Name: Biocytin herstel en 3D-reconstructies van gevulde Hippocampal CA2 interneuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Leer biocytin-herstel en 3D-reconstructie van hippocampale CA2-interneuronen na elektrofysiologische opnames. Deze methode optimaliseert ultrastructuurbehoud voor hoogwaardige morfologische analyses.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek heeft financiering ontvangen van Novartis Pharma (Bazel) en de medische Raad voor onderzoek toegekend aan Prof Alex Thomson, de biotechnologie en de biologische Sciences Research Council (BBSRC-BB/G008639/1), de fysiologische samenleving, de Europese Unie de Horizon 2020 kaderprogramma voor onderzoek en innovatie onder de specifieke Grant overeenkomst No. 720270 (menselijk brein Project SGA1) en onder de specifieke Grant overeenkomst No. 785907 (menselijk brein Project SGA2). We zijn zeer dankbaar Prof Alex Thomson voor het opzetten van het protocol in andere corticale gebieden, het garanderen van de financiering voor haar voortdurende steun voor dit project. Bijdragen van lab-leden die hebben geholpen met het optimaliseren van het protocol van herstel en gereconstrueerd CA2 neuronen dankbaar zijn erkend: J. Deuchars, H. Pawelzik, D. I. Hughes, A. P. Bannister, K. Eastlake, H. Trigg, N. A. Botcher.

<ol><li>Klausberger, T., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+diversity+and+temporal+dynamics%3A+the+unity+of+hippocampal+circuit+operations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations.</a> Science. 321, 53-57 (2008).</li>
<li>DeFelipe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+classification+and+nomenclature+of+cortical+GABAergic+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).</li>
<li>Bezaire, M. J., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+CA1+local+circuits%3A+knowledge+base+for+interneuron-pyramidal+cell+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of CA1 local circuits: knowledge base for interneuron-pyramidal cell connectivity.</a> Hippocampus. 23, 751-785 (2013).</li>
<li>Katona, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior-dependent+activity+patterns+of+GABAergic+long-range+projecting+neurons+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Behavior-dependent activity patterns of GABAergic long-range projecting neurons in the rat hippocampus.</a> Hippocampus. 27, 359-377 (2017).</li>
<li>Ali, A. B., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitating+pyramid+to+horizontal+oriens-alveus+interneurone+inputs%3A+dual+intracellular+recordings+in+slices+of+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Facilitating pyramid to horizontal oriens-alveus interneurone inputs: dual intracellular recordings in slices of rat hippocampus.</a> Journal of Physiology. 507, 185-199 (1998).</li>
<li>Ali, A. B., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+alpha+5+subunit-containing+GABAA+receptors+mediate+IPSPs+elicited+by+dendrite-preferring+cells+in+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex.</a> Cerebral Cortex. 18, 1260-1271 (2008).</li>
<li>Ali, A. B., Bannister, A. P., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+correlations+between+action+potential+duration+and+the+properties+of+synaptic+connections+in+layer+4+interneurones+in+neocortical+slices+from+juvenile+rats+and+adult+rat+and+cat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Robust correlations between action potential duration and the properties of synaptic connections in layer 4 interneurones in neocortical slices from juvenile rats and adult rat and cat.</a> Journal of Physiology. 580, 149-169 (2007).</li>
<li>Pawelzik, H., Bannister, A. P., Deuchars, J., Ilia, M., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+bistratified+cell+IPSPs+and+basket+cell+IPSPs+by+pentobarbitone+sodium%2C+diazepam+and+Zn2%2B%3A+dual+recordings+in+slices+of+adult+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modulation of bistratified cell IPSPs and basket cell IPSPs by pentobarbitone sodium, diazepam and Zn2+: dual recordings in slices of adult rat hippocampus.</a> European Journal of Neuroscience. 11, 3552-3564 (1999).</li>
<li>Pawelzik, H., Hughes, D. I., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4176080/">Physiological and morphological diversity of immunocytochemically defined parvalbumin-and cholecystokinin-positive interneurones in CA1 of the adult rat hippocampus.</a> Journal of Comparative Neurology. 443, 346-367 (2002).</li>
<li>Thomson, A. M., Lamy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maps+of+neocortical+local+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional maps of neocortical local circuitry.</a> Frontiers of Neuroscience. 1, 19-42 (2007).</li>
<li>Kepecs, A., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+cell+types+are+fit+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interneuron cell types are fit to function.</a> Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).</li>
<li>Wilent, W. B., Nitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrete+Place+Fields+of+Hippocampal+Formation+Interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Discrete Place Fields of Hippocampal Formation Interneurons.</a> Journal of Neurophysiology. 97, 4152-4161 (2007).</li>
<li>Hirsch, J. A., Martinez, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+processing+in+the+visual+cortical+column%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Laminar processing in the visual cortical column.</a> Current Opinion in Neurobiology. 16 (4), 377-384 (2006).</li>
<li>Kay, K., Sosa, M., Chung, J. E., Karlsson, M. P., Larkin, M. C., Frank, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hippocampal+network+for+spatial+coding+during+immobility+and+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A hippocampal network for spatial coding during immobility and sleep.</a> Nature. 531, 185-190 (2016).</li>
<li>Yu, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+hippocampal-cortical+memory+representations+for+experiences+associated+with+movement+versus+immobility%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Distinct hippocampal-cortical memory representations for experiences associated with movement versus immobility.</a> eLife. 6, e27621(2017).</li>
<li>Markram, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+and+Simulation+of+Neocortical+Microcircuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reconstruction and Simulation of Neocortical Microcircuitry.</a> Cell. 163, 456-492 (2015).</li>
<li>Van Geit, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BluePyOpt%3A+Leveraging+Open+Source+Software+and+Cloud+Infrastructure+to+Optimise+Model+Parameters+in+Neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">BluePyOpt: Leveraging Open Source Software and Cloud Infrastructure to Optimise Model Parameters in Neuroscience.</a> Frontiers in Neuroinformatics. 10, 17(2016).</li>
<li>Gal, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rich+cell-type-specific+network+topology+in+neocortical+microcircuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rich cell-type-specific network topology in neocortical microcircuitry.</a> Nature Neuroscience. 20, 1004-1013 (2017).</li>
<li>Thomson, A. M., West, D. C., Wang, Y., Bannister, A. P. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/cercor/article/12/9/936/383201">Synaptic connections and small circuits involving excitatory and inhibitory neurons in layers 2-5 of adult rat and cat neocortex: triple intracellular recordings and biocytin labeling in vitro.</a> Cerebral Cortex. 12, 936-953 (2002).</li>
<li>Mercer, A., West, D. C., Morris, O. T., Kirchhecker, S., Kerkhoff, J. E., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+connections+made+by+presynaptic+cortico-cortical+pyramidal+cells+in+layer+6+of+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Excitatory connections made by presynaptic cortico-cortical pyramidal cells in layer 6 of the neocortex.</a> Cerebral Cortex. 15, 1485-1496 (2005).</li>
<li>West, D. C., Mercer, A., Kirchhecker, S., Morris, O. T., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer+6+cortico-thalamic+pyramidal+cells+preferentially+innervate+interneurons+and+generate+facilitating+EPSPs%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Layer 6 cortico-thalamic pyramidal cells preferentially innervate interneurons and generate facilitating EPSPs.</a> Cerebral Cortex. 16, 200-211 (2006).</li>
<li>Bannister, A. P., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+properties+of+excitatory+synaptic+connections+involving+layer+4+pyramidal+cells+in+adult+rat+and+cat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Dynamic properties of excitatory synaptic connections involving layer 4 pyramidal cells in adult rat and cat neocortex.</a> Cerebral Cortex. 17, 2190-2203 (2007).</li>
<li>Mercer, A., Trigg, H. L., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+neurons+in+the+CA2+subfield+of+the+adult+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Characterization of neurons in the CA2 subfield of the adult rat hippocampus.</a> Journal of Neuroscience. 27 (7), 7329-7338 (2007).</li>
<li>Mercer, A., Eastlake, K., Trigg, H. L., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+circuitry+involving+parvalbumin-positive+basket+cells+in+the+CA2+region+of+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Local circuitry involving parvalbumin-positive basket cells in the CA2 region of the hippocampus.</a> Hippocampus. 22 (1), 43-56 (2012).</li>
<li>Mercer, A., Botcher, N. A., Eastlake, K., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SP-SR+interneurones%3A+a+novel+class+of+neurones+of+the+CA2+region+of+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">SP-SR interneurones: a novel class of neurones of the CA2 region of the hippocampus.</a> Hippocampus. 22 (8), 1758-1769 (2012).</li>
<li>Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemistry+and+electron+microscopy%3A+The+Preservation+of+Cellular+Ultrastructure+and+Enzymatic+Activity+by+Aldehyde+Fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytochemistry and electron microscopy: The Preservation of Cellular Ultrastructure and Enzymatic Activity by Aldehyde Fixation.</a> Journal of Cell Biology. 17, 19-58 (1963).</li>
<li>Somogyi, P., Takagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+note+on+the+use+of+picric+acid-paraformaldehyde-glutaraldehyde+fixative+for+correlated+light+and+electron+microscopic+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A note on the use of picric acid-paraformaldehyde-glutaraldehyde fixative for correlated light and electron microscopic immunocytochemistry.</a> Neuroscience. 7, 1779-1783 (1982).</li>
<li>Hughes, D. I., Bannister, A. P., Pawelzik, H., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+immunofluorescence%2C+peroxidase+labelling+and+ultrastructural+analysis+of+interneurones+following+prolonged+electrophysiological+recordings+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Double immunofluorescence, peroxidase labelling and ultrastructural analysis of interneurones following prolonged electrophysiological recordings in vitro.</a> Journal of Neuroscience Methods. 101, 107-116 (2000).</li>
<li>Botcher, N. A., Falck, J. E., Thomson, A. M., Mercer, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4176080/">Distributions of interneurones in the CA2 region of the rat hippocampus.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 104(2014).</li>
<li>Mercer, A., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cornu+Ammonis+Regions-Antecedents+of+Cortical+Layers%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Cornu Ammonis Regions-Antecedents of Cortical Layers?</a> Frontiers in Neuroanatomy. 11, 83(2017).</li>
<li>Blackman, A. V., Grabuschnig, S., Legenstein, R., Sjöström, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+manual+neuronal+reconstruction+from+biocytin+histology+or+2-photon+imaging%3A+morphometry+and+computer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">A comparison of manual neuronal reconstruction from biocytin histology or 2-photon imaging: morphometry and computer modeling.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 65(2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Elektrofysiologische opnames in vitro (Figuur 1 Ac,d en v.Chr., d) gecombineerd met histochemische en immunohistochemische procedures stellen de gedetailleerde morfologie, bindende eiwit calciumgehalte en identiteit van volwassen corticale interneuronen geregistreerd te worden onthuld. In de CA2-regio, deze techniek toegestaan van de studie van het lokale circuit voor de eerste keer en subklassen van interneuronen die had niet eerder zijn beschreven in CA1 of CA3 geopenbaard: breed dendritische en axonale arbor mand cellen (figuur 1B), bistratified cellen en SP-SR interneuronen.
Het protocol hier beschreven is geoptimaliseerd om de ultrastructuur van de neuronen te behouden en verkrijgen van uitstekende herstel van dendritische (inclusief stekels) én axonale arbors. Kritische stappen omvat het gebruik van de dubbele fixatie techniek om het contrast voor de lichte microscopie van26 verbeteren en de toevoeging van de kleefpoeders oplossing voor verbeteren van antilichaam penetratie en het behoud van de neuronale Glutaaraldehyde en pikrinezuur oplossing ultrastructuur27. Zachte bevriezen-ontdooien permeabilization geeft beter behoud van de fijne structuur, terwijl osmication en hars inbedding z-plane krimp28 verminderen. Bovendien, is de visualisatie van zeer fijne structuren (fijne axonen met kleine los bijvoorbeeld) verbeterd door de secties met H2O2 en NaBH4 om achtergrondkleuring aan het broeden. Contrast kan ook worden verhoogd met de toevoeging van NiCl2 tot de HRP-reactie.
De histologische procedure hier biedt uitstekende resultaten op het gebied van de reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid. Echter, de duur van de elektrofysiologische opnames zal bepalen de kwaliteit van de biocytin/fluorescentie kleuring, met kortere opnames meestal geassocieerd met de slechte axonale kleuring. De keuze voor het opnemen van protocollen (intracellulaire opnamen met behulp van scherpe elektroden vs. geheel-cel patch klemmen) kan ook van invloed biocytin bewaring en het behoud van de fijne anatomie.
Terwijl de problemen de fijne structuur behouden tijdens histologische verwerking die hier worden beschreven en de tijd die nodig is te reconstrueren op 100 X vergroting (1-4weeks afhankelijk van de complexiteit van de axon) worden gewaardeerd, deze methode geeft een accurate weergave van dendritische en axonale diameters. Het gebruik van minder veeleisende protocollen te onthullen biocytin-etikettering is begrijpelijk, evenwel dat deze vaak duidelijk visualisatie van fijne axonale takken. Wasmiddelen, ter bevordering van de toetreding van Avidin-HRP te onthullen van de biocytin en de antilichamen, vaak noodzakelijk zijn in het dik secties, maar fijne structuur kunnen verstoren. Neurowetenschappers zoeken voortdurend voor semi-automatische methoden van wederopbouw, maar voor blijft nu en voor met name biocytin-HRP axonen met handmatige wederopbouw de goudstandaard31.
Zeer gedetailleerd neuronale reconstructies, vooral nauwkeurige tekeningen van axonale los en knooppunten, de aanwezigheid of afwezigheid van myeline en meer in het algemeen de tekening van volledige axonale arbor, met de voorstelling van nauwkeurig axon-diameter langs verandert haar lengte, nadere informatie voor nauwkeurige identificatie van een verschillend type van interneurone. Hoewel veel interneuronen niet precies in een specifieke klasse passen kunnen, oplevert de techniek hierboven beschreven gecorreleerde gegevens over neuronale elektrofysiologische eigenschappen, de korte plasticiteit gekoppeld aan een specifiek type van verbinding en gedetailleerde neuronale reconstructies, waardoor het bedradingsschema, CA2 regio, bijvoorbeeld, tot in detail worden bestudeerd.
Mooie, gedetailleerde structuur is vaak vereenvoudigd in rekenmodellen. Terwijl begrijpelijk, resulteert dit in het verlies van de gegevens die in de toekomst kritiek zou kunnen blijken. Analyse van gedetailleerde 3D-reconstructies met parallelle synaptic gegevens kan de toevoeging van verdere criteria voor interneuronal indeling. Gegevens kunnen worden gestort in openbare bewaarplaatsen en gebruikt door modelbouwers te verkennen van het resultaat van sporadische veranderingen in de diameter van de axon en myelinisering over actiepotentiaal teeltmateriaal computationeel.

De cortex en hippocampus zijn structuren voor dergelijke complexiteit dat de classificatie van neuronale subtypen1,2,3,4, kaarten van de verbindingen tussen hen5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 en hoe deze circuits ondersteunt cognitieve functies12,13,14,15 zijn nog steeds onder intense studie en het onderwerp van voortdurende debat. Bijvoorbeeld, om te begrijpen van de details en de complexiteit van de circuits en te coördineren van gegevens die zijn verkregen uit vele verschillende studies, het is zeer nuttig om te kunnen worden gedefinieerd en worden de onderdelen beschreven, maar het blijft een zaak van debat hoe veel verschillende klassen van neuronen bestaan, of zelfs of het is mogelijk om te bepalen van alle neuronen als behorend tot een specifieke klasse. Computerhulpmiddelen die kunnen bouwen en testen van schakelingen met verschillende gradaties van complexiteit worden ontwikkelde16,17,18, maar de kern van deze inspanningen is de behoefte aan gedetailleerde studies van de celtypes en de eigenschappen van de verbindingen tussen hen. Een grote hoeveelheid informatie over het lokale circuit van de neocortex van volwassen ratten heeft al zijn verzameld via het protocol beschreven hier10,19,20,21, 22. Hoewel het "bedradingsschema" verre van compleet is, duidelijke patronen of regels naar voren zijn gekomen. Bovendien, hoewel sommige details verschillen, deze regels gelden naar twee soorten zoogdieren (rat en katten) en over verschillende neocortical regio's, waardoor de ontwikkeling van bouwstenen die dreigen te worden eveneens van toepassing op menselijke neocortex. De hier beschreven techniek wordt gebruikt om uit te breiden ons begrip van de functionele kaart van corticale circuits door het identificeren van de presynaptische en postsynaptisch neuronen die betrokken zijn bij verbindingen in de regio's die niet in detail onderzocht hebben, met behulp van een protocol waarmee uitstekende weefsel instandhouding en opmerkelijk kleuring herstel in volwassen hersenweefsel. Met deze methode zijn gegevens over het lokale circuit in CA2 en neuronale eigenschappen in dit subveld verzameld door het combineren van intracellulaire elektrofysiologische opnamen (gepaarde opnames met scherpe microelectrodes) met biocytin vullen, immunofluorescentie, histologisch procedures en zeer gedetailleerd neuronale reconstructies, waardoor directe vergelijking met de naburige CA regio's23,24,25.
De techniek die in dit artikel beschreven is ontwikkeld in de jaren voor gedetailleerde neuronale anatomie, waardoor de juiste indeling van de cellen en de hoge kwaliteit en nauwkeurige reconstructies van beide hun dendritische en axonale arbors, gegevens die kunnen worden gecorreleerd met elektrofysiologische gegevens verzameld uit gekoppelde opnamen met behulp van scherpe elektroden. Het histologische protocol is geoptimaliseerd om de ultrastructuur van de neuronen te behouden en verkrijgen van uitstekende herstel van dendritische (inclusief stekels) én axonale arbors. Bijvoorbeeld, geeft het beginsel van de dubbele fixatie techniek door in de eerste plaats onder te dompelen in een kleefpoeders oplossing en ten tweede na vaststelling in osmium tetroxide een goed contrast voor de lichte microscopie van26. Een kleine hoeveelheid Glutaaraldehyde en pikrinezuur oplossing worden toegevoegd aan de kleefpoeders oplossing ter verbetering van antilichaam penetratie en het behoud van de cellen ultrastructuur zoals in een eerdere studie27wordt voorgesteld. De permeabilization van de segmenten van de hersenen met behulp van de methode van de vries-dooi in combinatie met cryo-bescherming met sacharose, in plaats van een traditioneel wasmiddel, biedt ook een optimaal behoud van de weefsels voor gedetailleerde morfologische analyse van de opgenomen cellen. Bovendien, is de visualisatie met name van zeer fijne structuren verbeterd doordat achtergrondkleuring, met de incubations met waterstof peroxide (H2O2) en natriumboorhydride (NaBH4). Het toevoegen van nikkel chloride (NiCl2) aan de horseradish peroxidase (HRP) verhoogt reactie op het verkrijgen van een zwarte pigment reactieproduct ook u het contrast.
Het volgende protocol beschrijft de procedures gebruikt om na te gaan van uitstekende weefsel instandhouding en zeer gedetailleerde neuronale 3D-reconstructies na intracellulaire opnames in vitro. De beschrijving van de voorbereiding van het segment, intracellulaire gepaarde opnamen met behulp van scherpe elektroden en latere histologische procedures gebruikt in ons laboratorium geweest eerder gemelde28. Hoewel het protocol is van toepassing op de cellen intracellulair gevuld met biocytin in dikke sneden van 450 – 500 μm, kan hetzelfde protocol worden gebruikt na geheel-cel opnames. Echter, het gebruik van dunner segmenten zal resulteren in minder volledig reconstructies van de cellen.

<table><tbody><tr><td>Avidin-7-amino-4-methylcoumarine-3-azijnzuur (Avidin-AMCA) antilichaam- 20,8 mg/mL&nbsp;</td><td>Vector laboratories</td><td>A2008</td><td></td></tr><tr><td>Biocytine&nbsp; &ge;98% (TLC)</td><td>Sigma</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>3,5 diaminobenzidine (DAB) tablet, Voor het bereiden van 5 mL</td><td>Sigma</td><td>D4293</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan epoxyhars A</td><td>Sigma</td><td>44611</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan epoxyhars B</td><td>Sigma</td><td>44612</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan epoxyhars C</td><td>Sigma</td><td>44613</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan epoxyhars D</td><td>Sigma</td><td>44614</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, puriss. p.a., absoluut, &ge;99,8%</td><td>Sigma</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma</td><td>48723</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde-oplossing, graad I, 25 % in H2O</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol, &ge;99%&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Geitenserum</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Geiten-anti-muis fluoresceine isothiocyanate (FITC)- 14,3 mg/mL</td><td>Sigma</td><td>F2653</td><td></td></tr><tr><td>Geiten-anti-konijn Texas Red (TR)- 3,3 mg/mL</td><td>Invitrogen</td><td>T2767</td><td></td></tr><tr><td>Waterstofperoxide, 30% oplossing</td><td>Sigma</td><td>H-1009</td><td></td></tr><tr><td>Dompelolie, viscositeit 1.250 cSt (lit.)</td><td>Sigma</td><td>I0890</td><td></td></tr><tr><td>Nikkelchloride (NiCl2 . 6H2O)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>N5756</td><td></td></tr><tr><td>Osmiumtetraoxide, voor elektronenmicroscopie, 4% in H2O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, reagentiakwaliteit, kristallijn&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Picrinezuur, bevochtigd met water, &ge;98%</td><td>Sigma</td><td>197378</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatbuffer 1 M</td><td>Sigma</td><td>P3619</td><td></td></tr><tr><td>Propyleenoxide (C3H6O), 99%</td><td>Alfa Aesar&nbsp;</td><td>30765</td><td></td></tr><tr><td>Natriumtetrahydroboraat</td><td>VWR</td><td>27885.134</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher scientific</td><td>S/8600/53</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride, &ge;99,0%</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base, &ge;99,9%</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Antifade Montagemedium,, brekingsindex 1,45&nbsp;</td><td>Vector laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC HRP kit</td><td>Vector laboratories</td><td>PK6100</td><td></td></tr><tr><td>Gebruikte apparatuur&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Agar Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C4A Cupped aluminium planchettes&nbsp;</td><td>GA-MA &amp; ASSOCIATES, INC.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DMR microscoop&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-Cite 120PC Q&nbsp; fluorescentielichtbron&nbsp;</td><td>Excelitas Technologies&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DFC450 digitale microscoopcamera&nbsp;</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rapidograph technisch tekenpen 0,18mm&nbsp;</td><td>London graphics centre</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,18 mm rapidograph penpunt</td><td>London graphics centre</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rapidograph technisch tekenpen 0,25mm&nbsp;</td><td>London graphics centre</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,25 mm rapidograph penpunt</td><td>London graphics centre</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida-systeem inclusief PC-werkstation, stage, camera en joystick voor XYZ-stagebesturing</td><td>Microbrighfield (MBF) Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida-software versie 2017</td><td>Microbrighfield (MBF) Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CorelDRAW graphics Suite X5</td><td>Corel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Videobewerkingssoftware&nbsp;</td><td>Adobe Premiere Pro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glazerne flesjes 14 mL</td><td>Fisher scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

biocytin herstel en 3d-reconstructies van gevulde hippocampal ca2 interneuronen

Biocytin Recovery and 3D Reconstructions of Filled Hippocampal CA2 Interneurons

Informatie is van belang voor een groot aantal fundamenteel en klinisch wetenschappelijke vragen hoe corticale netwerkactiviteit verwerkt. Het protocol hier beschreven identificeert de elementaire bouwstenen van deze circuits. De diepgaande studies van corticale gebieden zorgt uiteindelijk voor andere wetenschappers met de circuit componenten die nodig zijn voor een goed begrip van hoe de hersenen verwerft, verwerkt en opgeslagen informatie en wat misgaat in ziekte, terwijl het elektrofysiologische en morfologische gegevens worden veel gebruikt door computationele neurowetenschappers in de bouw van model-netwerken die onderzoeken van informatieverwerking. Het protocol hier geschetst wordt beschreven hoe biocytin gevulde cellen opgenomen in de CA2-regio van de hippocampus worden hersteld en vervolgens herbouwd in 3D. Bovendien is het protocol beschreven de demonstratie van calcium bindend-proteïne of peptide inhoud in opgenomen interneuronen.

Neuronen in hippocampal CA2 werden gevuld met biocytin na elektrofysiologische opnamen (cijfers 1Ac, Ad en 1Bc, Bd). De plakjes waren vaste 's nachts na de opnames en de neurochemie en morfologische karakterisering van neuronen werden geopenbaard na het protocol beschreven hier.
De calcium-bindend-proteïne of eiwit inhoud van gevulde interneuronen werd bepaald door de segmenten eerst met primaire antilichamen en vervolgens met fluorescently geëtiketteerde secundaire antilichamen aan het broeden. De kenmerken van de vuren van de interneuronen tijdens de opnames zal bepalen de keuze van de primaire antilichamen gebruikt. Avidin-AMCA werd gebruikt om te visualiseren de interneuron biocytin gevulde en anti-muis fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) en geit anti-konijn Texas Red (TR) werden gebruikt voor het karakteriseren van de interneuronal neurochemie (figuur 1Bb).
Naar aanleiding van de fluorescentie visualisatie, een HRP-protocol is gebruikt voor het onthullen van de biocytin (figuur 1Ab). De fijn gedetailleerde anatomie van CA2 interneuronen was dan getrokken in 3D met behulp van een neuron wederopbouw software (Figuur 2 en Figuur 3a). Een video van een 3D reconstructie van een mand cel opgenomen en CA2 ingevuld wordt weergegeven in de Video. Neuronale reconstructies werden beschouwd als volledige als de dendritische en axonale arbors werden opgesloten in de diepte van het 450-500 μm segment. Arme axonale arbor kleuring werd beoordeeld door de aanwezigheid van afgeknotte takken met open uitgangen aan de boven- of de onderkant van het segment of door een kleuring die beperkt tot het eerste segment van de axon en zeer proximale takken was. Figuur 4 geeft de voorbeelden van een goede en een slechte HRP kleuring volgende biocytin visualisatie.
Morfometrische analyse van 3D-reconstructies (Figuur 3) kan worden uitgevoerd om aan te tonen van de tak complexiteit, soma oppervlakte en de oppervlakte en het volume van de dendritische en axonale arbors.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig1.jpg"> Figuur 1 : Neuronale reconstructies van twee soorten mand cellen opgenomen en in de hippocampal regio van CA2 gevuld en gecorreleerd elektrofysiologische gegevens die zijn verkregen na intracellulaire opnames in vitro. Dit cijfer is gewijzigd van eerdere studies23,24. ZO Stratum Oriens, SP Stratum Pyramidale, SR Stratum Radiatum, SLM Stratum Lacunosum Moleculare. (A) Aa: reconstructie van een cel mand CA2 met beperkte dendritische en axonale prieel met behulp van een tekening buis (1000 X). De dendrites zijn in het zwart, en de axon is in het rood. AB: Afbeelding van de cel van de biocytin gevulde mand na het protocol van de avidin-HRP hier beschreven. AC: Vertegenwoordiger spoor van spanning reacties op hyperpolarizing en depolarizing van de huidige injectie van een cel mand CA2 met beperkte dendritische en axonale arbor. AD: Voorbeeld van een piramide CA2 te smal arbor mand cel verbindingen opgenomen met behulp van scherpe elektroden. Samengestelde excitatory post synaptic potentieel (EPSP) gemiddelden Toon korte trein depressie blijkt tijdens reacties op treinen van drie pieken. (B) Ba: 2D wederopbouw van een cel mand CA2 met brede dendritische en axonale arbors met behulp van een tekening buis (1000 X). De dendritische boom van deze mand cel (in zwart) uitgebreid radiaal door alle lagen van de CA2 regio en horizontaal in SO, SP van de CA2 en CA3 regio's. Een horizontale dendriet bereikt ook de CA1-regio. De axon (in rood) uitgebreid tot de CA3 en CA1 regio's. BB: De biocytin gevulde (AMCA kleuring) mand cel was PV-immunopositive (FITC kleuring) en CB-immunonegative (Texas-rood kleuring). BC: Vertegenwoordiger spoor van spanning reacties op hyperpolarizing en depolarizing van de huidige injectie van een cel mand CA2 met brede dendritische en axonale arbor. BD: Samengestelde EPSP gemiddelden Toon korte trein versoepeling duidelijk tijdens reacties op treinen van drie pieken. Voorbeelden van andere soorten interneuronen opgenomen in CA2 kunnen worden gevonden in eerdere studies25,30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig2.jpg"> Figuur 2 : 3D cel lichaam wederopbouw. (A) 3D tracering van de cel lichaam. Weergave van de verschillende contouren getraceerd op verschillende z posities, terwijl zich te concentreren door de cel lichaam. (B) 3D-weergave van de verschillende contouren. (C) 3D-weergave van de cel lichaam onder een verschillende hoek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig3.jpg"> Figuur 3 : Morphometry analyses van 3D-neuronale reconstructies. (A) 3D reconstructie van een CA2 smalle arbor mand cel. Elke dendritische tak wordt vertegenwoordigd door een kleur (groen, blauw, rood en roze) en axon is in lichtblauw. (B) Dendrogram van de mand cel vertegenwoordigt het nummer van dendritische takken en de lengte van elk segment dat deel uitmaakt van bollen concentrische met het soma en 100 μm tussenpozen van het soma. De kleuren op de dendrogram overeenkomen met die van de dendrites in A. (C) voorbeeld van Morfometrische analyse uitgevoerd op piramidale cellen CA2 (aangepast van een eerdere studie23). Het aantal dendritische takken was uitgezet tegen de afstand van het soma CA2 piramidale cellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig4.jpg"> Figuur 4 : Voorbeelden van goede (A) en slechte (B) HRP kleuring. (A) herstel van de Biocytin bleek een zeer goed gevulde interneuron in CA2. Het lichaam van de cel (CB) is donker gekleurd en heeft duidelijke contouren. De dendrites zijn kraaltjes en sommige stekels (vertegenwoordigd door de rode sterren) weergegeven. De axonale arbor (A) is dicht en presenteert kleine los. (B) voorbeeld van een arme, dendritische en axonale kleuring van 2 piramidale cellen in CA2. De kleuring van het CB is flauw met geen duidelijk overzicht. Slechte kleuring wordt vaak geassocieerd met kortere elektrofysiologische opnames wat resulteert in de aanwezigheid van zeer weinig biocytin gevulde takken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a> 
Video 1: 3D neuronale reconstructie van een cel mand CA2 met beperkte dendritische arbor (ook CA2 smalle arbor mand cel genoemd) met haar soma in stratum pyramidale, dendrites verspreid over alle lagen en axon in CA2 stratum pyramidale en aangrenzende stratum oriens en radiatum. Heel weinig takken bereikt de proximale CA3 stratum oriens en CA3 stratum pyramidale. Deze cel was gevuld met biocytin na elektrofysiologische opnames en secties werden verwerkt met avidin-HRP volgens het protocol beschreven hier. Als gevolg van snijden, werd alleen de axon binnen de diepte van het segment teruggevonden, hoewel de dendrites intact zijn. Dendrites zijn in donker roze en axon in wit. Laag en regio grenzen zijn toegevoegd aan het begin van de video. 3D reconstructie door Georgia Economides-3D video door Svenja Falk. De video werd opgenomen met een neuron wederopbouw software zoals in stap 2.17 en bewerkt met een video-editing software. Link naar de video:30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/Figure_3.mp4" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Oplossingen gebruikt</td>
			<td>Samenstelling/instructies</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fixatie oplossing</td>
			<td>paraformaldehyde 4%, 0,2% verzadigd pikrinezuur oplossing, 0,025% Glutaaraldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer (PB)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,1 M fosfaatbuffer pH 7,6</td>
			<td>Voeg 100 mL 1 M fosfaat Buffer voorraad tot 900 mL gedestilleerd water</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7.4/7.5</td>
			<td>Voeg 10 mL 0,1 M fosfaatbuffer, 0.2 g KCl en 8.76 g NaCl tot 990 mL gedestilleerd water</td>
		</tr>
<tr>
<td>TRIS buffer pH 7.5</td>
			<td>Los 5,72 g van Tris Hydrochloride en 1,66 g van Tris Base in 50 mL gedestilleerd water. Maak vervolgens met gedestilleerd water aan tot 1 liter.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gebufferde Glutaaraldehyde en paraformaldehyde kleefpoeders oplossing</td>
			<td>paraformaldehyde 4%, 0,2% verzadigd pikrinezuur oplossing, 0,025% Glutaaraldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer.</td>
		</tr>
<tr>
<td>ABC oplossing</td>
			<td>Oplossing voor ten minste 30 minuten vóór gebruik van de ABC-kit worden gemaakt. 1 druppel van oplossing A en 1 druppel van oplossing B toevoegen aan 2,5 mL PBS.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Durcupan epoxyhars:</td>
			<td>Om 20 potten: 20 g van onderdeel A, 20 g van onderdeel B, 0.6 g van onderdeel C en 0,4 g van onderdeel D -</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Beschermen de balans tegen morsen van vloeistoffen door die betrekking hebben op de plaat met een cirkel filtreerpapier. Weeg zorgvuldig de reagentia in een bekerglas van de tripour in de verhoudingen die hierboven vermeld. Meng door krachtig roeren met behulp van twee houten stokken voor minstens 5 min. Het mengsel moet een uniforme dichtheid donkerbruine kleur geworden. Plaats het bekerglas in de oven bij ~ 50 ° C voor een maximum van 10 min zo veel luchtbellen verwijderen als mogelijk. Opmerking: De hars begint te genezen als u buiten beschouwing het bekerglas in de oven langer dan 10 min. Decant de hars in kunststof potten of 5 mL spuiten laten, datum van hen en opslaan in de-20 ° C diepvries klaar voor gebruik.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Tabel van oplossingen.

Het protocol hier geschetste beschrijft de immunofluorescentie analyse, biocytin herstel en kwalitatief hoogwaardige reconstructies van hippocampal CA2 interneuronen na de intracellulaire elektrofysiologische opnames in vitro waardoor neuronale karakterisering en uiteindelijk prima neuronale anatomie worden bestudeerd.

Biocytin herstel en 3D-reconstructies van gevulde Hippocampal CA2 interneuronen

How cortical network activity processes information is of importance to a large number of basic and clinical scientific questions. The protocol described ...

Deze methode kan helpen bij het classificeren van neuronale subtypes en ons begrip van de functionele kaart van corticale circuits uit te breiden. Dit protocol is geoptimaliseerd om de ultrastructuur van de neuronen te behouden en een uitstekend herstel van zowel dendritische als axonale prieel arbors te verkrijgen, waardoor reconstructies van hoge kwaliteit mogelijk zijn. Breng aan het einde van een elektrofysiologische opname het segment met de opgenomen cel over naar een klein gerecht van ACSF.Rol tijdens het werken in een rookkap het plakje op een klein stukje filterpapier van fijne kwaliteit en plaats een ander stuk bevochtigd filterpapier op het plakje. Plaats het weefsel in een kleine plastic pot met 5 tot 10 milliliter fixatieve oplossing en op te slaan op vier graden Celsius 's nachts. Breng de volgende dag het weefsel uit de container met fixatieve oplossing over naar een container met twee milliliters fosfaatbuffer van 0,1 molaire fosfaat om te spoelen en snijd het overtollige weefsel weg met een scalpelblad.Verwijder overtollig weefsel door het plaatsen van de slice in een petrischaal, en snijd het overtollige weefsel met een scalpel mes. Breng het bijgesneden weefsel naar een schone petrischaal, zodat het plat ligt zonder plooien of plooien. Verwijder de overtollige buffer met behulp van een droge verfborstel.Bedek het weefsel met warme gelatineoplossing en plaats de petrischaal op een bevroren blok om de oplossing snel af te koelen. Verplaats vervolgens de schotel van het instellen van gelatine naar 4 graden Celsius gedurende 30 tot 60 minuten. In een rookkap, gebruik een scalpel mes uit te snijden een kleine, 1 X 1 centimeter blok met de gelatine ingebed weefsel.Til het blok op met een kleine spatel en breng voorzichtig over op een nieuwe fixatieve oplossing. Laat minstens 30 minuten op vier graden Celsius worden vast te stellen. Na deze tweede fixatie, was het gelatine blok in vijf milliliter PB drie keer.Na het wassen, droog het blok met behulp van een stuk papierweefsel. Gebruik dan een kleine hoeveelheid cyanoacrylaatlijm om het blok, gericht met het weefsel aan de bovenkant, op een vibratome truck met behulp van superlijm te plakken. Doorsnede het plakje op 50 micron dikte met behulp van een vibratome en plaats elke sectie zorgvuldig in een glazen flacon met 10 procent sacharose.Na het doorsneed, zorgvuldig pick-up een gedeelte van de flacon en plaats het plat in een petrischaal deksel. Gebruik vervolgens een vers scalpelblad om de gelatine te verwijderen uit de buurt van de sectie. Plaats de secties in een flacon met 2 milliliter verse 10 procent sacharose in PB, en roer gedurende 10 minuten om te beginnen met de cryoprotectie proces.Na cryoprotectie, plaats de secties plat op een kleine rechthoek van aluminiumfolie met behulp van een penseel. Verwijder overtollige vloeistof uit de secties en vouw de folie voorzichtig in een pakket. Houd de aluminiumfolie dicht bij het oppervlak van vloeibare stikstof zonder het oppervlak gedurende 30 seconden aan te raken.En laat de secties dan ongeveer 30 seconden volledig ontdooien. Herhaal de vriesvooi nog twee keer ontdooien. Verwijder alle secties van de folie met een penseel en plaats ze in een glazen flacon met twee milliliter PB af te wassen overtollige sacharose onder constante agitatie.Na immunostaining voor fluorescentie beeldvorming, plaats de dia in een glazen petrischaal met PBS, en verwijder voorzichtig de cover slip. Was vervolgens de secties van de glijbaan met behulp van zachte pulsen van PBS van een Pasteur pipet. Plaats de secties in een schone glazen flacon met PBS.Voer de Avidin HRP-reactie uit door de secties in het Avidin biotinecomplex of ABC eerst gedurende ten minste twee uur uit te broeden om het HRP-reactieproduct te versterken. Vervolgens was de secties met PBS 3 keer gedurende 10 minuten, en vervolgens met tris buffer twee keer gedurende 10 minuten. Na het verwijderen van de laatste tris buffer wasbeurt, voeg snel een druppel van acht procent nikkelchloride oplossing aan de diaminobenzidine oplossing of DAB-oplossing.Dan pipette de oplossing in en uit te mengen en snel een milliliter van deze oplossing toe te voegen over de secties. De secties in deze oplossing gedurende 15 minuten uitbroeden. Voeg vervolgens 10 microliter van 1 procent waterstofperoxide toe aan de DAB-oplossing.Laat de reactie te gaan in het donker onder constante agitatie voor ongeveer een tot twee minuten totdat de cellen zijn gelabeld. In een rookkap, plaats een kleine cirkel van filterpapier in een petrischaal en demp het met PB. Til de secties een voor een uit de glazen flacon met behulp van een penseel en zorgvuldig leg ze plat op het papier. Bedek de secties met een andere bevochtigde cirkel van filterpapier en verwijder overtollige buffer door voorzichtig weefselpapier aan de oppervlakte aan te raken.Breng acht of negen druppels van een procent osmium tetroxide in PB aan op het bovenste papier. Bedek de schotel en bewaar in de rookkap gedurende ten minste 30 minuten, maar niet meer dan 1 uur. Na het spoelen, monteren en dekt de secties, uitdrogen door middel van een reeks van 50 procent, 70 procent, 95 procent, en 100 procent alcohol oplossingen.Na de uitdroging stap, breng de secties naar een glazen flacon met 100 procent ethanol op een shaker voor ongeveer vijf minuten. Vervang de alcoholoplossing door propyleenoxide en was drie keer gedurende vijf minuten. Na de laatste wasbeurt, houd ongeveer twee milliliter propyleenoxide in de flacon en voeg hars op een 1:1 verhouding.Zorg ervoor dat de hars is opgelost en houd de secties onder constante agitatie gedurende 30 minuten. Na 30 minuten, gebruik een houten stok om elke sectie te plaatsen in een aluminium planchette met epoxy hars, en incubeer 's nachts. De volgende dag, plaats de planchette op een hete plaat voor ongeveer 10 minuten.Pak dan elke sectie met een houten stok en plaats op een schone glijbaan. Zodra alle secties op de dia zijn overgebracht, bekijkt u de dia onder een ontledenmicroscoop om de oriëntatie van de segmenten te controleren en een coverslip over de secties te plaatsen. Kuur 48 uur in de oven bij 56 graden Celsius.Gebruik een lage vergroting doelstelling om zich te concentreren op de home sectie met het cellichaam. Gebruik vervolgens een doelstelling van 100x, focus op het cellichaam en klik in het midden om het referentiepunt te markeren. Als u de soma in 3D wilt traceren met behulp van de doelstelling 100x, selecteert u de contour van het tracetabblad en selecteert u de contour van het cellichaam.Gebruik de joystick om de focus naar de bovenkant van het cellichaam te verplaatsen. Plaats de punten door te klikken rond de omtrek van het onderdeel dat momenteel in focus. Klik met de rechtermuisknop en selecteer de contour sluiten om deze eerste omtrek te voltooien.Herhaal dit proces op verschillende z-posities totdat de onderkant van het cellichaam is bereikt. Om de dendritische prieel te traceren, selecteert u dendriet of apicale dendriet, in het neuronmenu. Traceer eerst een kort initieel segment voor elk dendriet met behulp van het muisscrollwiel om de diameter van de cursor aan te passen aan de diameter van het dendriet.Traceer langs elke dendriet. Wanneer een knooppunt in de structuur is bereikt, klikt u met de rechtermuisknop en selecteert u bifurcating node of trifurcating node in het vervolgkeuzemenu. Als u overeenkomende punten wilt identificeren tussen de dendrieten in een sectie die overeenkomen met de voltooide sectie, klikt u op het tabblad Verplaatsen en selecteert u wedstrijdpunten.Selecteer het aantal punten dat moet worden geëerst en druk op OK. Klik op het einde van een voltooide vertakking en klik vervolgens op de vertakking. Herhaal dit voor elk matchpoint. Zodra alle dendrieten van elke sectie zijn getraceerd, traceer de axon met behulp van hetzelfde proces Hier is een reconstructie van een CA2 mand cel met beperkte dendritische en axon arbor met behulp van een tekenbuis.De dendrieten zijn in het zwart en de axon is in het rood. Dit is een voorbeeld afbeelding van de biocytine gevulde mand cel volgens de Avidin HRP protocol hier beschreven. Hier is een video getoond van een 3D neuronale reconstructie van de CA2 mandcel.Dendrites zijn in donkerroze en de axon is in het wit. Ten slotte toont deze afbeelding een dendrogram van de CA2-mandcel. Het zal tijd vergen om bekwaam te worden met dit protocol.Deze geoptimaliseerde aanpak kan echter beelden met hoge resolutie van complexe corticale en hippocampalstructuren in vitro genereren.

biocytin-recovery-3d-reconstructions-filled-hippocampal-ca2

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates the process of visualizing a biocytin-filled interneuron in a rat hippocampal section, highlighting its neurochemical identity through the use of specific antibodies and fluorescence microscopy.

Immunostaining of Interneurons in a Rat Hippocampal Section

This video demonstrates the procedure for staining fixed rat brain slices containing biocytin-filled interneurons. The protocol includes incubation with avidin-biotin complex (ABC), staining with HRP and chromogenic substrate, preserving structures with osmium tetroxide, and embedding the tissue in resin for imaging.

Labeling of Biocytin-Filled Interneurons in Rat Hippocampal Slices for Visualization

De structuur van neuronale netwerken begrijpen, functionele en morfologische karakterisering van individuele neuronen is een noodzaak. Hier tonen we juxtasomal biocytine etikettering, die elektrofysiologische opnames maakt in de extracellulaire configuratie, maar met behoud van de mogelijkheid om intracellulair het etiket van de neuron voor post hoc reconstructie van dendritische en axonale architectuur.

Juxtasomal biocytine Labeling om de structuur-functie relatie van de individuele corticale neuronen Studie

Corticale netwerken worden gecontroleerd door een kleine, maar gevarieerde set van remmende interneuronen. Functioneel onderzoek van interneuronen vereist daarom gerichte opname en strenge identificatie. Hier beschreven is een gecombineerde aanpak met whole-cell opnames van enkele of synaptically gekoppelde paren van neuronen met intracellulaire etikettering, post-hoc-morfologische en immunocytochemische analyse.

Whole-cell patch-clamp opnamen van Morphologically- en neurochemisch-geïdentificeerde hippocampus Interneurons

Cultures met lage dichtheid van primaire hippocampale neuronen vereisen meestal een glia-feederlaag om neurotrofe factoren te leveren en hun levensduur te ondersteunen. We beschrijven hier een vereenvoudigde methode om ultra-lage dichtheidsneuronen op glazen dekglasjes te kweken in de aanwezigheid van een neuronale feederlaag met hoge dichtheid, wat de onderzoek naar specifieke neuronaal-autonome mechanismen vergemakkelijkt.

Een vereenvoudigde methode voor de Ultra-Low Density, Long-Term Primaire hippocampus Neuron Cultuur

Dit protocol geeft een werkwijze voor de morfologische herstel van neuronen patched tijdens elektrofysiologische opnames via biocytine vullen en immunohistochemische latere nabewerking. We laten zien dat dikke-biocytine gevuld secties die werden gekleurd en afgedekt kunnen worden restained met een tweede primair antilichaam dagen of maanden later.

Immunokleuring van biocytine gevuld en Verwerkte secties voor Neurochemische Markers

Presenteren we een methode geheel-cel patch-clamp opnamen en twee-foton imaging om vast te leggen van Ca2 + transiënten in neuronale dendrites in acute hersenen segmenten combineren.

Twee-foton Calcium Imaging in neuronale Dendrites in hersenen plakjes

Hier presenteren we protocollen voor de bereiding van acute hersen schijfjes met de laterale geniculate Nucleus en het elektrofysiologisch onderzoek van retinogeniculate en corticogeniculate synapsen functie. Dit protocol biedt een efficiënte manier om te bestuderen van de synapsen met de hoge-release en lage-release kans in dezelfde acute hersenen segmenten.

Elektrofysiologische onderzoeken van Retinogeniculate en Corticogeniculate Synapse functie

We presenteren een protocol om acute plakjes te bereiden van de dorsaal-intermediaire hippocampus van muizen. We vergelijken dit transversale preparaat met coronale snijden in termen van kwaliteit van opnames en behoud van morfologische kenmerken van opgenomen neuronen.

Voorbereiding van acute plakjes van Dorsale Hippocampus voor hele celopname en neuronale reconstructie in de dentaat gyrus van volwassen muizen

Hier presenteren we een protocol dat virale transductie van discrete hersengebieden beschrijft met optogenetische constructies om synapsspecifieke elektrofysiologische karakterisering in acute hersenplakken van knaagdieren mogelijk te maken.

Ex Vivo | Optogenetische ondervraging van synaptische transmissie en plasticiteit op lange afstand van mediale prefrontale cortex naar laterale entorhinale cortex

Het combineren van virale vectortransductie en hersenzuivering met behulp van de CLARITY-methode maakt het mogelijk om tegelijkertijd een groot aantal neuronen en astrocyten te onderzoeken.

Onderzoek naar ruimtelijke interactie tussen astrocyten en neuronen in vrijgemaakte hersenen

Leer biocytin-herstel en 3D-reconstructie van hippocampale CA2-interneuronen na elektrofysiologische opnames. Deze methode optimaliseert ultrastructuurbehoud voor hoogwaardige morfologische analyses.

Biocytin herstel en 3D-reconstructies van gevulde Hippocampal CA2 interneuronen

Meer video's verkennen