Een gecontroleerde muismodel voor neonatale Sepsis van de Polymicrobial

Het cecal drijfmestmodel voor polymicrobiële sepsis is een krachtig hulpmiddel om unieke neonatale pathofysiologie te ontleden. Het kan variabel zijn, en humane eindpunten zijn niet goed beschreven. Hier presenteren we onze sterk gestandaardiseerde procedure om een cecal drijfmest voor te bereiden en te injecteren in proefdieren.

Daarnaast gebruiken we een datagedreven aanpak om stervende pups zo snel mogelijk te identificeren. Laten we beginnen met het bereiden van een bevroren cecal drijfmest voorraad. Dit wordt gedaan door het bundelen van cecal concent van ten minste vijf volwassen muizen, op te schorten in steriel dextrose water, en op te slaan op min 80 voor later gebruik.

U gebruik maken van mannen of vrouwen, maar het geslacht, leeftijd en achtergrond van muizen voor uw experimenten moeten constant worden gehouden. Laten we eerst onze gereedschappen voorbereiden op dissectie. Deze omvatten een set van schaar en tangen voor de huid en een tweede set voor de inwendige organen.

Zet de hete kraal sterilisator ten minste 30 minuten voor gebruik. Dompel de gereedschappen in 70% ethanol en dompel ze vervolgens gedurende ten minste één minuut onder in de hete kraalsterilisator. Spray een mat met papieren handdoeken met 70%-ethanol en verwijder vervolgens de gereedschappen uit de sterilisator zonder het gesteriliseerde deel van het gereedschap aan te raken aan de niet-steriele handgrepen van andere gereedschappen.

Leg ze op de papieren handdoek om af te koelen. Ontleed de muizen in een biologische veiligheidskast. Pin de benen van de muis aan een piepschuim bord met behulp van 23 meter naalden, zodat de muis is buik omhoog.

Spray de buik met 70% ethanol. Met behulp van steriele tangen en scharen, snijd door de huid, los de huid van de buikvlies met de schaar, en snijd open een rechthoekig gebied van de lies naar het borstbeen en de linkerkant naar de rechterkant. Verwijder alle bont rond het buikvlies.

Schakel over naar een nieuw paar steriele gereedschappen om door het buikvlies te snijden, waardoor ook een rechthoekige opening wordt gemaakt. Identificeer de cecum, die moet worden uitgevoerd van links naar rechts over het lichaam. Verstoor bindweefsel om de cecum takken van de darmen te identificeren en snijd het cecum uit de buurt van de darmen.

Leg het op een gesteriliseerd vel weegpapier. Met behulp van steriele gereedschappen, snijd door beide uiteinden van de cecum. Houd het midden van de cecum met tangen en gebruik een platte metalen spatel om voorzichtig duw de cecal inhoud uit de uiteinden met behulp van een rollende beweging.

Verzamel de inhoud en plaats ze in een vooraf gewogen 15 milliliter centrifuge buis. Pool cecal inhoud van maximaal vijf muizen in dezelfde buis. Gewicht de buis weer zodra alle inhoud is toegevoegd.

Om het volume van dextrose water toe te voegen aan cecal inhoud in elke buis te berekenen, verdeel het gewicht van de cecal inhoud in de buis door uw gewenste concentratie in milligram per milliliter. Houd een aliquot van dextrose water op ijs voor de re-schorsing van cecal inhoud. Voeg de benodigde hoeveelheid dextrosewater toe aan de 15 milliliter centrifugebuis met cecal-inhoud.

Vortex de buis verticaal en horizontaal gedurende ongeveer 30 seconden. Let op de aanwezigheid van deeltjes met een diameter van meer dan een paar millimeter en blijf, indien aanwezig, vortexen totdat alle deeltjes zichtbaar verdwenen zijn. Plaats een 50 milliliter centrifuge buis op ijs om het filtraat te verzamelen en installeer een steriele 70 micrometer cel zeef over de top.

Pipette vier milliliter van opnieuw opgeschorte drijfmest van één buis van 15 milliliter over de celzeef en in de inzamelingsbuis. Hang de deeltjes opnieuw op door twee tot drie keer op en neer te pipetten. Voorzichtig uitpuilen bubbels om de filtersnelheid te verhogen, terwijl roeren de inhoud met de pipette tip totdat er geen vloeistof meer wordt gefilterd.

Dit duurt ongeveer 30 seconden. Verander cel strainers tussen elke buis van cecal drijfmest, maar bundel alle inhoud in dezelfde 50 milliliter collectie buis. Als uw voorraad meer dan 40 milliliter, dan vortex het voor 15 seconden, en plaats 20 milliliter in een nieuwe centrifuge buis.

Verdeel de drijfmest in cryogene flesjes van elk 500 microliter aliquots. Vortex de drijfmest tussen elke drie flesjes. Houd de meester voorraad in flesjes op ijs.

Door aliquots op min 80 op te slaan, verandert de concentratie van de aërobe kolonievorming in een cecaldrijfmestpreparaat niet over een periode van zes maanden. Nu de cecal drijfmest is voorbereid, kunnen we het gebruiken om een nest van zeven tot acht dagen oude muizen uit te dagen met een gewichtsgecorrigeerde dosis cecal drijfmest. Letaliteit van de drijfmest is dosisafhankelijk.

U moet de gewenste dodelijke dosis in uw faciliteit bepalen voor elke nieuwe voorraad met een nieuwe dosis titratie. Per nest wordt één cecal slurry injectie aliquot bereid. We normaliseren het entmateriaal tot een volume van 100 microliter, ronding naar de dichtstbijzijnde 10 microliter voor elk dier in het nest.

Voor de voorbereiding van de uitdaging aliquot vereist drie berekeningen, de hoeveelheid drijfmest voorraad nodig, extra volume van dextrose water, en het afgeronde volume voor elke pup in het nest. Details over het uitvoeren van elke berekening vindt u in sectie drie van het protocol. Het uitvoeren van deze berekeningen met de hand voor elk experiment kan tijdrovend zijn en zal bijdragen aan experimentele fouten, dus een spreadsheet kan worden gedownload samen met het protocol waar u uw voorraadconcentratie, gewenste dosis en gewicht van uw nest invoert, en de hoeveelheid drijfmestvoorraad, volume van dextrosewater en het werkelijke volume per pup wordt automatisch geretourneerd.

U dit vel afdrukken en meenemen wanneer u klaar bent om uw dieren uit te dagen. Bereid de injectie aliquot in een biologische veiligheidskast en houd het op ijs. Voordat u de spuit laadt, mengt u de microcentrifugebuis door 20 keer te vegen.

Pups worden uitgedaagd met een 28-ijkige insulinespuit. Voordat u drijfmest optekent, mengt u de aliquot door 300 tot 500 microliters van de uitdaging in en uit de microcentrifugebuis te inspireren en uit te werpen. Dan, opstellen ongeveer 150 microliter van de uitdaging aliquot.

Dit moet groter zijn dan het injectievolume voor een zeven tot acht dagen oude pup. Veeg naar de spuit om bellen uit de zuiger te halen en trek iets terug op de spuit om luchtbellen te verdrijven. Raak tijdens dit proces de naald of de zuigas niet aan.

Doe de overtollige cecaldrijfmest terug in de microcentrifugebuis totdat de berekende hoeveelheid cecaldrijfmest voor de muis in de spuit wordt geladen. Cecal drijfmest wordt toegediend met een intraperitoneale injectie. Voer dit uit volgens het protocol van uw dierenzorginstelling.

Om lekken te minimaliseren, kantel de pup naar beneden en steek de naald tussen het been en de genitaliën, waarbij de naald ondiep en onderhuids. Na het inbrengen van de naald ongeveer een centimeter, druk naar beneden en naar voren totdat u voelt dat de naald lek het buikvlies, dan langzaam deprimeren van de zuiger. Trek de naald voorzichtig terug volgens dezelfde route als u naar binnen ging, waardoor u uw middelvinger ontspant.

Let op eventuele lekken in uw lab notebook en overwegen weglaten dieren met aanzienlijke lekken uit uw uiteindelijke resultaat. In deze sectie zullen we de verschillende gezondheidsniveaus schetsen die we waarnemen bij muizen die worden uitgedaagd met polymicrobiële sepsis en hun bijbehorende humane eindpunt. Voor alle procedures met neonatale muizen brengen we het beddengoed over naar een nieuwe kooi.

Dit brengt de geur van de dame op uw handschoenen en vermindert de stress op de dame van herhaalde binnenkomst in haar kooi. We maken een tweede nest in de nieuwe kooi om de bewaakte pups tot het einde van de procedure te houden of te controleren wanneer het hele nest klaar is om terug te keren naar de kooi van de dame. Plaats een muis op de rug en monitor voor de mogelijkheid om binnen vier seconden.

Als het goed kan, wacht dan nog acht seconden om het niveau van mobiliteit te bepalen. Een onbetwiste of herstellende muis is meestal in staat om de omgeving te verbeteren en te verkennen door meerdere stappen achter elkaar te nemen. Hergroeperen muizen die in staat zijn om zichzelf recht te zetten en neem een paar stappen om zijn omgeving te verkennen als rechten-lusteloos.

Deze muizen kunnen omvallen tijdens het nemen van een stap en kijken wankel op hun voeten. Een muis die niet in staat is om rechts en heeft heupbeweging die meer dan 90 graden van horizontale we groep als niet aan rechts-mobiel. Deze muis zal uiteindelijk recht, maar kan niet binnen vier seconden.

Vanwege zijn heupbewegingen, is het gegroepeerd als niet aan rechts-mobiel. Pups die niet in staat waren om rechts en hebben heupbeweging onder de 90 graden van horizontaal zijn gegroepeerd als niet aan rechts-lusteloos. Dit is een ander voorbeeld van een muis waarvan de heupen niet meer dan 90 graden van horizontaal en is gegroepeerd als niet aan rechts-lusteloos.

Een niet aan rechts-niet-mobiele pup zal hebben benen die kunnen schudden of trillen, maar hebben geen heupbeweging. Ledematen kunnen zich uitbreiden en intrekken, maar hebben geen zijdelingse beweging. De pup is zichtbaar ziek en heeft het humane eindpunt bereikt.

Dit is een ander voorbeeld van een niet-rechtse niet-mobiele pup. De heupen schudden niet van links naar rechts, maar de poten trillen wel. Bij het hanteren van de dame kooi, pups kunnen worden gesleept uit het nest als de verpleegkundige dame loopt.

We vervangen deze en controleren vervolgens op andere verspreide pups die weg zijn van hun nestmates. Als die verspreide pups niet goed-lusteloos zijn, zijn ze op een humaan eindpunt. Hier is een Kaplan-Meier overlevingscurve van ons sepsis model.

De meettijdpunten zijn te vinden in de bijgevoegde SOP. Op elk punt langs de overlevingscurve als een muis niet aan juist-niet-mobiel wordt gevonden, is het op zijn humane eindpunt en geëuthanaseerd. Tussen 12 en 21 uur na de challenge zullen muizen ziek lijken en ongeveer de helft van de muizen zal aan de ene kant kunnen rechts, terwijl de andere helft niet aan een van hun kanten rechts is.

Dit is het tijdsbestek waar de muizen zullen beginnen af te wijken in de gezondheid score en het humane eindpunt van niet te rechts-niet-mobiel te bereiken. Dit zijn representatieve resultaten van gezondheidsscores waargenomen in dit tijdsbestek. De survivor en non-survivor groepen kunnen op dit moment niet worden onderscheiden op basis van hun gezondheidsscores.

In deze fase van de ziekte, 21 tot 48 uur na de uitdaging, observeren we het hoogste percentage humane eindpunten. We hebben ook geconstateerd dat de overgrote meerderheid van de muizen die niet in staat zijn om recht aan beide zijden zal niet uiteindelijk herstellen van de ziekte, die dus wordt een nieuwe criteria voor humane eindpunt in aanvulling op de niet-recht-niet-mobiele criteria. De waargenomen gezondheidsscores tijdens deze fase van de ziekte resulteerden in een scheiding van overlevenden van niet-overlevenden.

De overgrote meerderheid van de muizen die niet in staat waren om rechts aan beide zijden niet herstellen van de ziekte. Deze gegevens ondersteunen dat een nieuwe criteria voor humane eindpunt begin bij 21 uur na de uitdaging moet zijn om te euthanaseren muizen die niet recht te maken aan beide zijden. Meer dan 48 uur na de uitdaging zullen veel muizen beginnen om meer activiteit en een betere juiste reflex weer te geven.

Hoewel het aandeel van humane eindpunten lager zijn in deze periode, kunnen de muizen nog steeds uitwijken en zieker worden, en ze vereisen nog steeds controle voor humane eindpunt. Gedurende dit tijdsbestek, sommige van die muizen die uiteindelijk werden gegroepeerd als niet-overlevenden had getoond verhoogde activiteit op een gegeven moment, maar later deed het slechter en bereikte een humaan eindpunt. Dit vereist een voortdurende controle van zieke dieren met een verhoogde frequentie als ze beginnen te vertonen slechtere gezondheidsresultaten.

Onafhankelijke onderzoekers die geen persoonlijke training hebben genoten en die alleen deze instructievideo observeren, werden getest in hun vermogen om dezelfde score toe te wijzen als de onderzoekers met behulp van opgenomen testvideo's. Deze instructievideo resulteert in een nauwkeurige gedragsclassificatie. De mogelijkheid om de juiste score toe te wijzen om niet te voldoen aan rechts-niet-mobiele neonatale muizen, wat een maat is voor humane eindpunt, werd bepaald uit 60 neonatale muizen, en een gemiddelde van 97% van het gedrag werd nauwkeurig onderscheiden, waarbij slechts 3% verkeerd werd geïdentificeerd.

Vervolgens werd de mogelijkheid getest om neonatale muizen te onderscheiden die niet goed waren of die binnen vier seconden konden rechtzetten. Dit is een andere maat van humane eindpunt en werd nauwkeurig toegewezen in 97% van neonatale muizen, terwijl 3% van pups ten onrechte als rechtzettend werden toegewezen. Hier zijn representatieve resultaten voor de procentuele gewichtsverandering van muizen in vergelijking met hun tijd van uitdaging.

De gemiddelde gewichtsverandering tussen overlevenden en niet-overlevenden begon te scheiden op 24 uur na de uitdaging, maar er is veel overlap tussen de groepen. Er waren een aantal overlevenden die verloren meer dan 20%,, maar nog steeds hersteld van de ziekte. Gewichtsverandering was niet zo efficiënt in het voorspellen van de uitkomst in vergelijking met de verschillen in gezondheidsscores, daarom wordt het niet gebruikt als een criterium om te bepalen of muizen op een humaan eindpunt zijn.

Tot slot moet u nu in staat zijn om een voorraad bevroren cecal drijfmest voor te bereiden, de gewichtscorrigeerde dosis te berekenen. En injecteer en monitor pasgeboren muizen op humane eindpunten. We hopen dat dit een waardevolle bron voor uw muis onderzoek.