Name: Vastleggen en identificatie van RNA-bindende proteÃ¯nen met behulp van klik chemie-bijgewoonde RNA-interactome vangen (CARIC) strategie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Leer de CARIC-methode om RNA-bindende eiwitten te identificeren in HeLa-cellen met behulp van klikchemie. Dit protocol helpt onderzoekers bij het bestuderen van post-transcriptionele genregulatie en RNA-eiwitinteracties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door de nationale Natural Science Foundation van China subsidies 91753206, 21425204, en 21521003 en door de nationale sleutel onderzoeks- en ontwikkelingsproject 2016YFA0501500.

<ol><li>Djebali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+transcription+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape of transcription in human cells.</a> Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).</li>
<li>Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+census+of+human+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">A census of human RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).</li>
<li>Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+in+Mendelian+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins in Mendelian disease.</a> Trends in Genetics. 29 (5), 318-327 (2013).</li>
<li>Nussbacher, J. K., Batra, R., Lagier-Tourenne, C., Yeo, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+in+neurodegeneration%3A+Seq+and+you+shall+receive%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins in neurodegeneration: Seq and you shall receive.</a> Trends in Neuroscience. 38 (4), 226-236 (2015).</li>
<li>Jazurek, M., Ciesiolka, A., Starega-Roslan, J., Bilinska, K., Krzyzosiak, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+proteins+that+bind+to+specific+RNAs+-+focus+on+simple+repeat+expansion+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Identifying proteins that bind to specific RNAs - focus on simple repeat expansion diseases.</a> Nucleic Acids Research. 44 (19), 9050-9070 (2016).</li>
<li>Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brave+new+world+of+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A brave new world of RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).</li>
<li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Molecular Cell. 46 (5), 674-690 (2012).</li>
<li>Beckmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+proteomes+from+yeast+to+man+harbour+conserved+enigmRBPs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs.</a> Nature Communications. 6, 10127-10135 (2015).</li>
<li>Conrad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+interactome+capture+of+the+human+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Serial interactome capture of the human cell nucleus.</a> Nature Communications. 7, 11212-11222 (2016).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+identification+of+RNA-binding+domains+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive identification of RNA-binding domains in human cells.</a> Molecular Cell. 63 (4), 696-710 (2016).</li>
<li>Kwon, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+repertoire+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 20 (9), 1122-1130 (2013).</li>
<li>Liepelt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+RNA-binding+proteins+in+macrophages+by+interactome+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of RNA-binding proteins in macrophages by interactome capture.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 15 (8), 2699-2714 (2016).</li>
<li>Liao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardiomyocyte+RNA-binding+proteome%3A+Links+to+intermediary+metabolism+and+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The cardiomyocyte RNA-binding proteome: Links to intermediary metabolism and heart disease.</a> Cell Reports. 16 (5), 1456-1469 (2016).</li>
<li>Mitchell, S. F., Jain, S., She, M. P., Parker, R. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nsmb/journal/v20/n1/abs/nsmb.2468.html">Global analysis of yeast mRNPs.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 127-133 (2013).</li>
<li>Matia-González, A. M., Laing, E. E., Gerber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+mRNA-binding+proteomes+in+eukaryotic+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Conserved mRNA-binding proteomes in eukaryotic organisms.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 22 (12), 1027-1033 (2015).</li>
<li>Despic, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+RNA-protein+interactions+underlie+the+zebrafish+maternal-to-zygotic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamic RNA-protein interactions underlie the zebrafish maternal-to-zygotic transition.</a> Genome Research. 27 (7), 1184-1194 (2017).</li>
<li>Wessels, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+of+the+early+fly+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome of the early fly embryo.</a> Genome Research. 26 (7), 1000-1009 (2016).</li>
<li>Sysoev, V. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+changes+of+the+RNA-bound+proteome+during+the+maternal-to-zygotic+transition+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Global changes of the RNA-bound proteome during the maternal-to-zygotic transition in Drosophila.</a> Nature Communications. 7, 12128(2016).</li>
<li>Reichel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+planta+determination+of+the+mRNA-binding+proteome+of+Arabidopsis+etiolated+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">In planta determination of the mRNA-binding proteome of Arabidopsis etiolated seedlings.</a> Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).</li>
<li>Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+repertoire+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana.</a> Scientific Reports. 6, 29766-29778 (2016).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV+crosslinked+mRNA-binding+proteins+captured+from+leaf+mesophyll+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts.</a> Plant Methods. 12, 42-53 (2016).</li>
<li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+of+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biology. 17, 147-164 (2016).</li>
<li>Lueong, S., Merce, C., Fischer, B., Hoheisel, J. D., Erben, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+regulatory+networks+in+Trypanosoma+brucei%3A+insights+into+the+role+of+the+mRNA-binding+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Gene expression regulatory networks in Trypanosoma brucei: insights into the role of the mRNA-binding proteome.</a> Molecular Microbiology. 100 (3), 457-471 (2016).</li>
<li>Nandan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+identification+of+mRNA-binding+proteins+of+Leishmania+donovani+by+interactome+capture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comprehensive identification of mRNA-binding proteins of Leishmania donovani by interactome capture.</a> PLoS ONE. 12 (1), e0170068(2017).</li>
<li>Jankowsky, E., Harris, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+nonspecificity+in+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).</li>
<li>Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+discovery+of+coding+and+noncoding+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide discovery of coding and noncoding RNA-binding proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), E3879-E3887 (2018).</li>
<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li>
<li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).</li>
<li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+micro-purification%2C+enrichment%2C+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), e47(2015).</li>
<li>Grammel, M., Hang, H., Conrad, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+reporters+for+monitoring+RNA+synthesis+and+poly%28A%29+tail+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Chemical reporters for monitoring RNA synthesis and poly(A) tail dynamics.</a> ChemBioChem. 13 (8), 1112-1115 (2012).</li>
<li>Curanovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+profiling+of+stimulus-induced+polyadenylation+in+cells+using+a+poly%28A%29+trap%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Global profiling of stimulus-induced polyadenylation in cells using a poly(A) trap.</a> Nature Chemical Biology. 9 (11), 671-673 (2013).</li>
<li>Zheng, Y. X., Beal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+evaluation+of+an+alkyne-modified+ATP+analog+for+enzymatic+incorporation+into+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (7), 1799-1802 (2016).</li>
<li>Nainar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+incorporation+of+azide+functionality+into+cellular+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Metabolic incorporation of azide functionality into cellular RNA.</a> ChemBioChem. 17 (22), 2149-2152 (2016).</li>
<li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+the+interactome+of+newly+transcribed+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Capturing the interactome of newly transcribed RNA.</a> Nature Methods. 15 (3), 213-220 (2018).</li>
<li>Holmqvist, E., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins in bacteria.</a> Nature Reviews Microbiology. , Published online (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De handhaving van eerlijke RNA integriteit is een van de sleutels tot succesvolle CARIC experimenten. Met passende liganden van Cu(I) en zorgvuldige bewerking, kan aantasting van het RNA aanzienlijk worden verkleind, hoewel gedeeltelijke afbraak was waargenomen. De verhoudingen van de vervanging van de EU en 4SU in experimentele monsters zijn respectievelijk 1,18 procent en 0,46%, (gegevens niet worden weergegeven). Voor intact RNAs met een lengte van 2.000 nt, ~ 90% van de RNAs bevatten ten minste één EU en één 4SU. Voo...

Het menselijk genoom is omgezet in de verschillende soorten codering en noncoding RNAs (ncRNAs), met inbegrip van mRNAs, rRNAs, tRNAs, kleine nucleaire RNAs (snRNAs), kleine nucleolar RNAs (snoRNAs) en lang niet-coderende RNAs (lncRNAs)1. De meeste van deze RNAs bezitten kleding van RBPs en fungeren als ribonucleoprotein deeltjes (RNPs)2. Een uitgebreide omschrijving van de RBPs is daarom een noodzakelijke voorwaarde voor een goed begrip van het regelgevende netwerk tussen RNAs en RBPs, die is betrokken bij verschillende ziekten bij de mens3,-4,5.
De afgelopen jaren getuige geweest van een geweldige impuls van RBPs ontdekt in diverse eukaryotic systemen2,6, met inbegrip van menselijke7,8,9,10,11, muis12,13,14, gist9,15,16, zebravis17, Drosophila melanogaster18,19 , Caenorhabditis elegans16, Arabidopsis thaliana20,21,22, en menselijke parasieten23,24,25 . Deze voorschotten hebben bevorderd door een RBP vangen strategie ontwikkeld door Castello et al. 7 en Baltz et al. 8 in 2012, die combineert in vivo UV cross-linking van RNA haar interacterende eiwitten, oligo(dT) van poly(A) RNAs en vastleggen massaspectrometrie (MS)-gebaseerd proteomic profilering. Gezien het feit dat poly(A) meestal op volwassen mRNAs, die goed zijn voor slechts ~ 3-5% van de eukaryote transcriptome26, bestaat is deze gebruikte strategie echter niet geschikt voor het vastleggen van de RBPs interactie met non-poly(A) RNAs, met inbegrip van de meeste ncRNAs en pre-mRNAs.
Wij rapporteren hier, de gedetailleerde procedures van een onlangs ontwikkelde strategie voor de vangst van de transcriptome bestrijkende van zowel poly(A) als non-poly(A) RBPs27. CARIC genoemd, deze strategie combineert in vivo UV dwarsbinding en metabole labelen van RNAs met photoactivatable en "aanklikbaar" nucleoside-analogen (die bevatten een bioorthogonal functionele groep die klik reactie kan deelnemen), 4 - thiouridine (4SU), en 5-ethynyluridine (EU). Stappen die zijn de sleutel tot het ideale resultaten met de CARIC strategie zijn efficiënte metabole labeling, UV-dwarsbinding en klik op reactie en de handhaving van de integriteit van het RNA. Omdat Cu(I) gebruikt als de katalysator in Klik op reactie leiden de versnippering van de RNAs tot kan, is een Cu(I) ligand die RNA fragmentatie verminderen kan is essentieel. We beschrijven hoe u efficiënt Klik reacties in cel lysates zonder ernstige achteruitgang van RNA veroorzaakt.
Hoewel RBP vangen en identificatie in HeLa cellen alleen in dit protocol wordt beschreven, kan de CARIC strategie tot verschillende celtypes, en eventueel aan levende organismen worden toegepast. Naast RBP vastleggen bevat dit protocol ook gestroomlijnde stapsgewijze procedures voor de bereiding van de monsters van de MS en eiwit identificatie en kwantificering, die kan nuttig zijn voor degenen die niet vertrouwd zijn met proteomic experimenten.

<table><tbody><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin &amp; Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>EU (5-ethynyl uridine)</td><td>Wuhu Huaren Co.</td><td>CAS:69075-42-9</td><td></td></tr><tr><td>4SU (4-thiouridine)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4509</td><td></td></tr><tr><td>10&times;PBS (Phosphate-Buffered Saline)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>UV cross-linker</td><td>UVP</td><td>CL-1000</td><td>Uitgerust met 365-nm UV lamp</td></tr><tr><td>DEPC (Diethyl pyrocarbonate)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5758</td><td>Om water te behandelen. Zeer giftig!</td></tr><tr><td>Tris&middot;HCl, pH 7.5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>62476</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Biodee</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-free protease inhibitor cocktail</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88265</td><td>Eén tablet voor 50 mL lysis buffer.</td></tr><tr><td>LDS (Lithium dodecyl sulfate)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9781</td><td></td></tr><tr><td>15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff)</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff)</td><td>Millipore</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin magnetic beads</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88816</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>41639</td><td></td></tr><tr><td>Azide-biotin</td><td>Click Chemistry Tools</td><td>AZ104</td><td></td></tr><tr><td>Copper(II) sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1297</td><td></td></tr><tr><td>THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine]</td><td>Sigma Aldrich</td><td>762342</td><td></td></tr><tr><td>Sodium ascorbate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Azide-Cy5</td><td>Click Chemistry Tools</td><td>AZ118</td><td></td></tr><tr><td>LDS sample buffer (4&times;)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>10% bis-Tris gel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0301BOX</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R6513</td><td></td></tr><tr><td>SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15525017</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether]</td><td>J&amp;K</td><td>315442</td><td></td></tr><tr><td>Triethanolamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900257</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20353</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>61743</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td></td><td></td><td>Versie: 1.5.5.1</td></tr></tbody></table>

vastleggen en identificatie van rna-bindende proteÃ¯nen met behulp van klik chemie-bijgewoonde rna-interactome vangen (caric) strategie

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Een uitgebreide identificatie van RNA-bindende proteÃ¯nen (RBPs) is de sleutel tot het begrijpen van de posttranscriptional regelgevende netwerk in cellen. Een veel gebruikte strategie voor het vastleggen van RBP exploiteert de polyadenylatie [poly(A)] van doel de RNAs, die meestal op eukaryotische volwassen mRNAs optreedt, meeste bindende proteïnen van non-poly(A) RNAs ongeïdentificeerde verlaten. Hier beschrijven we de gedetailleerde procedures van een onlangs gerapporteerde methode genoemd Klik chemie-bijgewoonde RNA-interactome vangst (CARIC), waarmee de transcriptome bestrijkende inname van zowel poly(A) als non-poly(A) RBPs door het combineren van de metabole etikettering van RNAs, in vivo UV dwarsbinding, en bioorthogonal coderen.

De representatieve resultaten van kwaliteitscontrole stappen worden gepresenteerd. De resultaten omvatten de cijfers van de analyse van de in-gel fluorescentie beschreven in stap 2.3.2 (Figuur 1), de westelijke vlekkenanalyse beschreven in stap 4.1.3 (figuur 2A) en de zilver-kleuring analyse beschreven in stap 4.2.2 (figuur 2B). De kwaliteitscontrole stappen zijn cruciaal voor de optimalisatie van CA...

Een gedetailleerd protocol voor de toepassing van de klik chemie-bijgewoonde RNA-interactome vastleggen (CARIC) strategie ter identificatie van eiwitten bindende naar beide taalcode-instellingen en noncoding RNAs wordt gepresenteerd.

Vastleggen en identificatie van RNA-bindende proteÃ¯nen met behulp van klik chemie-bijgewoonde RNA-interactome vangen (CARIC) strategie

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Deze methode, CARIC, kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van post-transcriptie van genrecreatie door het verstrekken van een uitgebreide telling van RNA-bindende eiwitten. Het belangrijkste voordeel van CARIC is het vermogen om eiwitten vast te leggen die gebonden zijn aan verschillende soorten RNAs, zoals mRNAs en niet-coderende RNAs. Deze methode kan worden gebruikt in verschillende soorten en het organisme om de RNA eiwit interactie op het werk te bestuderen.Ten eerste, cultuur HeLa cellen in aangevuld DMEM op 37 graden Celsius in een vijf procent CO2-atmosfeer. Wanneer de cellen bereiken ongeveer 80 procent samenvloeiing vervang de cultuur medium op elk gerecht met 15 milliliter van voorverwarmd, vers medium. Voeg 15 microliter van 100 millimolar EU toe aan elk gerecht aan een laatste concentratie van één millimolar.Voor experimentele en geen UV-controle monsters toe te voegen 7,5 microliter van 100 millimolar vier SU aan elk gerecht. Bedek de gerechten met folie en cultuur de cellen voor 16 uur met behulp van de vorige voorwaarden. Voeg hierna de helft van het vorige bedrag van de EU en/of vier SU toe aan de juiste platen en blijf nog twee uur kweken.Om te beginnen in vivo cross-linking, verwijder de cultuur medium en was elke schotel drie keer met PBS met behulp van vijf milliliter PBS per wasbeurt. Verwijder de resterende PBS zoveel mogelijk. Voor de experimentele en geen vier SU controle monsters, plaats de gerechten op ijs met het deksel verwijderd.Gebruik een UV-dwars-linker om de cellen te bestralen met UV-licht op 365 nanometer en op twee jules per centimeter in het kwadraat. Voor de geen UV-controle monsters, plaats de gerechten op ijs en bescherm ze tegen licht. Voeg vervolgens een milliliter prelysebuffer toe aan elk gerecht.Gebruik een rubberen cellifter om de cellen te schrapen en de prelysesuspensie in een buis van 15 milliliter te verzamelen. Voeg prelysebuffer toe aan een buis met de suspensie van twee schotels die het totale volume aanpassen tot zes milliliter. Voeg vervolgens een gelijk volume van R lysis buffer.Steek de cel lysate door een spuit met een smalle naald meerdere malen totdat het lysaat is duidelijk en homogeen. Broed het lysaat op vier graden Celsius met zachte rotatie gedurende een uur. Na deze verdunnen het lysaat in 20 volumes van verdunning buffer en verdeel het in 15 milliliter fracties in 15 milliliter untrafiltratie buizen, moleculaire cutoff van 10 kilodaltons.Met behulp van een swingende emmer rotator, draai de buizen op 4000 keer G en vier graden Celsius gedurende ongeveer 15 minuten tot elke fractie is geconcentreerd op een volume minder dan een milliliter. Voeg 14 milliliter verdunningsbuffer toe aan elke geconcentreerde lysaatfractie en herhaal het concentratieproces. Combineer vervolgens de fracties en concentraat ze tot een volume van zes milliliter met behulp van het eerder beschreven concentratieproces.Bereid eerst de reactiemix voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg deze reactiemix toe aan de zes milliliter voorgeklaard lysaat en meng goed. Voeg 162,5 microliter van het verminderen van reagens en meng goed.Incubeer bij kamertemperatuur op een orbitale shaker bij 800 rpm gedurende twee uur. Hierna de reactie geblust door vijf minuten lang vijf millimolar EDTA toe te voegen en op de orbitale shaker bij kamertemperatuur uit te broeden. Vervolgens splits het reactiemengsel tussen twee buizen van 50 milliliter, elk met vier volumes voorgekoelde methanol en incubeer bij negatieve 30 graden Celsius gedurende 30 minuten.Centrifuge op 4000 keer G en vier graden Celsius gedurende 15 minuten. Gooi de supernatant en voeg tussen de een en twee milliliter voorgekoelde methanol aan de pellet. Pipet op en neer te breken van de pellet ervoor te zorgen dat de pellet eindigt volledig opgehangen met geen zichtbare brokken.Herhaal het centrifugatie- en resuspensieproces twee keer. Trek hierna de resterende methanol zo veel mogelijk voorzichtig uit om ervoor te zorgen dat de pellet niet wordt verstoord. Voeg 10 milliliter reconstitutiebuffer en pipet op en neer toe om de pellet op te lossen.Centrifuge op 4000 keer G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Breng vervolgens de supernatant over naar een nieuwe buis om ervoor te zorgen dat 20 microliter van het monster wordt verzameld voor kwaliteitscontrole. Breng het opgeruimde en gereconstrueerde monster over aan de bereide streptavidin agarose kralen.Incubeer op vier graden Celsius met zachte rotatie 's nachts. Draai de kralen op 4000 keer G gedurende vijf minuten. Breng de supernatant naar een nieuwe buis om ervoor te zorgen dat 20 microliter van het monster te verzamelen voor kwaliteitscontrole.Was de kralen met 10 milliliter wasbuffer A.Incubate met zachte rotatie bij 12 tpm en bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Draai dan vijf minuten op 4000 keer G. Verwijder het supernatant en herhaal het was- en centrifugatieproces nogmaals.Herhaal dit wasproces voor wasbuffer B en wasbuffer C zoals beschreven in het tekstprotocol. Was hierna de kralen met 10 milliliter 50 millimolar Tris hydrochloride. Draai de kralen vijf minuten naar beneden op 4000 keer G.Verwijder de supernatant en splits de kralen gelijkmatig tussen twee 1,5 microcentrifuge buizen. Om te beginnen met het ontwijken van de gevangen RNP's, voeg 400 microliters van voorbereide biotine elutie buffer aan 400 microliter gewassen, geregeld kralen. Incubeer op een orbitale shaker bij 1500 tpm bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.Dan incubeer op een orbitale shaker met een hitteblok bij 1500 tpm en 65 graden Celsius gedurende 10 minuten. Centrifuge de kralen op 7800 keer G voor een minuut en het verzamelen van de ontweken RNP. Voeg 400 microliters verse biotine elutiebuffer toe aan de kralen.Herhaal het incubatie- en centrifugatieproces om een tweede elute te verzamelen en combineer de twee elutes in een enkele buis van 15 milliliter. Voeg vervolgens drie volumes verdunningsbuffer toe aan de gecombineerde RNP-elutes om de concentratie van SDS te verlagen. Met behulp van een 0,5 milliliter ultra filtratie buis, concentraat het monster tot ongeveer 40 microliter zoals beschreven in het tekstprotocol.Voeg 0,5 microgram per microliter RNase A toe en broed gedurende twee uur bij 37 graden Celsius om RBPs van cross-linked RNase vrij te geven. Verzamel twee microliters van RBPs voor kwaliteitscontrole. Bij het optimaliseren van CARIC-protocollen zijn kwaliteitscontrolestappen van cruciaal belang.Representatieve kwaliteitscontrole van de klik gelabelde monsters wordt uitgevoerd via in-gel fluorescentieanalyses. Alleen het dubbel gelabelde monster toont een sterke uitstrijkjeband op het hoge molecuulgewicht dat het signaal van cross-linked RNP's vertegenwoordigt. Het RNP-signaal wordt afgeschaft door de vier SU- of EU-landen weg te laten. Het kan ook worden afgeschaft door de spijsvertering met RNase A.In sommige gevallen een sterke besmeurde band wordt waargenomen in de no four SU controle monster.Deze band vertegenwoordigt de gelabelde uncross-linked RNase die zal degraderen tijdens de hitte innaturatie in de meeste gevallen. Kwaliteitscontrole van de affinity poll dataficiency wordt beoordeeld door middel van western blot analyse die de biotine signalen in de monsters toont, zowel voor pulldown en na pulldown. Een zilveren kleuring analyse van de gevangen RBPs blijkt dat voor HeLa cellen, de algemene totale capture efficiëntie is tussen 0,05 en 0,1 procent van de input eiwitten.Tijdens een poging tot deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de RNase gevoelig zijn voor ribonucleases. Houd de experimentele omgeving zo schoon mogelijk om de misvorming van RNase te verminderen. Na deze procedure kan eiwit almake-identificatie met behulp van massaspectrometrie worden voorgevormd om de ijzeren omsluitende eiwitten te onthullen.Na de ontwikkeling ervan zal de CARIC-techniek de weg vrijmaken voor een meer omvattend begrip van de ot-verordening per posttranscriptie op het werk.

capture-identification-rna-binding-proteins-using-click-chemistry

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

RNA transcripten zijn onderworpen aan een uitgebreide posttranscriptionele regulering die wordt bemiddeld door een veelheid van trans-werkende RNA-bindende eiwitten (RBPs). Hier presenteren wij een generaliseerbaar methode om te identificeren precies en op een transcriptoom schaal van de RNA-bindingsplaatsen van RBPs.

PAR-Clip - een methode om Transcriptome-breed de bindingsplaatsen van RNA-bindende eiwitten te identificeren

This video demonstrates an in vitro RNA pull-down assay to identify RNA-binding proteins (RBPs), which interact with the adenylate-uridylate-rich element (ARE) sequences in mRNA. The target RBPs from a cell lysate are mixed with an RNA probe to form RNA-protein complexes. The complexes are isolated via affinity purification utilizing the affinity of the desthiobiotin label of the RNA probe to a streptavidin-labeled magnetic bead.

RNA-Protein Pull-Down Assay to Isolate RNA-Binding Proteins via Affinity Extraction

In this video, we describe the systematic evolution of ligands by the exponential enrichment (SELEX) method to identify specific RNA-binding sequences for a target protein of interest. The protein is incubated with a large pool of randomized RNA sequences, and the protein-binding RNA sequences are isolated, PCR-amplified, and sequenced to identify their protein-binding sites.

SELEX-Based In Vitro Binding Assay to Identify RNA-Protein Interactions

Een RNA-pull-down protocol is hier geoptimaliseerd voor detectie van interacties tussen RNA-bindende eiwitten (RBPs) en niet-coderende en coderende RNAs. Een RNA fragment uit androgeenreceptor (AR) werd gebruikt als een voorbeeld om te demonstreren hoe de RBP halen uit lystate primaire bruine adipocyten.

Detectie van RNA-bindende eiwitten door<em&gt; In Vitro</em&gt; RNA Pull-down in Adipocyte Cultuur

RNA-eiwitinteracties liggen aan de basis van veel cellulaire processen. Hier beschrijven we een in vivo methode om specifiek RNA te isoleren en nieuwe eiwitten te identificeren die ermee geassocieerd zijn. Dit kan nieuw licht werpen op hoe RNA's in de cel worden gereguleerd.

Novel-RNA-bindende eiwitten Isolatie door de snelle Methodologie

We beschrijven een protocol te identificeren van RNA-bindende proteÃ¯nen en kaart van de regio's hun RNA-bindende in levende cellen met behulp van UV-gemedieerde photocrosslinking en massaspectrometrie.

Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio 's

Hier presenteren we een protocol om endogene RNA binding sites of "Footprints" van RNA: proteïne (RNP) complexen uit zoogdiercellen te verrijken. Deze aanpak omvat twee immunoprecipitaties van RNP-subeenheden en wordt daarom nagesynchroniseerde RNA-immunoprecipitatie in tandem (RIPiT).

Identificatie van voetafdrukken van RNA: eiwitcomplexen via RNA-immunoprecipitatie in tandem gevolgd door sequencing (RIPiT-SEQ)

Hier presenteren we een gewijzigd CLIP-seq protocol genaamd FbioCLIP-seq met FLAG-biotine tandem zuivering om de RNA doelen van RNA-bindende eiwitten (RBPs) in zoogdiercellen te bepalen.

Transcriptome-Wide Profilering van Protein-RNA Interacties door Cross-Linking en Immunoprecipitatie Gemedieerd door FLAG-Biotine Tandem Purification

Kinetische cross-linking en analyse van cDNA is een methode die onderzoek mogelijk maakt naar de dynamiek van eiwit-RNA interacties in levende cellen met een hoge temporele resolutie. Hier wordt het protocol in detail beschreven, inclusief de groei van gistcellen, UV-crosslinking, oogsten, eiwitzuivering en voorbereidingsstappen voor de volgende generatie sequencingbibliotheek.

Monitoring van eiwit-RNA interactiedynamica in vivo bij hoge temporele resolutie met behulp van χCRAC

Hier presenteren we een geoptimaliseerde in vitro methode om eiwitinteractoren van specifieke RNA-sequenties te ontdekken, kwantificeren en valideren, met behulp van totaal eiwitextract uit menselijke cellen, streptavidineparels bedekt met gebiotinyleerd RNA en massaspectrometrie-analyse.

Een geoptimaliseerde kwantitatieve pull-down analyse van RNA-bindende eiwitten met behulp van kort gebiotinyleerd RNA

Leer de CARIC-methode om RNA-bindende eiwitten te identificeren in HeLa-cellen met behulp van klikchemie. Dit protocol helpt onderzoekers bij het bestuderen van post-transcriptionele genregulatie en RNA-eiwitinteracties.

Vastleggen en identificatie van RNA-bindende proteÃ¯nen met behulp van klik chemie-bijgewoonde RNA-interactome vangen (CARIC) strategie (Video) | JoVE Journal

Vastleggen en identificatie van RNA-bindende proteÃ¯nen met behulp van klik chemie-bijgewoonde RNA-interactome vangen (CARIC) strategie

Meer video's verkennen