Met behulp van optische coherentie tomografie en Optokinetic reactie als structurele en functionele visuele systeem uitlezingen in muizen en ratten
January 10th, 2019
Een gedetailleerd protocol voor de beoordeling van structurele en visuele uitlezingen bij knaagdieren door optische coherentie tomografie en optokinetic reactie wordt gepresenteerd. De resultaten bieden waardevolle inzichten voor oogcontrole, alsmede neurologische onderzoek.
Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neurologie en oogheelkunde, en helpen bij het evalueren van een grote verscheidenheid aan retinopathieën en netvliesmanifestaties in verschillende knaagdiermodellen. Het belangrijkste voordeel van deze technieken is dat niet-invasieve longitudinale onderzoeken kunnen worden uitgevoerd, waardoor de variabiliteit wordt verminderd en het aantal dieren dat nodig is voor de experimenten wordt verminderd. Deze methoden maken kwantitatief in vivo onderzoek van structuur en functie mogelijk die kunnen worden gebruikt om de pathologische omstandigheden te onderzoeken, of om het potentiële nut van nieuwe therapieën te evalueren.
Echter, vooral de toepassing van optische coherentie tomografie technologie in knaagdier modellen is nog steeds uitdagend, vooral vanwege de kleine ooggrootte. Het aantonen van de procedures zal worden Michael Dietrich, een promovendus uit ons laboratorium. Na het verdoven van het knaagdier, breng een druppel Fenylephrine Tropicamide op elk oog voor pupillary dilatatie.
Veeg elke overtollige oogdruppel nat na een minuut. En smeer de ogen methylcellulose op basis van oogheelkundige gel om te voorkomen dat uitdrogen van het oog en het creëren van een troebel hoornvlies. Gebruik vervolgens tangen om een aangepaste contactlens op het oog te plaatsen.
Druk op de knop Start in de rechterhoek van het weergave van het bedieningspaneel om de acquisitiemodus te starten. Vervolgens, om het linkeroog te beeld, plaats de houder om ervoor te zorgen dat de linker oogbol van het knaagdier naar de camera kijkt. Stel het filterniveau in op R en selecteer BR en OCT voor blauwe reflecties fundus imaging en B-scan acquisitie in de software.
Stel vervolgens de scherpstelafstand in op ongeveer 38 diopters, met behulp van de focusknop op de achterkant van de camera. En zoom in op het netvlies, totdat de OCT-scan zichtbaar is op het scherm. Om vervolgens een straalpad door het midden van de pupil te garanderen, met een orthogonale hoek van het netvlies in alle vlakken, plaatst u de optische schijf in het midden van het verlichte veld.
En pas de horizontale en verticale lijn B-scans aan op een horizontaal niveau door de houder te draaien. Selecteer op het softwarescherm de volumescanmodus en stel deze in op 25 B-scans in hoge resolutiemodus op 50 automatische real-time tracking. Centreer het midden van het volumescanraster op de optische schijf en begin met acquisitie door op de zwarte gevoeligheidsknop te drukken en vervolgens Op het bedieningspaneel te verwerven.
Nadat de overname is voltooid, stelt u het filterniveau in op A.Select Blue Autofluorescentie op het bedieningspaneel. En pas de helderheid van het beeld aan met de gevoeligheidsknop. Druk op de gevoeligheidsknop en verwerf vervolgens fluorescerende cellen of autofluorescerende afzettingen.
Voor analyse van de volumescans wordt de geautomatiseerde segmentatie van de software van het OCT-apparaat gebruikt door met de rechtermuisknop op de scan te klikken. En selecteer Segmentatie, vervolgens Alle lagen. Voer handmatige correctie van de lagen uit door dubbel te klikken op de gewenste scan.
Selecteer Dikteprofiel. En klik op Layer Segmentations bewerken. Selecteer één laag tegelijk.
En indien nodig corrigeer de groene lijn door het verplaatsen van de rode stippen door te slepen en te laten vallen naar de juiste positie. Selecteer vervolgens het tabblad Diktekaart. Kies het ETDRS-raster van 1, 2, 3 millimeter.
Centreer de binnenste cirkel op de optische schijf. Bereken ten slotte de dikte van netvlieslagen op de diktewaarden die door de software worden geleverd voor de verschillende netvliessectoren van belang. Gebruik het hele ETDRS-raster van 1, 2, 3 millimeter dat een hoek van ongeveer 25 graden beslaat, met uitzondering van de binnenste cirkel van één millimeter die de optische schijf bevat.
Begin met het selecteren van een platform om de knaagdieren te meten. Open het venster Instellingen door dubbel op de software te klikken. Selecteer Nieuwe groep en kies de groepsnaam, het aantal onderwerpen, de soorten en stammen.
Selecteer een variabele stimulus, spatiotemporale frequentie, contrastgevoeligheid, snelheid of oriëntatie in het vervolgkeuzemenu en druk op Nieuwe groep maken. Focus op het platform door het manipuleren van de focus ring van de camera op de top van de kamer. En kalibreer het systeem door het uitlijnen van de rode cirkel rond de zwarte cirkel op het platform.
Plaats vervolgens het knaagdier op het platform en laat het zich ongeveer vijf minuten aanpassen aan de omgeving. Start vervolgens de meting door de pijl-links voor ja of het vierkant voor nee te selecteren, als het dier respectievelijk volgt of niet bijhoudt. Selecteer handmatig de stapgrootte van de stimulus door op de pijl-omhoog en pijl-omlaag naast de variabele stimulus te klikken.
Selecteer ten slotte het tabblad Overzicht en klik op het bestand, de tabel of grafiek exporteren om de gewenste gegevensset te exporteren. De resultaten geven aan dat de degeneratie van de binnenste retinale lagen wordt verminderd. En een klinische EAE-score wordt verzwakt tijdens de EAE-cursus wanneer stof 1 werd toegediend.
Verder onthult OKR een verbeterde gezichtsscherpte van dieren die met stof 1 worden behandeld in vergelijking met onbehandelde MOG EAE-muizen, gemeten aan de gelang van de ruimtelijke frequentiedrempeltests over een periode van 120 dagen. Bij het uitvoeren van OCT-metingen, Een kritische stap is de orthogonale oriëntatie van de laserstraal in alle vlakken in relatie tot het netvlies om de kwaliteit en reproduceerbaarheid van de diktewaarden te garanderen. Voor de OKR-techniek vereist het onderscheid tussen tracking en normale gedragsbewegingen van het dier enige training van de onderzoeker.
Het is belangrijk om verblind te worden voor de experimentele groep. Na deze onderzoeken naar structurele en functionele schade die zich voordoen in het kader van experimentele auto-immuunenceomyelitis, kan de procedure ook nuttig zijn in andere modellen met betrekking tot het visuele systeem, met inbegrip van, maar niet beperkt tot de modellen van retinopathieën, of optische zenuwletsel. Deze technieken effenen de weg voor in vivo onderzoek op het gebied van neurologie en oogheelkunde en zijn gemakkelijk overdraagbaar naar klinische proeven.
Overzicht
Dit artikel presenteert een uitgebreid protocol voor het beoordelen van structurele en visuele resultaten in knaagdiermodellen met behulp van optische coherentietomografie (OCT) en optokinetisch respons (OKR). Deze niet-invasieve technieken bieden inzichten die van toepassing zijn op zowel oogheelkundig als neurologisch onderzoek, waardoor longitudinaal onderzoek mogelijk is met verminderde variabiliteit en minder dieren.
Belangrijkste onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Oogheelkunde
- Knaagdiermodellen
Achtergrond
- Het onderzoek richt zich op het evalueren van retinopathieën en retinale manifestaties bij knaagdieren.
- Het benadrukt de uitdagingen die gepaard gaan met het toepassen van OCT vanwege de kleine omvang van knaagdierenogen.
- OCT en OKR faciliteren de kwantitatieve in vivo onderzoek naar retinale structuur en functie.
- Deze methoden leveren waardevolle gegevens voor het beoordelen van potentiële therapieën en het begrijpen van pathologische aandoeningen.
Doel van het onderzoek
- Om een protocol te ontwikkelen en demonstreren voor het gebruik van OCT en OKR in knaagdieronderzoek.
- Om structurele en functionele schade te onderzoeken in de context van experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE).
- Om de effectiviteit van nieuwe behandelingssubstanties in preklinische modellen te evalueren.
Gebruikte methoden
- Knaagdieren werden verdoofd voor comfort tijdens OCT en OKR procedures.
- OCT-beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van een aangepaste contactlens en specifieke software-instellingen voor hoge resolutie scans.
- Het OKR-platform hield het presenteren van verschillende stimuli in om visuele trackingcapaciteiten te beoordelen.
- Belangrijke stappen omvatten zorgvuldige kalibratie en verwervingsprocedures om betrouwbare beeldvorming en tracking resultaten te garanderen.
Belangrijkste resultaten
- Resultaten gaven aan dat er een verminderde degeneratie van inner retinale lagen was bij behandelde knaagdieren.
- Verbeterde visuele scherpte werd waargenomen bij behandelde dieren in vergelijking met onbehandelde controles.
- Gegevens suggereren dat deze technieken betrouwbaar retinale veranderingen en visuele functie kunnen meten in de loop van de tijd.
Conclusies
- Dit onderzoek demonstreert de haalbaarheid van OCT en OKR als krachtige hulpmiddelen voor in vivo onderzoek in neurologie en oogheelkunde.
- Bevindingen maken verdere exploratie van retinale pathologie en de beoordeling van nieuwe therapeutische interventies mogelijk.
- De gepresenteerde methodologieën kunnen een belangrijke bijdrage leveren aan klinische trialontwerpen en het begrijpen van visuele systeemaantastingen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Combining structural and functional visual system readouts enables longitudinal, quantitative assessment of retinal integrity and visual function in rodent models, supporting mechanistic de-risking in preclinical neurology and ophthalmology programs. This dual-modality approach reduces experimental variability and animal use while providing translatable endpoints for evaluating neuroprotective or disease-modifying therapeutics. The methodology enhances predictive confidence in target validation by correlating retinal structural changes with functional visual outcomes across disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying retinal layer thickness as a structural biomarker of neurodegeneration or neuroprotection.
- Operational Value: Provides reproducible, noninvasive structural readouts that support functional target validation in visual pathway modulation.
- Predictive Value: Correlates OCT-derived retinal structural changes with OKR-measured visual acuity to strengthen target engagement and pathway modulation confidence.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes standardized OCT and OKR procedures for quantitative in vivo imaging and behavioral tracking, enabling reliable compound screening.
- Reproducibility: Facilitates longitudinal tracking of retinal structure and function, reducing inter-animal variability and improving assay precision.
- Scalability: Supports high-throughput adaptation through customizable stimulus parameters and automated segmentation for consistent data output across studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Demonstrates applicability in autoimmune encephalomyelitis (EAE) models, linking retinal structural preservation to functional visual improvement and clinical symptom attenuation.
- Translational Continuity: Provides a bridge from discovery to preclinical validation by measuring both retinal neurodegeneration and visual function recovery over extended periods.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by demonstrating substance-induced reduction in inner retinal layer degeneration and improved spatial frequency thresholds over 120 days.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, offering structural and functional endpoints that inform biological activity and therapeutic potential.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling quantitative in vivo investigation of retinal structure and function in neurodegeneration and neuroprotection models.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible structural thickness maps and functional tracking metrics for reliable compound evaluation in visual system assays.
- Analytics: Generates layer-specific thickness profiles and spatial frequency thresholds that enable cross-condition comparison and dose-response analysis.
- Translational Research: Connects structural retinal preservation with functional visual acuity recovery, supporting biomarker alignment and preclinical continuity in neurologic disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for longitudinal visual system assessment across multiple disease indications and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity through correlated structural and functional visual system readouts.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via calibrated imaging protocols and blinded behavioral tracking procedures.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early, translatable biomarkers of retinal and visual function change, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates demonstrating both retinal structural preservation and visual functional improvement in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent handling, ophthalmic preparation, and OCT/OKR system operation for reliable data acquisition.
- Depends on customized holders, contact lenses, and calibrated imaging systems to accommodate small rodent eye size and ensure beam alignment.
- Necessitates cross-team standardization of anesthesia, dilation, lubrication, and imaging protocols to maintain consistency across sites or studies.
- Involves adaptation considerations for varying stimulus parameters (spatiotemporal frequency, contrast, speed) in OKR assays across species and strain models.
- Includes practical limitations such as the need for investigator training to distinguish true optokinetic tracking from normal behavioral movements and ensure blinding during assessment.
