn voor de productie en structuurbepaling van dit eiwit.

Productie, kristallisatie en structuur bepalen van<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 via Microseeding en zink-SAD

Dit protocol beschrijft technieken gebruikt om te bepalen van ion kanaal structuren door cryo-elektronenmicroscopie, met inbegrip van een systeem van de baculovirus gebruikt om genen in zoogdiercellen met minimale inspanning en toxiciteit, eiwit winning, zuivering, efficiënt en kwaliteit controleren, Raster monstervoorbereiding en screening, evenals gegevensverzameling en verwerking.

Meningsuiting en zuivering van de TRPC3 mens lipide-gevoelige catie kanaal voor structurele bepaling door Single-deeltje Cryo-elektronenmicroscopie

We beschrijven protocollen voor de structuurbepaling van het IKK-bindende domein van NEMO door Röntgen kristallografie. De methoden omvatten eiwit expressie, zuivering en karakterisering, evenals strategieën voor succesvolle kristal optimalisatie en structuurbepaling van het eiwit in zijn ongebonden vorm.

Productie, kristallisatie en structuurbepaling van het IKK-bindende domein van NEMO

Dit protocol is ontwikkeld om de dimer-dodecamer overgang van TmPep1050, een M42 aminopeptidase, op structureel niveau te bestuderen. Het is een eenvoudige pijplijn vanaf eiwitzuivering tot röntgengegevensverwerking. Crystallogenesis, data set indexatie, en moleculaire vervanging zijn benadrukt door middel van een geval van studie, TmPep1050H60A H307A variant.

X-Ray Kristallografie om de oligomerische staat overgang van de Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050 studie

Hier worden methoden beschreven die worden gebruikt om het functionele effect van RYR1-mutaties te bestuderen die endogeen tot expressie komen in epstein barr-virus vereeuwigde menselijke B-lymfocyten en spierbiopsie afgeleide satellietcellen gedifferentieerd in myotubes.

Functionele karakterisering van endogene uitgedrukte menselijke RYR1-varianten

Dit protocol introduceert de tools die beschikbaar zijn voor het modelleren van liganden van kleine moleculen in cryoEM-kaarten van macromoleculen.

Liganden modelleren in kaarten afgeleid van elektronencryomicroscopie

Leer röntgencristallografie om de kristalstructuur van het N-terminale domein van de ryanodine-receptor van Plutella xylostella te bepalen. Deze methode onthult het mechanisme van kanaalregulatie en ondersteunt de ontwikkeling van soortspecifieke insecticiden.

Kristalstructuur van de N-terminale domein van Ryanodine Receptor vanaf Plutella xylostella

Meer video's verkennen