Vastleggen en identificatie van RNA-bindende proteïnen met behulp van klik chemie-bijgewoonde RNA-interactome vangen (CARIC) strategie

Deze methode, CARIC, kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van post-transcriptie van genrecreatie door het verstrekken van een uitgebreide telling van RNA-bindende eiwitten. Het belangrijkste voordeel van CARIC is het vermogen om eiwitten vast te leggen die gebonden zijn aan verschillende soorten RNAs, zoals mRNAs en niet-coderende RNAs. Deze methode kan worden gebruikt in verschillende soorten en het organisme om de RNA eiwit interactie op het werk te bestuderen.

Ten eerste, cultuur HeLa cellen in aangevuld DMEM op 37 graden Celsius in een vijf procent CO2-atmosfeer. Wanneer de cellen bereiken ongeveer 80 procent samenvloeiing vervang de cultuur medium op elk gerecht met 15 milliliter van voorverwarmd, vers medium. Voeg 15 microliter van 100 millimolar EU toe aan elk gerecht aan een laatste concentratie van één millimolar.

Voor experimentele en geen UV-controle monsters toe te voegen 7,5 microliter van 100 millimolar vier SU aan elk gerecht. Bedek de gerechten met folie en cultuur de cellen voor 16 uur met behulp van de vorige voorwaarden. Voeg hierna de helft van het vorige bedrag van de EU en/of vier SU toe aan de juiste platen en blijf nog twee uur kweken.

Om te beginnen in vivo cross-linking, verwijder de cultuur medium en was elke schotel drie keer met PBS met behulp van vijf milliliter PBS per wasbeurt. Verwijder de resterende PBS zoveel mogelijk. Voor de experimentele en geen vier SU controle monsters, plaats de gerechten op ijs met het deksel verwijderd.

Gebruik een UV-dwars-linker om de cellen te bestralen met UV-licht op 365 nanometer en op twee jules per centimeter in het kwadraat. Voor de geen UV-controle monsters, plaats de gerechten op ijs en bescherm ze tegen licht. Voeg vervolgens een milliliter prelysebuffer toe aan elk gerecht.

Gebruik een rubberen cellifter om de cellen te schrapen en de prelysesuspensie in een buis van 15 milliliter te verzamelen. Voeg prelysebuffer toe aan een buis met de suspensie van twee schotels die het totale volume aanpassen tot zes milliliter. Voeg vervolgens een gelijk volume van R lysis buffer.

Steek de cel lysate door een spuit met een smalle naald meerdere malen totdat het lysaat is duidelijk en homogeen. Broed het lysaat op vier graden Celsius met zachte rotatie gedurende een uur. Na deze verdunnen het lysaat in 20 volumes van verdunning buffer en verdeel het in 15 milliliter fracties in 15 milliliter untrafiltratie buizen, moleculaire cutoff van 10 kilodaltons.

Met behulp van een swingende emmer rotator, draai de buizen op 4000 keer G en vier graden Celsius gedurende ongeveer 15 minuten tot elke fractie is geconcentreerd op een volume minder dan een milliliter. Voeg 14 milliliter verdunningsbuffer toe aan elke geconcentreerde lysaatfractie en herhaal het concentratieproces. Combineer vervolgens de fracties en concentraat ze tot een volume van zes milliliter met behulp van het eerder beschreven concentratieproces.

Bereid eerst de reactiemix voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg deze reactiemix toe aan de zes milliliter voorgeklaard lysaat en meng goed. Voeg 162,5 microliter van het verminderen van reagens en meng goed.

Incubeer bij kamertemperatuur op een orbitale shaker bij 800 rpm gedurende twee uur. Hierna de reactie geblust door vijf minuten lang vijf millimolar EDTA toe te voegen en op de orbitale shaker bij kamertemperatuur uit te broeden. Vervolgens splits het reactiemengsel tussen twee buizen van 50 milliliter, elk met vier volumes voorgekoelde methanol en incubeer bij negatieve 30 graden Celsius gedurende 30 minuten.

Centrifuge op 4000 keer G en vier graden Celsius gedurende 15 minuten. Gooi de supernatant en voeg tussen de een en twee milliliter voorgekoelde methanol aan de pellet. Pipet op en neer te breken van de pellet ervoor te zorgen dat de pellet eindigt volledig opgehangen met geen zichtbare brokken.

Herhaal het centrifugatie- en resuspensieproces twee keer. Trek hierna de resterende methanol zo veel mogelijk voorzichtig uit om ervoor te zorgen dat de pellet niet wordt verstoord. Voeg 10 milliliter reconstitutiebuffer en pipet op en neer toe om de pellet op te lossen.

Centrifuge op 4000 keer G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Breng vervolgens de supernatant over naar een nieuwe buis om ervoor te zorgen dat 20 microliter van het monster wordt verzameld voor kwaliteitscontrole. Breng het opgeruimde en gereconstrueerde monster over aan de bereide streptavidin agarose kralen.

Incubeer op vier graden Celsius met zachte rotatie 's nachts. Draai de kralen op 4000 keer G gedurende vijf minuten. Breng de supernatant naar een nieuwe buis om ervoor te zorgen dat 20 microliter van het monster te verzamelen voor kwaliteitscontrole.

Was de kralen met 10 milliliter wasbuffer A.Incubate met zachte rotatie bij 12 tpm en bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Draai dan vijf minuten op 4000 keer G. Verwijder het supernatant en herhaal het was- en centrifugatieproces nogmaals.

Herhaal dit wasproces voor wasbuffer B en wasbuffer C zoals beschreven in het tekstprotocol. Was hierna de kralen met 10 milliliter 50 millimolar Tris hydrochloride. Draai de kralen vijf minuten naar beneden op 4000 keer G.

Verwijder de supernatant en splits de kralen gelijkmatig tussen twee 1,5 microcentrifuge buizen. Om te beginnen met het ontwijken van de gevangen RNP's, voeg 400 microliters van voorbereide biotine elutie buffer aan 400 microliter gewassen, geregeld kralen. Incubeer op een orbitale shaker bij 1500 tpm bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.

Dan incubeer op een orbitale shaker met een hitteblok bij 1500 tpm en 65 graden Celsius gedurende 10 minuten. Centrifuge de kralen op 7800 keer G voor een minuut en het verzamelen van de ontweken RNP. Voeg 400 microliters verse biotine elutiebuffer toe aan de kralen.

Herhaal het incubatie- en centrifugatieproces om een tweede elute te verzamelen en combineer de twee elutes in een enkele buis van 15 milliliter. Voeg vervolgens drie volumes verdunningsbuffer toe aan de gecombineerde RNP-elutes om de concentratie van SDS te verlagen. Met behulp van een 0,5 milliliter ultra filtratie buis, concentraat het monster tot ongeveer 40 microliter zoals beschreven in het tekstprotocol.

Voeg 0,5 microgram per microliter RNase A toe en broed gedurende twee uur bij 37 graden Celsius om RBPs van cross-linked RNase vrij te geven. Verzamel twee microliters van RBPs voor kwaliteitscontrole. Bij het optimaliseren van CARIC-protocollen zijn kwaliteitscontrolestappen van cruciaal belang.

Representatieve kwaliteitscontrole van de klik gelabelde monsters wordt uitgevoerd via in-gel fluorescentieanalyses. Alleen het dubbel gelabelde monster toont een sterke uitstrijkjeband op het hoge molecuulgewicht dat het signaal van cross-linked RNP's vertegenwoordigt. Het RNP-signaal wordt afgeschaft door de vier SU- of EU-landen weg te laten. Het kan ook worden afgeschaft door de spijsvertering met RNase A.In sommige gevallen een sterke besmeurde band wordt waargenomen in de no four SU controle monster.

Deze band vertegenwoordigt de gelabelde uncross-linked RNase die zal degraderen tijdens de hitte innaturatie in de meeste gevallen. Kwaliteitscontrole van de affinity poll dataficiency wordt beoordeeld door middel van western blot analyse die de biotine signalen in de monsters toont, zowel voor pulldown en na pulldown. Een zilveren kleuring analyse van de gevangen RBPs blijkt dat voor HeLa cellen, de algemene totale capture efficiëntie is tussen 0,05 en 0,1 procent van de input eiwitten.

Tijdens een poging tot deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de RNase gevoelig zijn voor ribonucleases. Houd de experimentele omgeving zo schoon mogelijk om de misvorming van RNase te verminderen. Na deze procedure kan eiwit almake-identificatie met behulp van massaspectrometrie worden voorgevormd om de ijzeren omsluitende eiwitten te onthullen.

Na de ontwikkeling ervan zal de CARIC-techniek de weg vrijmaken voor een meer omvattend begrip van de ot-verordening per posttranscriptie op het werk.