Oplossing van de structuur van de Fluorescent Protein Cerulean met behulp van MeshAndCollect
19 maart 2019
Presenteren we het gebruik van het MeshAndCollect-protocol bij het verkrijgen van een gegevensset voltooid diffractie, voor gebruik in latere structuurbepaling, samengesteld uit gedeeltelijke diffractie datasets verzameld uit vele kleine kristallen van de fluorescente proteïne Cerulean.
Het geautomatiseerde MeshAndCollect-protocol is ontwikkeld om seriële kristallografie te combineren met standaard rotatiegegevensverzameling om kleine kristallen van puckmonsters te meten. De methode identificeert eerst de positie van kristallen die op dezelfde monsterhouder zijn gemonteerd om vervolgens de verzameling van gedeeltelijke gegevensverzameling te sturen die vervolgens zal worden samengevoegd en gebruikt voor de oplossing van de structuur. MeshAndCollect is overtuigend omdat het u in staat stelt om experimenten snel en met dezelfde setup, structuuroplossing, ligandscreening en dat alles met kleine kristallen te doen.
De methode is compatibel met de VMX van synchrotron beamline, ideaal uitgerust met hoge fotonflex, een kleine balkdiameter en een snelle herlaaddetector. Maak eerst verbinding met het uitgebreide informatiesysteem voor de database van de protein crystallography beamline en kies MX.Log in met het experimentnummer en het wachtwoord uit het A-formulier. Selecteer vervolgens Nieuwe verzending toevoegen en vul de gevraagde gegevens in.
Selecteer Gedeeltelijke toevoegen en vul de relevante gegevens in. Selecteer Container toevoegen, kies een SC3-puck en vul de vereiste informatie in, inclusief de posities van de monsterhouders in de puck. Laad in het experimentele hok de puck in de monsterwisselaar en let op zijn positie.
Log vervolgens in op het informatiesysteem voor de database van eiwitkristallografie beamline. Selecteer Experiment voorbereiden, zoek de verzending, selecteer Volgende en geef de bundellijn en puckpositie in de voorbeeldwisselaar aan. Log in op de beamline control software met het experimentele nummer en wachtwoord op het A-formulier.
Druk op Sync om de beamline besturingssoftware te synchroniseren met het informatiesysteem voor de database van eiwitkristallografie beamline. Gebruik de beamline control software om de monsterhouder op de goniometer te monteren. Klik vervolgens met de rechtermuisknop op een positie in het voorbeeldwisselaargebied en selecteer Voorbeeldmounten.
Selecteer de middelste knop en vervolgens drie klikken midden op het midden van de rand van de punt van de lus. Sla de gecentreerde positie op door Opslaan te selecteren. Voeg onder Geavanceerd de workflow Visual Reorientation toe aan de wachtrij voor het verzamelen van gegevens.
Start vervolgens de werkstroom door op Wachtrij verzamelen te klikken. Selecteer vervolgens een van de opgeslagen middelste posities door erop te klikken. Klik nogmaals op de middelste knop, dan is een drie-klik centrum op het midden van het begin van de stam van de lus.
Sla de tweede positie op door op Opslaan te klikken. En klik vervolgens op Doorgaan. Nadat de werkstroom het vlak van de monsterhouder heeft uitgelijnd met de rotatieas van de goniometer, centreert u de monsterhouder opnieuw ergens in het midden van het net.
Oriënteer de monsterhouder zodat het gezicht van het gaas loodrecht op de röntgenstraalrichting staat door de omega-as te draaien met behulp van de beamline-besturingssoftware. Klik in de beamline control software op het vervolgkeuzemenu Aperture en selecteer een waarde. Klik vervolgens op het pictogram van het netgereedschap om het venster met het netgereedschap weer te nemen.
Teken in de voorbeeldweergave van de beamline-besturingssoftware het net door links te klikken en de muis over het gebied te slepen dat kristallen op de monsterhouder bevat. Als u het net wilt opslaan, klikt u op de plusknop in het venster van het netgereedschap. Voer in het resolutieveld van de beamline-besturingssoftware de resolutie in waarbij diffractiebeelden moeten worden verzameld.
Als er geen voorafgaande informatie bekend is over de diffractiekwaliteit van de kristallen, wordt een waarde tussen twee en 2,5 aanbevolen. Selecteer MeshAndCollect op het tabblad Geavanceerde gegevensverzameling. Voeg het toe aan de wachtrij en klik op De wachtrij verzamelen.
Gebruik in het parametervenster de standaardparameters van de bundellijnafhankelijke. In het hier beschreven experiment zijn standaardparameters 0,037 seconde belichtingstijd per mesh-scanpunt, 100% transmissie en één graad oscillatie per mesh-scanlijn. Klik op Doorgaan.
De mesh-scan loopt en de diffractiebeelden die op elk rasterpunt worden verzameld, worden geanalyseerd en gerangschikt op basis van diffractiesterkte met de software Dozer. Na de Dozer-analyse wordt een warmtekaart gegenereerd en wordt de volgorde voor volgende deelgegevensverzamelingen automatisch toegewezen op basis van diffractiesterkte. Klik tot slot op Doorgaan om de gedeeltelijke gegevensverzamelingen te starten.
MeshAndCollect zoals geïmplementeerd in MXCuBE werd gebruikt voor het verzamelen van gedeeltelijke diffractie gegevenssets van kleine kristallen van Cerulean gelegen op dezelfde monsterhouder waarin visuele identificatie van kristallen moeilijk was. Om de monsterhouder te screenen, werd een raster over het midden van de mesh-lus getrokken en op basis van de Dozer-score heatmap werden automatisch 85 deeldiffractiegegevenssets verzameld. Deze werden individueel geïntegreerd en vervolgens samengevoegd tot een dataset met 99,8% volledigheid bij een resolutie van 1,7 angstroms.
Zoals verwacht kan de kristalstructuur van Cerulean worden opgelost door moleculaire vervanging met behulp van de gegenereerde gegevensset. Na verfijning werden een R-werk van 22,8% en een R vrij van 25,4% verkregen. Super positie van de eerder bepaalde structuur toont een globale RMSD op c-alpha posities van 0.1 angstroms.
Voor projecten waarbij de optimalisatie van de kristalgroeifase, MeshAndCollect biedt de mogelijkheid om een complete dataset te verkrijgen op basis van de combinatie van deze amorfe gedeeltelijke datasets verkregen uit kleinere kristallen. Deze techniek maakte de weg vrij voor structurele biologen om een structuur op te lossen uit onderdelen monster waar slechts een paar tienden van microkristallen niet kon worden geproduceerd.
Overzicht
Het MeshAndCollect-protocol maakt het mogelijk om complete diffractiegegevenssets te verzamelen van kleine kristallen, specifiek voor het fluorescerende eiwit Cerulean. Deze methode integreert seriekristallografie met standaard rotatiegegevensverzameling, waardoor snelle experimenten mogelijk worden.
Belangrijkste onderdeel van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Structuurbiologie
- Kristallografie
- Eiwitanalyse
Achtergrond
- MeshAndCollect combineert gegevens van meerdere kleine kristallen.
- Het is ontworpen voor gebruik met synchrotronstraallijnen.
- Het protocol verbetert de efficiëntie van structuurbepaling.
- Het lost uitdagingen op bij de visuele identificatie van kleine kristallen.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor het verkrijgen van complete diffractiegegevenssets.
- Om structuurbepaling van kleine kristallen mogelijk te maken.
- Om de snelheid en efficiëntie van experimenten te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Automatische verzameling van gedeeltelijke gegevenssets van kleine kristallen.
- Integratie van gegevens met behulp van de Dozer-software voor analyse.
- Gebruik van een mesh-tool om de monsterpositionering te optimaliseren.
- Toepassing van standaardparameters voor gegevensverzameling.
Belangrijkste resultaten
- 85 gedeeltelijke diffractiegegevenssets werden verzameld met 99,8% volledigheid.
- De bereikte resolutie was 1,7 angstroms.
- De kristalstructuur van Cerulean werd met succes opgelost.
- Verfijning leverde een R work van 22,8% en R free van 25,4% op.
Conclusies
- MeshAndCollect maakt effectieve gegevensverzameling van kleine kristallen mogelijk.
- Deze techniek ondersteunt structurele biologen bij het oplossen van complexe structuren.
- Het biedt een oplossing voor projecten met beperkte kristalgroei.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Structural determination of fluorescent proteins like Cerulean supports target validation and assay development in biopharma R&D by enabling mechanistic de-risking of protein function and interaction studies. The MeshAndCollect protocol addresses a key bottleneck in early discovery: obtaining high-quality structural data from poorly diffracting or micro-crystalline samples that hinder traditional X-ray crystallography workflows. This capability enhances predictive confidence in lead identification and supports portfolio triage by providing reliable structural insights for structure-based drug design.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through high-resolution structural data from weakly diffracting crystals.
- Operational Value: Supports biological de-risking by clarifying protein-ligand interactions and functional sites critical for target validation.
- Predictive Value: Improves confidence in structural models used for virtual screening and lead optimization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides validated structural templates for assay standardization and reproducibility in fluorescence-based screening platforms.
- Operational Value: Facilitates preparation of consistent biological systems for downstream compound evaluation and ligand screening campaigns.
- Scalability: Enables reuse of micro-crystal data collection workflows across multiple targets in structural genomics initiatives.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports alignment with disease-relevant systems by providing structural insights into fluorescent protein behavior in cellular environments.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in target mechanism by confirming structural integrity under experimental conditions.
- Preclinical Readiness: Enables risk-adjusted advancement decisions through reliable structural data for biomarker and probe development.
Pipeline & Workflow Integration
The MeshAndCollect protocol fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical support, particularly for projects challenged by difficult crystallization or limited sample availability.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by delivering high-resolution structural data from micro-crystals.
- Screening: Enhances assay readiness through standardized, reproducible structural inputs for ligand binding and conformational studies.
- Analytics: Generates quantitative diffraction data sets with high completeness (99.8%) and defined resolution (1.7 Å) for reliable comparative analysis.
- Translational Research: Connects structural findings to preclinical continuity by enabling biomarker alignment and probe development.
- Enterprise Reuse: Functions as a scalable, automated capability for structural data acquisition across multiple targets and campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target structure, reduction of mechanistic ambiguity, and improved model accuracy.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and rapid data collection from non-ideal crystals.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency in crystallography campaigns, and reduced biological risk in lead optimization.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on reliable structural data for advancement or termination decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein crystallography and synchrotron beamline operations.
- Dependent on access to VMX-equipped beamlines with high photon flux, small beam size, and fast detectors.
- Necessitates standardized sample preparation and puck-based loading protocols for consistent mesh-based positioning.
- Involves cross-team alignment between structural biology, assay development, and computational modeling groups.
- Limited by crystal quality and diffraction strength, though effective even with weakly diffracting micro-crystals.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:51
Offline Preparation of the Synchrotron Experiment
1:31
Loading of the Sample onto a Beamline
3:49
Prepare and Execute the MeshAndCollect Workflow
5:02
Results: Structure Determination of the Fluorescent Protein Cerulean using MeshAndCollect
6:10
Conclusion
