Name: Cel-gebaseerde Assay te bestuderen van antilichaam-gemedieerde Tau goedkeuring door Microglia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Leer een cel-gebaseerde assay om antilichaam-gemedieerde opname van tau-eiwitten door BV-2 microglia te kwantificeren. Deze methode helpt onderzoekers het werkingsmechanisme van anti-tau antilichamen te begrijpen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij wil Alberto Carpinteiro Soares bedanken voor zijn waardevolle technische bijstand.

1. BV-2 cellen cultuur
Opmerking: Handvat BV-2 cellen onder insluiting van bioveiligheid niveau 2. De BV-2 cellijn produceert een omhuld recombinante ecotropic retrovirus (staat alleen lymfkliertest cellen infecteren)12; deze virussen zijn gekend voor hun in vitro transformeren vermogen en in vivo tumorigene potentieel.
<ol><li>Cultuur BV-2 cellen in hoge glucose Dulbecco bewerkt eagle medium (DMEM), aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 100 U/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine en 2 mM L-Glutamine (hierna aangeduid als kweken medium voortaan) door het zaaien van de cellen op de 4 x 104 cellen/mL.</li>
	<li>Handhaven van culturen in een bevochtigde sfeer van 5% CO2 bij 37 ° C. Opmerking: de cellen groeien losjes verbonden en in suspensie.</li>
</ol>2. label recombinante Tau aggregaten met pH-gevoelige fluorescente kleurstof
Opmerking: Tau aggregaten waren voorbereid zoals beschreven in Apetri et al. 13 met het verschil dat er geen Thioflavin T (ThT) werd toegevoegd aan de buffer van de reactie. Geaggregeerde monsters werden verzameld in 1,5 mL centrifuge buizen. Definitieve fluorescentie signaal werd gecontroleerd door het mengen van 118 µL van het monster zwembad met 12 µL van een 50 µM ThT oplossing. Aggregaten werden gescheiden door centrifugering van het reactiemengsel aggregatie bij 20.000 x g gedurende 1 uur bij 4 ° C. De bovendrijvende substantie werd geanalyseerd door SEC-MALS te bevestigen dat alle het monomeer tau werd omgebouwd tot aggregaten. Pellets (tau aggregaten) waren module bevroren en opgeslagen in een diepvriezer op-80 ° C.
<ol><li>Resuspendeer tau aggregaten in 0,1 M natriumbicarbonaat buffer (NaHCO3) bij een pH 8,5 tot een concentratie van 1 mg/mL (~ 20 µM). Opmerking: Concentratie van tau aggregaten is gebaseerd op de oorspronkelijke monomeren concentratie zoals beoordeeld door de absorptie van tau monomeren op 280 nm met behulp van een aanpassingscoëfficiënt vast die uitsterven van 0.31 mLmg-1cm-1.</li>
	<li>Bewerk ultrasone trillingen ten de geresuspendeerde aggregaten met behulp van een sonde ultrasoonapparaat terwijl op ijs te vermijden oververhit.<ol>
<li>Gebruik een amplitude van 65% (met ultrasoonapparaat van macht 250 W).</li>
		<li>Uitvoeren van 8 pulsen van 3 s met pauzes van 15 s tussen peulvruchten te voorkomen oververhitting.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiden een 8.9 mM stockoplossing van pH-gevoelige kleurstof (voortaan verwijzing naar als pH kleurstof) in dimethylsulfoxide (DMSO) volgens instructies van de fabrikant. Opmerking: Altijd bereid een vers-oplossing en gebruik het alleen op de dag dat zij bereid is.</li>
	<li>10 mol kleurstof per mol van eiwit toevoegen aan een definitieve kleurstof concentratie van 0,2 mM.</li>
	<li>Meng door zachtjes op en neer pipetteren.</li>
	<li>Incubeer het reactiemengsel gedurende 45 – 60 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.</li>
	<li>In de tussentijd, monteren een kruislings gekoppelde dextran gel ontzouten kolom volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>De kolom met 25 mL 0,1 M NaHCO3 buffer pH 8,5 met 3% DMSO equilibreer. Gooi de stroom door.</li>
	<li>Het product van de tau aggregaat labeling reactie op de kolom in een totaal volume van 2.5 mL toevoegen. Als het monster minder dan 2,5 mL is, voeg toe buffer tot een totaal volume van 2.5 mL wordt bereikt.</li>
	<li>Laat het monster volledig invoeren van het verpakte gel, negeren de doorstroming.</li>
	<li>Elueer met 3,5 mL 0,1 M NaHCO3 buffer pH 8,5 met 3% DMSO en verzamelen van het eluaat in 4 gelijkwaardige breuken in 2 mL tubes.</li>
	<li>Bepalen eiwit concentraties van de 4 breuken door bicinchoninic zuur (BCA) assay.</li>
	<li>De gelabelde proteïne in een vriezer van-20 ° C worden opgeslagen.</li>
</ol>3. opname Assay met fluorescentie-activated Cell Sorting (FACS) uitlezing
<ol><li>
Dag 1 – zaad de cellen
	<ol>
<li>Wash BV-2 cellen in de kolf doordat kweken van middellange en toevoegen 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Opmerking: Wassen volume zal variëren afhankelijk van de grootte van de cel kolf gebruikt. Bijvoorbeeld, voor een T175 kolf, wassen met 10 mL 1 x PBS.</li>
		<li>Verwijderen van PBS van de kolf en losmaken van cellen door broeden met trypsine-ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) 0,05% bij 37 ° C en 5% CO2 , totdat de cellen van de kolf (ongeveer 5 min loskoppelen). Opmerking: Volume van trypsine-EDTA 0,05% afhankelijk van de grootte van de cel kolf gebruikt. Bijvoorbeeld, voor een T175 kolf, gebruik 2 mL trypsine-EDTA 0,05%.</li>
		<li>Resuspendeer de cellen in het kweken van medium door pipetteren boven en beneden drie tot vijf keer. Opmerking: Volume van medium kweken is afhankelijk van de grootte van de cel kolf gebruikt en dus het totale aantal cellen in de kolf. Bijvoorbeeld, voor een T175 kolf, gebruik 8 mL medium kweken.</li>
		<li>Cellen tellen en maak een celsuspensie met een eindconcentratie van 1 x 105 cellen/mL in kweekmedium dat 200 μg/mL heparine.</li>
		<li>Plaat 250 µL celsuspensie (2.5 x 104 cellen) per putje in een 96-Wells weefselkweek platte bodemplaat.</li>
		<li>Incubeer plaat 's nachts bij 37 ° C en 5% CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dag 1 – voorbereiding Immunocomplexes
	<ol>
<li>Ontdooi pH kleurstof-tau op ijs.</li>
		<li>Bereiden 65 μl per voorwaarde van een 500 nM oplossing van pH kleurstof-tau aggregaten in serumvrij medium (SFM) (hoge glucose DMEM aangevuld met 100 U/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine en 200 µg/mL van heparine).</li>
		<li>Maak de verdunningen van het antilichaam in 65 µl van SFM en bij een concentratie dubbele degene definitieve. Meng pH kleurstof-tau aggregaten en antilichamen in een 96-Wells u-bodemplaat. Eindvolume per voorwaarde is nu 130 µl en de pH kleurstof-tau aggregaten concentratie is 250 nM. Afdichting van de plaat verdunning en uit te broeden over nacht bij 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dag 2 – Immunocomplexes opname
	<ol>
<li>Verwijder kweken medium uit BV-2 cellen. Wassen cellen eens met 100 µL kamertemperatuur 1 x PBS.</li>
		<li>Breng 125 µL van immunocomplexes aan de cellen met behulp van een meerkanaalspipet. Incubeer de cellen met de immunocomplexes gedurende 2 uur bij 37 ° C en 5% CO2.</li>
		<li>Verwijder het medium van de incubatie van de cellen en verwerpen. Wassen cellen eens met 100 µL kamertemperatuur 1 x PBS.</li>
		<li>1 x PBS verwijderen en behandelen van cellen met 50 µL trypsine-EDTA 0,25% gedurende 20 minuten bij 37 ° C en 5% CO2.
</li>
		<li>Voeg 200 µL van kweken medium en resuspendeer goed door pipetteren omhoog en omlaag als u wilt loskoppelen van de cellen. Cellen overbrengen in een 96-Wells U-bodem plaat. Centrifuge plaat bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.</li>
		<li>Zet de plaat in de ijskast, verwijder kweken van middellange en wassen cellen tweemaal door het resuspending van de cel pellets in 150 µL ijs koud 1 x PBS. Centrifuge plaat bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.</li>
		<li>Cellen zetten ijs, toegevoegde 1 x PBS en wassen hen door resuspending pellets in 150 µL koude FACS buffer (1 x PBS, 0,5% bovien serumalbumine (BSA), 2 mM EDTA) cellen verwijderen. Centrifuge plaat bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.</li>
		<li>Cellen op ijs zet, verwijderen van toegevoegde FACS buffer en resuspendeer de cellen in 200 µL koude FACS buffer.</li>
		<li>Analyseren van monsters onmiddellijk door FACS verwerven van 2 x 104 gebeurtenissen in de levende cellen poort (zie stap 4.1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. FACS analyse
Nota: Verwijs naar Figuur 1 voor de gating strategie.
<ol><li>Met behulp van de voorwaartse scatter-gebied (FSC-A) versus kant gebied (WS-A) dichtheid scatterplot, gate op levende cellen door met uitzondering van evenementen met lagere niveaus van de voorwaartse scatter (dat wil zeggen, vuil en dode cellen).</li>
	<li>Binnen de levende cel bevolking, gebruik FSC-A tegenover doorsturen scatter hoogte (FSC-H) mobiele paren en aggregaten uit te sluiten. Dit is de singlet-poort.</li>
	<li>Met de gebeurtenissen in de singlet-poort, genereren een pH kleurstof enkele parameter histogram.</li>
	<li>Bepalen gemiddelde fluorescentie intensiteit. Vast percentage pH kleurstof-tau positieve cellen door met uitzondering van de negatieve cellen als bepaald met behulp van het enige besturingselement BV-2.</li>
</ol>5. Immunocomplexes opname met microscopie uitlezing
<ol><li>
Dag 1 – zaad de cellen
	<ol>
<li>Bereiden BV-2 cellen zoals beschreven in stappen 3.1.1, 3.1.2 en 3.1.3.</li>
		<li>Cellen tellen en resuspendeer hen in het kweken van middellange tot een eindconcentratie van 104 cellen/mL.</li>
		<li>Plaat met 150 µL celsuspensie (1,5 x 103) per putje in een poly-D-Lysine gecoat 96-Wells zwarte plaat met duidelijke vlakke bodem.</li>
		<li>Incubeer plaat bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 48 uur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dag 3 – opstellen Immunocomplexes Opmerking: Milde ultrasoonapparaat van gelabelde tau aggregaten vóór incubatie met antilichaam, werd uitgevoerd ter verbetering van de resultaten van de microscopie.<ol>
<li>Ontdooi pH kleurstof-tau op ijs en bewerk ultrasone trillingen ten met behulp van een sonde ultrasoonapparaat terwijl op ijs. Gebruik een amplitude van 15% (ultrasoonapparaat kracht van 250 W). Uitvoeren van 30 pulsen van 2 s en wacht 20 s tussen pulsen.</li>
		<li>65 μl per voorwaarde van een 500 nM oplossing van pH kleurstof-tau aggregaten in SFM voor te bereiden.</li>
		<li>Verdunde antilichamen in 65 µl van SFM tot een concentratie dubbele definitieve. Meng pH kleurstof-tau aggregaten en antilichamen in een 96-Wells u-bodemplaat. Eindvolume per voorwaarde is nu 130 µl en de pH kleurstof-tau aggregaten concentratie is 250 nM. Afdichting van de plaat verdunning en uit te broeden over nacht bij 37 ° C.</li>
		<li>Medium uit cel plaat verwijderen en vervangen met 150 µL van kweken medium aangevuld met 200 µg/mL heparine. Incubeer plaat 's nachts bij 37 ° C en 5% CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dag 4-Immunocomplexes opname
	<ol>
<li>Kweken medium verwijderen uit de BV-2 cellen. Breng 125 µL van immunocomplexes aan de cellen met behulp van een meerkanaalspipet.</li>
		<li>Incubeer de cellen met de immunocomplexes gedurende 1 uur en 45 minuten bij 37 ° C met 5% CO2. Vlek celkernen met DNA-specifieke kleurstof en zure organellen met een sonde die selectief lage pH cellulaire compartimenten vlekken. Incubeer de cellen 15 min bij 37 ° C met 5% CO2. Opmerking: Verdun de kleurstoffen in SFM.</li>
		<li>Live-cel beeldvorming met behulp van een hoog gehalte screening confocal systeem uitvoeren Temperatuur ingesteld op 37 ° C en 5% CO2. Voor afbeeldingen van hoge kwaliteit, gebruik een 63 X water onderdompeling doelstelling en verwerven van 0,5 µm vliegtuigen (20 per Z-stack) per verbeelde veld.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hefti, F., Goure, W. F., Jerecic, J., Iverson, K. S., Walicke, P. A., Krafft, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+case+for+soluble+A%CE%B2+oligomers+as+a+drug+target+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The case for soluble Aβ oligomers as a drug target in Alzheimer's disease.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 34 (5), 261-266 (2013).</li>
<li>Castillo-Carranza, D. L., Lasagna-Reeves, C. A., Kayed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+aggregates+as+immunotherapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+bioscience+%28Scholar+edition%29%22%5BJournal%5D)">Tau aggregates as immunotherapeutic targets.</a> Frontiers in bioscience (Scholar edition). 5, 426-438 (2013).</li>
<li>Martin, L., Latypova, X., Terro, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+of+tau+protein%3A+Implications+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications of tau protein: Implications for Alzheimer's disease.</a> Neurochemistry International. 58 (4), 458-471 (2011).</li>
<li>Holmes, B. B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+properties+of+Tau+protein%3A+The+importance+of+extracellular+Tau+as+a+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Prion-like properties of Tau protein: The importance of extracellular Tau as a therapeutic target.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (29), 19855-19861 (2014).</li>
<li>Giacobini, E., Gold, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer+disease+therapy--moving+from+amyloid-beta+to+tau%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Alzheimer disease therapy--moving from amyloid-beta to tau.</a> Nature Reviews Neurology. 9 (12), 677-686 (2013).</li>
<li>Asuni, A. A., Boutajangout, A., Quartermain, D., Sigurdsson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunotherapy+targeting+pathological+tau+conformers+in+a+tangle+mouse+model+reduces+brain+pathology+with+associated+functional+improvements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Immunotherapy targeting pathological tau conformers in a tangle mouse model reduces brain pathology with associated functional improvements.</a> Journal of Neuroscience. 27 (34), 9115-9129 (2007).</li>
<li>Boutajangout, A., Ingadottir, J., Davies, P., Sigurdsson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+immunization+targeting+pathological+phospho-tau+protein+in+a+mouse+model+reduces+functional+decline+and+clears+tau+aggregates+from+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Passive immunization targeting pathological phospho-tau protein in a mouse model reduces functional decline and clears tau aggregates from the brain.</a> Journal of Neurochemistry. 118 (4), 658-667 (2011).</li>
<li>Chai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+immunization+with+anti-Tau+antibodies+in+two+transgenic+models%3A+reduction+of+Tau+pathology+and+delay+of+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Passive immunization with anti-Tau antibodies in two transgenic models: reduction of Tau pathology and delay of disease progression.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (39), 34457-34467 (2011).</li>
<li>Yanamandra, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-tau+antibodies+that+block+tau+aggregate+seeding+in+vitro+markedly+decrease+pathology+and+improve+cognition+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Anti-tau antibodies that block tau aggregate seeding in vitro markedly decrease pathology and improve cognition in vivo.</a> Neuron. 80 (2), 402-414 (2013).</li>
<li>Luo, W., Liu, W., Hu, X., Hanna, M., Caravaca, A., Paul, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+internalization+and+degradation+of+pathological+tau+is+enhanced+by+an+anti-tau+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Microglial internalization and degradation of pathological tau is enhanced by an anti-tau monoclonal antibody.</a> Scientific Reports. 5, 11161(2015).</li>
<li>Funk, K. E., Mirbaha, H., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Therapeutic+Mechanisms+of+Tau+Antibodies%3A+Promoting+Microglial+Clearance+Versus+Blocking+Neuronal+Uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Distinct Therapeutic Mechanisms of Tau Antibodies: Promoting Microglial Clearance Versus Blocking Neuronal Uptake.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (35), 21652-21662 (2015).</li>
<li>Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+of+murine+microglial+cells+by+a+v-raf%2Fv-myc+carrying+retrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroimmunology%22%5BJournal%5D)">Immortalization of murine microglial cells by a v-raf/v-myc carrying retrovirus.</a> Journal of neuroimmunology. 27 (2-3), 229-237 (1990).</li>
<li>Apetri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+antigenic+motif+recognized+by+naturally+occurring+human+VH5-51%2FVL4-1+anti-tau+antibodies+with+distinct+functionalities%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+neuropathologica+communications%22%5BJournal%5D)">A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities.</a> Acta neuropathologica communications. 6 (1), 43(2018).</li>
<li>Schneider, A., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau-based+treatment+strategies+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Tau-based treatment strategies in neurodegenerative diseases.</a> Neurotherapeutics. 5 (3), 443-457 (2008).</li>
<li>Congdon, E. E., Gu, J., Sait, H. B., Sigurdsson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+uptake+into+neurons+occurs+primarily+via+clathrin-dependent+Fcgamma+receptor+endocytosis+and+is+a+prerequisite+for+acute+tau+protein+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Antibody uptake into neurons occurs primarily via clathrin-dependent Fcgamma receptor endocytosis and is a prerequisite for acute tau protein clearance.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (49), 35452-35465 (2013).</li>
<li>Bocchini, V., Mazzolla, R., Barluzzi, R., Blasi, E., Sick, P., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immortalized+cell+line+expresses+properties+of+activated+microglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells.</a> Journal of Neuroscience Research. 31 (4), 616-621 (1992).</li>
<li>Koenigsknecht, J. <a target="_blank" href="http://www.jneurosci.org/content/24/44/9838.short">Microglial Phagocytosis of Fibrillar β-Amyloid through a β1 Integrin-Dependent Mechanism.</a> Journal of Neuroscience. 24 (44), 9838-9846 (2004).</li>
<li>Kopec, K. K., Carroll, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+%CE%B2-Amyloid+Peptide+1-42+Induces+a+Phagocytic+Response+in+Murine+Microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's β-Amyloid Peptide 1-42 Induces a Phagocytic Response in Murine Microglia.</a> Journal of Neurochemistry. 71 (5), 2123-2131 (2002).</li>
<li>Marsh, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adaptive+immune+system+restrains+Alzheimer%27s+disease+pathogenesis+by+modulating+microglial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The adaptive immune system restrains Alzheimer's disease pathogenesis by modulating microglial function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (9), E1316-E1325 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Microglia, de resident hersenen immune cellen, onlangs hebben geïdentificeerd als belangrijke spelers in de antilichaam-gemedieerde therapeutische benaderingen voor tauopathies10,11. Antilichaam-gemedieerde tau goedkeuring door microglia, samen met het blokkeren van de neuronale opname9, remming of destabilisering van13,14 van de vorming van de fibril en de ontmijning van intraneuronal fibrillen via de lysosomale traject15, kunnen allemaal bijdragen aan de doeltreffendheid van de anti-tau antilichaam waargenomen in muismodel van tauopathy5,6,7,8,9.
We beschreven hier een cel-gebaseerde test om te beoordelen kwantitatief tau opname door microglia met als doel van het creëren van een instrument voor onderzoek beter karakteriseren de mechanismen van de actie van de anti-tau antilichamen.
Deze bepaling, van Funk et al. aangepast 11, gebruikt BV-2 cellen, die zijn vereeuwigd lymfkliertest microglial cellen. Terwijl ze niet volledig te vergelijken met primaire microglial cellen, ze beschikken over veel van de kenmerken van primaire microglia, met inbegrip van de mogelijkheid van robuust phagocytose Aβ zowel tau fibrillen11,16,17 ,18,19. Bovendien toonden ze een reproduceerbare gedrag in vitro waardoor ze zeer geschikt voor test ontwikkeling en kwantitatieve studies, waarvoor minimale experimentele variabiliteit. Naast dit, vereeuwigd cellijnen toestaan van hogere assay doorvoer en elimineren de noodzaak voor dierlijke offer ten opzichte van het gebruik van primaire microglia.
De aggregaten van de tau we in deze test gebruikten werden verkregen met behulp van de zeer reproduceerbaar in vitro aggregatie dat we onlangs beschreven procedure13, en Toon soortgelijk morfologie aan gekoppeld spiraalvormige filamenten (PHFs), geïsoleerd van de hersenen van AD patiënten. Terwijl we geen onverwachte resultaten die kunnen zijn veroorzaakt door tau aggregaten naleving van kunststof of glazen oppervlakken niet waarnemen deed, het gebruik van aggregaten van stabiele en goed gekarakteriseerd tau een cruciale rol gespeeld in de reproduceerbaarheid van deze test.
Een ander aspect dat aanzienlijk bijgedragen tot de reproduceerbaarheid assay was celdichtheid. Het aantal cellen per putje in het protocol beschreven vertegenwoordigen de optimale celdichtheid in de beschreven voorwaarden.
Anders dan wat Funk et al. 11 beschreven, we gelabeld tau aggregaten met een pH gevoelig kleurstof die aanzienlijk verhoogt de fluorescentie op internalisering in zure organellen, waardoor intracellulaire kwantificering. Dit, samen met de spijsvertering van de Trypsine van oppervlakte immunocomplexes en/of tau gebonden, garanties dat fluorescentie signaal gemeten door stroom cytometry is het resultaat van tau opname in plaats van binding aan het cellulaire oppervlak. Bovendien vereist het gebruik van een pH gevoelig kleurstof versnellingen detectie van verinnerlijkte tau aggregaten in microscopie experimenten zonder de behoefte aan het verteren van oppervlak gebonden immunocomplexes/tau aggregaten die zou dan cel opnieuw plating en herstel.
Wij ook verder geoptimaliseerd de uitlezing van de microscopie van onze assay, in vergelijking met wat al eerder beschreven11, met behulp van een zeer selectieve kleurstof voor zure organellen in onze microscopie experimenten waardoor ons niet alleen om te bevestigen antilichaam-gemedieerde tau opname, maar ook lokalisatie van tau aggregaten in het compartiment van de endolysosomal.
De bepaling die we ontwikkeld, heeft optimale specificiteit, wat resulteert in een goede experimentele venster waarmee een sterke scheiding tussen positieve en negatieve monsters. Interessant is dat de bepaling niet indirect verschillen in antilichaam affiniteit vertegenwoordigt dus een krachtig hulpmiddel om te studeren van anti-tau antilichaam effector functies worden ontdekt.

De ziekte van Alzheimer (AD) is een progressieve neurodegeneratieve aandoening gekenmerkt door de conformationele verandering en zelf-assemblage van β amyloïde peptide en tau-eiwit in pathologische aggregaten. De normale oplosbare amyloïde β-peptide wordt omgezet in oligomere en fibrillar amyloïde β, terwijl abnormaal gefosforyleerd tau als oligomeren en neurofibrillary klitten1,2 accumuleert. Deze eiwit-aggregaten veroorzaken neuronale dood leiden tot geheugenverlies en latere progressieve cognitieve daling. Andere factoren, met inbegrip van niet-productieve neuroinflammation en een verminderde capaciteit om te misfolded eiwitten, duidelijk kunnen verergeren en versnellen van de ziekte. Momenteel interventiestrategieën tegen AD grotendeels symptomatische verlichting geven, maar er is geen ziekte-aanpassen genezen of voorkomen.
Een groeiende hoeveelheid bewijs suggereert een sleutelrol van hyperphosphorylated tau aggregaten in de pathologie van AD. In de niet-pathologische toestand is tau een native ongevouwen eiwit dat bindt aan microtubuli en bevordert hun vergadering in de neuronale cytoskelet. Tau zodra hyperphosphorylated, het losgekoppeld van het cytoskelet en clusters in tau aggregaten in het neuron, die worden verondersteld te veroorzaken de meeste van de pathologie AD3is gekoppeld. Geaggregeerde tau begint eerst intracellulair accumuleren, maar naarmate de ziekte vordert, wordt uitgegaan van vrijgesteld van getroffen neuronen in de extracellulaire ruimte, waaruit het kan worden overgenomen door aangrenzende of synaptically verbonden gezonde neuronen in een " prion-achtige wijze". Eenmaal geïnternaliseerd, induceert de tau aggregaat verdere tau aggregatie via templated conformationele verandering4.
Volgens deze hypothese, kunnen therapieën kunnen onderbreken tau zaaien vertragen of omkeren van het verloop van tau-gemedieerde neurodegeneratieve ziekten. Ter ondersteuning van dit Toon muizen vatbaar voor tauopathy gemaakt door genetische mutatie en passief ingespoten met anti-tau antilichamen minder tau pathologie en verbeterde cognitieve functie5,6,7,8 ,9. De mechanismen waarmee therapeutische antistoffen pathologie verminderen blijven echter nog steeds ongrijpbaar.
Een van de voorgestelde mechanismen is antilichaam-gemedieerde opname en de ontmijning van pathologische geaggregeerde vormen van tau door microglia, de resident immuuncellen van de hersenen. Recente publicaties suggereren dat microglia kan efficiënt internaliseren en degraderen pathologische tau soorten en dit vermogen wordt versterkt door anti-tau antilichamen via een Fc-afhankelijk mechanisme waarbij Fc receptoren uitgedrukt op het oppervlak van Microglia en receptor gemedieerde fagocytose10,11. Deze gegevens identificeren microglia als potentieel belangrijke effectoren van therapeutische antistoffen.
Hierin beschrijven we een cel-gebaseerde test om te beoordelen kwantitatief tau opname door microglia. Gegevens die zijn gegenereerd met deze test kunnen helpen ophelderen van de mechanismen van de actie van de anti-tau antilichamen dus vertegenwoordigen een nuttig instrument om anti-tau antilichamen naar verdere stappen van hun ontwikkeling als potentiële AD behandeling.

<table><tbody><tr><td>BV-2 cellen</td><td>ICLC Interlab Cell Line Collection</td><td>ATL03001</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat Buffered Saline (PBS) (1x)</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA 0.05%</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4,5 g/dL glucose</td><td>Gibco</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Gibco</td><td>10091-148</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>EasYFlask</td><td>Nunc</td><td>156499 / 159910</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo Groen STP-ester</td><td>Life Technologies</td><td>P35369&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Natrium Bicarbonaat pH 8,5 100 mM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650-100ml</td><td></td></tr><tr><td>PD10 kolommen</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>BCA Eiwit Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR&nbsp;multiwell kweekplaten</td><td>Greiner</td><td>665180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 96-Well Assay Plates</td><td>Falcon</td><td>353910</td><td></td></tr><tr><td>Heparine</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>H3393-50KU</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA 0,25%</td><td>Sigma</td><td>T4049-100ml</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7030-100G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M, pH8</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Canto II</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 Oplossing (20 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Diep Rood</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L12492</td><td></td></tr><tr><td>Opera Phenix</td><td>Perkin Helmer</td><td>HH14000000</td><td></td></tr></tbody></table>

cel-gebaseerde assay te bestuderen van antilichaam-gemedieerde tau goedkeuring door microglia

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

De ziekte van Alzheimer (AD) is een progressieve neurodegeneratieve aandoening waarin geaggregeerde tau en amyloïde eiwitten zich ophopen in de hersenen waardoor neuronale dysfunctie, die uiteindelijk tot cognitieve achteruitgang leidt. Hyperphosphorylated tau aggregaten in het neuron worden verondersteld te veroorzaken de meeste van de pathologie AD is gekoppeld. Deze aggregaten zijn verondersteld worden vrijgegeven in de extracellulaire compartiment en in beslag genomen door aangrenzende gezonde neuronen waar ze induceren verder tau aggregatie. Deze "prion-achtige" verspreiding kan worden onderbroken door antilichamen bindende en extracellulaire tau aggregaten zoals in preklinische Muismodellen van advertentie te "neutraliseren" staat. Een van de voorgestelde mechanismen waarop therapeutische antistoffen pathologie verminderen is antilichaam-gemedieerde opname en de ontmijning van pathologische geaggregeerde vormen van tau door microglia. Hier beschrijven we een kwantitatieve cel-gebaseerde test om te beoordelen tau opname door microglia. Deze test maakt gebruik van de muis microglial cellijn BV-2, zorgt voor een hoge specificiteit, lage variabiliteit en middellange doorvoer. Gegevens die zijn gegenereerd met deze test kan bijdragen tot een betere karakterisering van anti-tau antilichaam effector functies.

Geaggregeerde recombinante tau werd covalent bestempeld met een pH-gevoelige groene kleurstof. Deze kleurstof verhoogt drastisch de fluorescentie bij de internalisering in zure organellen, waardoor voor intracellulaire kwantificering. Gelabelde tau aggregaten werden geïncubeerd met anti-tau monoklonale antilichamen. In het bijzonder, we gebruikten een chimeer versie (muis IgG1 Fc regio) van CBTAU-28.1. Deze menselijke antilichamen bindt aan de N-terminale invoegen regio van tau en vermag binden in vitro gegenereerd tau fibrillen13. In deze test, wij ook een affiniteit-verbeterde versie van CBTAU-28.1-dmCBTAU-28.1 getest. Fab fragmenten van CBTAU-28.1, in de ouderlijke en hoge-affiniteit mutant opmaken en een muis IgG1 isotype controle werden gebruikt als besturingselementen.
BV-2 cellen werden geïncubeerd met de pre-gevormde immunocomplexes of geaggregeerde tau alleen voor twee uur in de aanwezigheid van heparine te blokkeren van antilichaam-onafhankelijke tau opname. Na incubatie cellen waren trypsinized om te verwijderen het tau gebonden aan de extracellulaire membraan en werden geanalyseerd voor tau opname door stroom cytometry. Zoals we onlangs13 beschreven, vastgesteld we hebben dat CBTAU-28.1 varianten bevorderd opname voor tau in BV-2 cellen op een dosis-afhankelijke manier. De opname was Fc gemedieerde aangezien CBTAU-28.1 Fab-fragmenten niet basale tau opname (Figuur 2 verhogen). Bovendien, het hoge affiniteit dmCBTAU-28.1 antilichaam gemedieerde tau opname in BV-2 cellen in hogere mate dan het wild-type antilichaam (Figuur 2).
Antilichaam-gemedieerde tau opname- en lokalisatie van tau aggregaten in het compartiment van de endolysosomal werd bevestigd door confocale microscopie (Figuur 3) waar de zure cellulaire compartiment was gekleurd met behulp van een sonde selectieve voor lage pH organellen. Intracellulaire puncta van groene pH kleurstof label tau aggregaten werden waargenomen in de cellen die werden geïncubeerd met CBTAU-28.1. Bovendien, intracellulaire tau aggregaten vaak colocalized met de lage pH compartiment selectieve rode kleurstof zo suggereren aanwezigheid van tau aggregaten in de zure organellen. CBTAU-28.1 Fab-fragmenten verhogen niet tau opname nogmaals wordt gemeld een Fc-receptor gemedieerde internalisering mechanisme (Figuur 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58576/58576fig1.jpg"> Figuur 1: Gating strategie gebruikt in stroom cytometry analyse te detecteren tau internalisering door BV-2 cellen. Voorbeeld van gegevens uit BV-2 enige besturingselement (A-C), isotype controle (D-F) en dmCBTAU-28.1 (G-ik) worden weergegeven. BV-2-celpopulatie was omheinde op een perceel van FSC-A vs SSC-A dichtheid met uitzondering van puin en dode cellen (A, D, G). BV-2 cellen werden vervolgens verder omheinde op een perceel van FSC-A vs FSC-H dichtheid cel paren en aggregaten (B, E, H) te sluiten. Eencellige poort werd gebruikt voor het genereren van een pH kleurstof (FITC in deze representatieve resultaten) enkele parameter histogram (C, F, ik) en meetkundige gemiddelde fluorescentie intensiteit bepalen. Als alternatief, percentage pH kleurstof-tau positieve cellen werd berekend exclusief negatieve cellen zoals bepaald met behulp van het enige besturingselement BV-2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58576/58576fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58576/58576fig2.jpg"> Figuur 2: CBTAU-28.1 bemiddelt opname van tau aggregaten in microglial BV-2 cellen. Geaggregeerde recombinante tau was covalent geëtiketteerd met groene fluorescentie pH-gevoelige kleurstof en geïncubeerd met een Chimeer muis-versie van het menselijk antilichaam voor anti-tau CBTAU-28.1, haar affiniteit verbeterde formaat aan, dmCBTAU-28.1, de bijbehorende Fab fragmenten, een muis IgG1 isotype controle antilichaam of geen antilichaam (tau aggregaten alleen). Immunocomplexes werden vervolgens geïncubeerd met BV-2 cellen gedurende twee uur in de aanwezigheid van heparine te blokkeren van antilichaam-onafhankelijke tau opname. Verbreiding van immunocomplexes werd beoordeeld door stroom cytometry en uitgedrukt als het meetkundige gemiddelde (GM) van de intensiteit van de fluorescentie (A) of percentage voor tau positieve (tau +) cellen (B). Foutbalken in (A) geven de standaarddeviatie van twee onafhankelijke experimenten, terwijl b toont een honkslag experiment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58576/58576fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58576/58576fig3.jpg"> Figuur 3: Tau aggregaten zijn geïnternaliseerd door BV-2 cellen en lokaliseren in cellulaire zure organellen. Voorgevormde tau-antilichaam immunocomplexes werden gedurende twee uur in de aanwezigheid van heparine te blokkeren van antilichaam-onafhankelijke opname geïncubeerd met BV-2 cellen. Na incubatie werden kernen gekleurd met een DNA-specifieke blauwe kleurstof en de zure cellulaire compartiment met een lage pH compartiment selectieve rode kleurstof. Live-cel imaging geopenbaard intracellulaire puncta van gelabelde tau aggregaten (groen) binnen de cellen die werden geïncubeerd met CBTAU-28.1 en dmCBTAU-28.1, maar niet met het besturingselement isotype. Bovendien, intracellulaire tau aggregaten vaak colocalized met de rode kleurstof (geel) dus suggereren aanwezigheid van tau aggregaten in de zure cellulaire compartiment. CBTAU-28.1 Fab-fragmenten verhogen tau opname met vermelding van een mechanisme voor Fc-receptor gemedieerde internalisering niet. Afbeeldingen vertegenwoordigen projecties van de maximumlichtsterkte van een 20 vliegtuigen Z-stack (0,5 µm vliegtuigen) verworven met een 63 X water onderdompeling doelstelling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58576/58576fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Hier beschrijven we een cel-gebaseerde test om te beoordelen kwantitatief tau opname door microglia met als doel van het creëren van een instrument voor onderzoek beter karakteriseren de mechanismen van de actie van de anti-tau antilichamen.

Cel-gebaseerde Assay te bestuderen van antilichaam-gemedieerde Tau goedkeuring door Microglia

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...

Een van de voorgestelde mechanismen waarmee therapeutische anti-Tau-antilichamen pathologie bij de ziekte van Alzheimer verminderen, is opname in klaring van pathologische geaggregeerde voormalige Tau door microglia. Hier presenteren we de cel basis test om Tau opname te beoordelen door microglia. Deze test is een nuttig onderzoeksinstrument om het werkingsmechanisme van anti-Tau-antilichamen beter te karakteriseren.Bereid op de eerste dag van het experiment de BV-2 cellen voor door ze eerst te wassen met 1x PBS in de kolf waarin ze zijn gekweekt. Vervolgens broeden ze met 05% trypsin EDTA op 37 graden Celsius en 5%C02 totdat ze loskomen van de kolf. Schort de cellen in cultuurmedium opnieuw op door drie tot vijf keer op en neer te pipetten.Tel cellen en bereid een celsuspensie voor met een uiteindelijke concentratie van 100.000 cellen per milliliter in kweekmedium met 200 microgram per milliliter heparine. Voeg 250 microliters van deze cel suspensie per put in een 96 goed weefsel cultuur platte bodemplaat. Incubeer de plaat op 37 graden Celsius met 5%C02, 's nachts.Na het ontdooien van eerder bereide pH-dye-Tau aggregaten op ijs, verdun ze in 65 microliter per aandoening van serumvrij medium, om een 500 nanomolar oplossing te maken. Verdun antilichamen in 65 microliter serumvrij medium om de gewenste concentratie te verdubbelen. Meng pH dye-Tau aggregaten en antilichamen in een 96 goed U-bodem plaat.Verzegel deze verdunningsplaat en broed 's nachts uit op 37 graden Celsius. Op de volgende dag verwijder het medium van de 96 put plaat met BV-2 cellen. Was de cellen in elke put met 100 microliter kamertemperatuur 1x PBS.Verwijder PBS van de BV-2 celplaat. Gebruik een multi-channel pipet om 125 microliter aminocomplexen van de verdunningsplaat over te brengen naar elke put van een 96 goed BV-2 celplaat, en ontcubeer gedurende twee uur bij 37 graden Celsius met 5% CO2. Na de incubatie verwijder de aminocomplexen uit de cellen en was de cellen in elke put met 100 microliters kamertemperatuur 1x PBS.Voeg na het verwijderen van de 1x PBS 50 microliter van 25% trypsine EDTA toe en broed gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius met 5% CO2. Voeg daarna 200 microliter kweekmedium toe en hang de put opnieuw op door op en neer te pipetten om de cellen los te maken. Breng de cellen naar een 96 goed U-bodem plaat en centrifugeren op 400 x g gedurende 5 minuten op 4 graden Celsius.Leg de plaat op ijs en verwijder het medium. Voeg 150 microliters ijskoud 1x PBS toe en centrifuge opnieuw op 400 g gedurende 5 minuten bij 4 graden Celsius. Leg de plaat op ijs en was opnieuw door eerder toegevoegde 1x PBS te verwijderen en 150 microliters ijskoude PBS per put toe te voegen.Centrifuge opnieuw onder dezelfde omstandigheden. Leg de plaat op ijs en was de cellen door het verwijderen van de eerder toegevoegde PBS en het toevoegen van 150 microliters FACS buffer per put. Centrifuge opnieuw op 400 g gedurende 5 minuten bij 4 graden Celsius.Plaats de plaat op ijs en verwijder de eerder toegevoegde FACS buffer en schort de cellen opnieuw op in 200 microliters FACS buffer per put. Onmiddellijk overgaan tot analyse door FACS tot 20.000 gebeurtenissen in de live cel poort te verwerven. Voor FACS-analyse gebruikt u het voorwaartse verspreidingsgebied of FSCA versus side scatter area of SSCA density plot to gate on live cells by excluding events with lower forward scatter levels, such as debris and dead cells.Gebruik vervolgens binnen de live celpopulatie FSCA versus forward scatter height of FSCH om een singlet gate te maken en cel doubletten en aggregaten uit te sluiten. Gebruik vervolgens de gebeurtenissen in de singlet-poort om een pH-kleurstof te genereren met één parameter histogram. Gebruik het gegenereerde histogram om eerst de gemiddelde fluorescentieintensiteit te bepalen.Daarna bepalen percentage van pH kleurstof-Tau positieve cellen door het uitsluiten van negatieve cellen zoals bepaald MET BV-2's enige controle. CBTau-28.1 antilichamen bevorderen een opname van Tau in BV-2 cellen op een dosisafhankelijke manier, zoals blijkt uit flow cytometrie. De hoge affiniteit dubbele mutant CBTau-28.1 antilichaam bemiddelde Tau opname in de BV-2 cellen in een hogere mate dan het wilde type antilichaam.CBTau-28.1 Fab fragmenten niet verhogen basale Tau opname met vermelding van een FC receptor bemiddelde internalisatie mechanisme. Confocale microscopie bevestigde antilichaam bemiddelde toename van Tau opname. Groene pH-kleurstof gelabeld Tau aggregaten vaak co-gelokaliseerd met lysotracker rode kleurstof gekleurd zure organellen dus suggereren aanwezigheid van Tau aggregaten in een endolysosomale compartiment.CBTau-28.1 Fab fragmenten niet verhogen Tau opname weer aangeeft dat de opname inderdaad FC bemiddeld. De test die we net beschreven stelt ons in staat om specifiek consequent kwantificeren antilichaam bemiddelde Tau opname door microglia. Gegevens gegenereerd met deze test kan helpen bij het ophelderen van het werkingsmechanisme van anti-Tau antilichamen dus vertegenwoordigen een nuttig instrument om anti-Tau antilichamen vooraf naar verdere stap in hun ontwikkeling als potentiële AD behandeling.

cell-based-assay-to-study-antibody-mediated-tau-clearance-by-microglia

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Microglia zijn gevestigd macrofagen dat de eerste lijn van verdediging en het immuunsysteem de bewaking van het centrale zenuwstelsel te bieden. MicroRNA zijn moleculen die een belangrijke rol spelen in tal van fysiologische processen, zoals activatie en differentiatie van macrofagen. In dit artikel beschrijven we de methode voor het meten van microRNA's in de microglia.

Detectie van microRNA&#39;s in Microglia door Real-time PCR in Normal CNS en tijdens ontstekingsprocessen

This video showcases a cell-based assay quantifying Tau uptake by murine microglia using pH-sensitive fluorescent-labeled Tau aggregates, analyzed via fluorescence-activated cell sorting for a quantitative assessment.

A Cell-Based Assay to Assess the Tau Protein Uptake by Microglia

Een sleutel tot succesvolle onderzoek van microglia biologie is het behoud van microglia immunofunction ex vivo tijdens isolatie van CZS-weefsel. Isoleren microglia via roterende schudden resulteert in zeer zuivere en immunofunctional celculturen zoals beoordeeld door fluorescerende beeldvorming, immunocytochemie, en ELISA na microglia-activatie met de pro-inflammatoire stimuli lipopolysaccharide (LPS) en Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolatie van corticale Microglia met Conserven immunofenotype en functionaliteit van Muriene Pasgeborenen

Dit artikel beschrijft een protocol voor het visualiseren Ap amyloïde plaques in de ziekte van Alzheimer muismodellen behulp methoxy-X04, die de bloed-hersenbarrière doorkruist en selectief bindt aan P-geplooide platen in dichte kern Ap-plaques. Hiermee pre-screening van plaque bevattende weefselcoupes voorafgaand aan immunokleuring en verwerking voor elektronenmicroscopie.

Correlatieve Licht en Electron Microscopy om te studeren Microgliale Interacties met β-amyloïde plaques

Microglia (immuuncellen van de hersenen), worden gebruikt als een surrogaat biosensor om te bepalen hoe nanodeeltjes neurotoxiciteit beïnvloeden. We beschrijven een reeks experimenten die zijn ontworpen om de microgliale respons op nanodeeltjes te meten en de blootstelling van hypothalamusneuronen aan supernatant van geactiveerde microglia om neurotoxiciteit te bepalen.

Microglia als een surrogaat Biosensor om te bepalen nanodeeltjes Neurotoxiciteit

Dit protocol Details een procedure waarin menselijke neuronale culturen zijn transduced met lentiviral constructen codering voor Mutant Human tau. Transduced culturen weer te geven tau aggregaten en geassocieerde pathologieën.

Een in vitro model voor het bestuderen van Tau-aggregatie met behulp van Lentiviral-gemedieerde transductie van menselijke neuronen

Tau is een neuronale eiwit aanwezig zowel in het cytoplasma, waar het bindt microtubuli, en in de Nucleus, waar het oefent onconventionele functies, met inbegrip van de modulatie van de ziekte van Alzheimer-gerelateerde genen. Hier beschrijven we een methode om de functie van nucleaire tau te onderzoeken, terwijl alle interferenties uit cytoplasmatische tau worden uitgesloten.

Modulatie van Tau Subcellulaire lokalisatie als een instrument om de uitdrukking van ziektegerelateerde genen te onderzoeken

Dit protocol beschrijft een stapsgewijze workflow voor immunofluorescerende cokleuring van IBA1 en TMEM119, naast de analyse van microgliale dichtheid, distributie en morfologie, evenals perifere myeloïde celinfiltratie in muizen hersenweefsel.

Immunofluorescentie kleuring met behulp van IBA1 en TMEM119 voor Microgliale dichtheid, morfologie en perifere myeloïde Celinfiltratie analyse in Muizenhersenen

Primaire microgliaculturen worden vaak gebruikt om nieuwe ontstekingsremmende moleculen te evalueren. Het huidige protocol beschrijft een reproduceerbare en relevante methode om microglia magnetisch te isoleren van pasgeboren pups.

Magnetische isolatie van microgliale cellen van neonate muis voor primaire celculturen

Hier presenteren we twee protocollen om microgliale inslokking van vGLUT1-positieve synapsen en pHRodo Red-gelabelde ruwe synaptosomen te kwantificeren met behulp van flowcytometrie.

Kwantificering van microgliale inslokking van synaptisch materiaal met behulp van flowcytometrie

Leer een cel-gebaseerde assay om antilichaam-gemedieerde opname van tau-eiwitten door BV-2 microglia te kwantificeren. Deze methode helpt onderzoekers het werkingsmechanisme van anti-tau antilichamen te begrijpen.

Cel-gebaseerde Assay te bestuderen van antilichaam-gemedieerde Tau goedkeuring door Microglia

Meer video's verkennen