Met behulp van optische coherentie tomografie en Optokinetic reactie als structurele en functionele visuele systeem uitlezingen in muizen en ratten
10 januari 2019
Een gedetailleerd protocol voor de beoordeling van structurele en visuele uitlezingen bij knaagdieren door optische coherentie tomografie en optokinetic reactie wordt gepresenteerd. De resultaten bieden waardevolle inzichten voor oogcontrole, alsmede neurologische onderzoek.
Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neurologie en oogheelkunde, en helpen bij het evalueren van een grote verscheidenheid aan retinopathieën en netvliesmanifestaties in verschillende knaagdiermodellen. Het belangrijkste voordeel van deze technieken is dat niet-invasieve longitudinale onderzoeken kunnen worden uitgevoerd, waardoor de variabiliteit wordt verminderd en het aantal dieren dat nodig is voor de experimenten wordt verminderd. Deze methoden maken kwantitatief in vivo onderzoek van structuur en functie mogelijk die kunnen worden gebruikt om de pathologische omstandigheden te onderzoeken, of om het potentiële nut van nieuwe therapieën te evalueren.
Echter, vooral de toepassing van optische coherentie tomografie technologie in knaagdier modellen is nog steeds uitdagend, vooral vanwege de kleine ooggrootte. Het aantonen van de procedures zal worden Michael Dietrich, een promovendus uit ons laboratorium. Na het verdoven van het knaagdier, breng een druppel Fenylephrine Tropicamide op elk oog voor pupillary dilatatie.
Veeg elke overtollige oogdruppel nat na een minuut. En smeer de ogen methylcellulose op basis van oogheelkundige gel om te voorkomen dat uitdrogen van het oog en het creëren van een troebel hoornvlies. Gebruik vervolgens tangen om een aangepaste contactlens op het oog te plaatsen.
Druk op de knop Start in de rechterhoek van het weergave van het bedieningspaneel om de acquisitiemodus te starten. Vervolgens, om het linkeroog te beeld, plaats de houder om ervoor te zorgen dat de linker oogbol van het knaagdier naar de camera kijkt. Stel het filterniveau in op R en selecteer BR en OCT voor blauwe reflecties fundus imaging en B-scan acquisitie in de software.
Stel vervolgens de scherpstelafstand in op ongeveer 38 diopters, met behulp van de focusknop op de achterkant van de camera. En zoom in op het netvlies, totdat de OCT-scan zichtbaar is op het scherm. Om vervolgens een straalpad door het midden van de pupil te garanderen, met een orthogonale hoek van het netvlies in alle vlakken, plaatst u de optische schijf in het midden van het verlichte veld.
En pas de horizontale en verticale lijn B-scans aan op een horizontaal niveau door de houder te draaien. Selecteer op het softwarescherm de volumescanmodus en stel deze in op 25 B-scans in hoge resolutiemodus op 50 automatische real-time tracking. Centreer het midden van het volumescanraster op de optische schijf en begin met acquisitie door op de zwarte gevoeligheidsknop te drukken en vervolgens Op het bedieningspaneel te verwerven.
Nadat de overname is voltooid, stelt u het filterniveau in op A.Select Blue Autofluorescentie op het bedieningspaneel. En pas de helderheid van het beeld aan met de gevoeligheidsknop. Druk op de gevoeligheidsknop en verwerf vervolgens fluorescerende cellen of autofluorescerende afzettingen.
Voor analyse van de volumescans wordt de geautomatiseerde segmentatie van de software van het OCT-apparaat gebruikt door met de rechtermuisknop op de scan te klikken. En selecteer Segmentatie, vervolgens Alle lagen. Voer handmatige correctie van de lagen uit door dubbel te klikken op de gewenste scan.
Selecteer Dikteprofiel. En klik op Layer Segmentations bewerken. Selecteer één laag tegelijk.
En indien nodig corrigeer de groene lijn door het verplaatsen van de rode stippen door te slepen en te laten vallen naar de juiste positie. Selecteer vervolgens het tabblad Diktekaart. Kies het ETDRS-raster van 1, 2, 3 millimeter.
Centreer de binnenste cirkel op de optische schijf. Bereken ten slotte de dikte van netvlieslagen op de diktewaarden die door de software worden geleverd voor de verschillende netvliessectoren van belang. Gebruik het hele ETDRS-raster van 1, 2, 3 millimeter dat een hoek van ongeveer 25 graden beslaat, met uitzondering van de binnenste cirkel van één millimeter die de optische schijf bevat.
Begin met het selecteren van een platform om de knaagdieren te meten. Open het venster Instellingen door dubbel op de software te klikken. Selecteer Nieuwe groep en kies de groepsnaam, het aantal onderwerpen, de soorten en stammen.
Selecteer een variabele stimulus, spatiotemporale frequentie, contrastgevoeligheid, snelheid of oriëntatie in het vervolgkeuzemenu en druk op Nieuwe groep maken. Focus op het platform door het manipuleren van de focus ring van de camera op de top van de kamer. En kalibreer het systeem door het uitlijnen van de rode cirkel rond de zwarte cirkel op het platform.
Plaats vervolgens het knaagdier op het platform en laat het zich ongeveer vijf minuten aanpassen aan de omgeving. Start vervolgens de meting door de pijl-links voor ja of het vierkant voor nee te selecteren, als het dier respectievelijk volgt of niet bijhoudt. Selecteer handmatig de stapgrootte van de stimulus door op de pijl-omhoog en pijl-omlaag naast de variabele stimulus te klikken.
Selecteer ten slotte het tabblad Overzicht en klik op het bestand, de tabel of grafiek exporteren om de gewenste gegevensset te exporteren. De resultaten geven aan dat de degeneratie van de binnenste retinale lagen wordt verminderd. En een klinische EAE-score wordt verzwakt tijdens de EAE-cursus wanneer stof 1 werd toegediend.
Verder onthult OKR een verbeterde gezichtsscherpte van dieren die met stof 1 worden behandeld in vergelijking met onbehandelde MOG EAE-muizen, gemeten aan de gelang van de ruimtelijke frequentiedrempeltests over een periode van 120 dagen. Bij het uitvoeren van OCT-metingen, Een kritische stap is de orthogonale oriëntatie van de laserstraal in alle vlakken in relatie tot het netvlies om de kwaliteit en reproduceerbaarheid van de diktewaarden te garanderen. Voor de OKR-techniek vereist het onderscheid tussen tracking en normale gedragsbewegingen van het dier enige training van de onderzoeker.
Het is belangrijk om verblind te worden voor de experimentele groep. Na deze onderzoeken naar structurele en functionele schade die zich voordoen in het kader van experimentele auto-immuunenceomyelitis, kan de procedure ook nuttig zijn in andere modellen met betrekking tot het visuele systeem, met inbegrip van, maar niet beperkt tot de modellen van retinopathieën, of optische zenuwletsel. Deze technieken effenen de weg voor in vivo onderzoek op het gebied van neurologie en oogheelkunde en zijn gemakkelijk overdraagbaar naar klinische proeven.
Overzicht
Dit artikel presenteert een uitgebreid protocol voor het beoordelen van structurele en visuele read-outs in knaagdiermodellen met behulp van optische coherentietomografie (OCT) en de optokinetische respons (OKR). Deze niet-invasieve technieken bieden inzichten die toepasbaar zijn voor zowel oogheelkundig als neurologisch onderzoek, waardoor longitudinale studies mogelijk zijn met een verminderde variabiliteit en een kleiner aantal proefdieren.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Oogheelkunde
- Knaagdiermodellen
Achtergrond
- De studie richt zich op het evalueren van retinopathieën en retinale manifestaties bij knaagdieren.
- Er wordt gewezen op de uitdagingen die gepaard gaan met de toepassing van OCT vanwege de geringe omvang van de ogen van knaagdieren.
- OCT en OKR maken kwantitatief in vivo onderzoek naar de retinale structuur en functie mogelijk.
- Deze methoden leveren waardevolle gegevens voor het beoordelen van potentiële therapeutica en het begrijpen van pathologische aandoeningen.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen en demonstreren van een protocol voor het gebruik van OCT en OKR in onderzoek met knaagdieren.
- Het onderzoeken van structurele en functionele schade in de context van experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE).
- Het evalueren van de effectiviteit van nieuwe behandelingsstoffen in preklinische modellen.
Gebruikte Methoden
- Knaagdieren werden geanestheseerd voor het comfort tijdens de OCT- en OKR-procedures.
- OCT-beeldvorming werd uitgevoerd met een op maat gemaakte contactlens en specifieke software-instellingen voor scans met een hoge resolutie.
- Het OKR-platform hield het presenteren van diverse stimuli in om de visuele trackingcapaciteiten te beoordelen.
- De belangrijkste stappen omvatten zorgvuldige kalibratie- en acquisitieprocedures om betrouwbare resultaten voor beeldvorming en tracking te waarborgen.
Belangrijkste resultaten
- Resultaten wezen op een verminderde degeneratie van de binnenste retinale lagen bij behandelde knaagdieren.
- Er werd een verbeterde visuele Scherpte waargenomen bij behandelde dieren in vergelijking met onbehandelde controles.
- Gegevens suggereren dat deze technieken retinale veranderingen en de visuele functie over een bepaalde periode betrouwbaar kunnen meten.
Conclusies
- Deze studie demonstreert de levensvatbaarheid van OCT en OKR als krachtige instrumenten voor in vivo onderzoek in de neurologie en oogheelkunde.
- De bevindingen maken verdere exploratie van retinale pathologie en de beoordeling van nieuwe therapeutische interventies mogelijk.
- De gepresenteerde methodologieën kunnen een aanzienlijke bijdrage leveren aan het ontwerp van klinische studies en het begrip van aandoeningen van het visuele systeem.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Door structurele en functionele read-outs van het visuele systeem te combineren, wordt een longitudinale, kwantitatieve beoordeling van de retinale integriteit en de visuele functie in knaagdiermodellen mogelijk, wat bijdraagt aan mechanistische risicoreductie in preklinische neurologische en oogheelkundige programma's. Deze duale modaliteitsbenadering vermindert de experimentele variabiliteit en het aantal gebruikte dieren, terwijl er translaatbare eindpunten worden geboden voor de evaluatie van neuroprotectieve of ziekte-modificerende therapeutica. De methodologie verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de validatie van targets door retinale structurele veranderingen te correleren aan functionele visuele uitkomsten in verschillende ziekte-modellen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & doelwitvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de dikte van de retinale lagen te kwantificeren als een structurele biomarker voor neurodegeneratie of neuroprotectie.
- Operationele waarde: Biedt reproduceerbare, niet-invasieve structurele read-outs die bijdragen aan de functionele validatie van targets bij de modulatie van de visuele route.
- Voorspellende waarde: Correleert op OCT gebaseerde retinale structurele veranderingen met de via OKR gemeten visuele Scherpte om het vertrouwen in target-engagement en route-modulatie te versterken.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Stelt gestandaardiseerde OCT- en OKR-procedures vast voor kwantitatieve in vivo imaging en gedragsmeting, waardoor betrouwbare screening van verbindingen mogelijk wordt.
- Reproduceerbaarheid: Faciliteert longitudinale monitoring van de retinale structuur en functie, waardoor de inter-individuele variabiliteit tussen dieren wordt verminderd en de precisie van de assay wordt verbeterd.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt high-throughput adaptatie door middel van aanpasbare stimulusparameters en geautomatiseerde segmentatie voor een consistente data-output over verschillende studies heen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Demonstreert toepasbaarheid in modellen van auto-immuun encefalomyelitis (EAE), waarbij behoud van de retinale structuur wordt gekoppeld aan functionele visuele verbetering en vermindering van klinische symptomen.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug van ontdekking naar preklinische validatie door zowel retinale neurodegeneratie als het herstel van de visuele functie over langere perioden te meten.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door aan te tonen dat de toegediende stof leidt tot een vermindering van degeneratie van de binnenste retinale lagen en verbeterde ruimtelijke frequentiedrempels over een periode van 120 dagen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie via leadidentificatie tot preklinische effectiviteitstests, waarbij structurele en functionele eindpunten worden geboden die inzicht geven in de biologische activiteit en het therapeutische potentieel.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door kwantitatief in vivo onderzoek naar de structuur en functie van het netvlies in modellen voor neurodegeneratie en neuroprotectie mogelijk te maken.
- Screening: Levert assay-waardige, reproduceerbare diktekaarten van de structuur en functionele trackingsmetriek voor betrouwbare evaluatie van verbindingen in assays van het visuele systeem.
- Analyse: Genereert laagspecifieke dikteprofielen en ruimtelijke frequentiedrempels die vergelijking tussen condities en dosis-responsanalyse mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt structurele preservatie van het netvlies met functioneel herstel van de visuele scherpte, wat bijdraagt aan de afstemming van biomarkers en preklinische continuïteit in modellen van neurologische ziekten.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbaar platform voor longitudinale beoordeling van het visuele systeem over meerdere ziekte-indicaties en therapeutische modaliteiten.
Operationele impact & impact op de onderneming
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen door mechanistische ambiguïteit te verminderen via gecorreleerde structurele en functionele read-outs van het visuele systeem.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid via gekalibreerde beeldvormingsprotocollen en geblindeerde procedures voor gedragsmatige tracking.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming door vroege, transleerbare biomarkers van veranderingen in de retinale en visuele functie te bieden, waardoor biologische risico's in een laat stadium worden verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering mogelijk van kandidaten die zowel retinale structurele preservatie als functionele visuele verbetering vertonen in preklinische modellen.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van knaagdieren, oogheelkundige preparatie en het bedienen van OCT/OKR-systemen voor een betrouwbare gegevensverwerving.
- Is afhankelijk van op maat gemaakte houders, contactlenzen en gekalibreerde imagingsystemen om rekening te houden met de kleine ooggrootte van knaagdieren en de uitlijning van de bundel te waarborgen.
- Maakt standaardisatie tussen teams van anesthesie-, dilatatie-, lubricatie- en imagingprotocollen noodzakelijk om consistentie tussen locaties of studies te behouden.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen van verschillende stimulusparameters (spatiotemporele frequentie, contrast, snelheid) in OKR-assays over verschillende soorten en stammodellen.
- Omvat praktische beperkingen, zoals de noodzaak van training van de onderzoeker om echt optokinetisch volgen te onderscheiden van normale gedragsmatige bewegingen en om blindering tijdens de beoordeling te waarborgen.
