Oplossing van de structuur van de Fluorescent Protein Cerulean met behulp van MeshAndCollect

Het geautomatiseerde MeshAndCollect-protocol is ontwikkeld om seriële kristallografie te combineren met standaard rotatiegegevensverzameling om kleine kristallen van puckmonsters te meten. De methode identificeert eerst de positie van kristallen die op dezelfde monsterhouder zijn gemonteerd om vervolgens de verzameling van gedeeltelijke gegevensverzameling te sturen die vervolgens zal worden samengevoegd en gebruikt voor de oplossing van de structuur. MeshAndCollect is overtuigend omdat het u in staat stelt om experimenten snel en met dezelfde setup, structuuroplossing, ligandscreening en dat alles met kleine kristallen te doen.

De methode is compatibel met de VMX van synchrotron beamline, ideaal uitgerust met hoge fotonflex, een kleine balkdiameter en een snelle herlaaddetector. Maak eerst verbinding met het uitgebreide informatiesysteem voor de database van de protein crystallography beamline en kies MX.Log in met het experimentnummer en het wachtwoord uit het A-formulier. Selecteer vervolgens Nieuwe verzending toevoegen en vul de gevraagde gegevens in.

Selecteer Gedeeltelijke toevoegen en vul de relevante gegevens in. Selecteer Container toevoegen, kies een SC3-puck en vul de vereiste informatie in, inclusief de posities van de monsterhouders in de puck. Laad in het experimentele hok de puck in de monsterwisselaar en let op zijn positie.

Log vervolgens in op het informatiesysteem voor de database van eiwitkristallografie beamline. Selecteer Experiment voorbereiden, zoek de verzending, selecteer Volgende en geef de bundellijn en puckpositie in de voorbeeldwisselaar aan. Log in op de beamline control software met het experimentele nummer en wachtwoord op het A-formulier.

Druk op Sync om de beamline besturingssoftware te synchroniseren met het informatiesysteem voor de database van eiwitkristallografie beamline. Gebruik de beamline control software om de monsterhouder op de goniometer te monteren. Klik vervolgens met de rechtermuisknop op een positie in het voorbeeldwisselaargebied en selecteer Voorbeeldmounten.

Selecteer de middelste knop en vervolgens drie klikken midden op het midden van de rand van de punt van de lus. Sla de gecentreerde positie op door Opslaan te selecteren. Voeg onder Geavanceerd de workflow Visual Reorientation toe aan de wachtrij voor het verzamelen van gegevens.

Start vervolgens de werkstroom door op Wachtrij verzamelen te klikken. Selecteer vervolgens een van de opgeslagen middelste posities door erop te klikken. Klik nogmaals op de middelste knop, dan is een drie-klik centrum op het midden van het begin van de stam van de lus.

Sla de tweede positie op door op Opslaan te klikken. En klik vervolgens op Doorgaan. Nadat de werkstroom het vlak van de monsterhouder heeft uitgelijnd met de rotatieas van de goniometer, centreert u de monsterhouder opnieuw ergens in het midden van het net.

Oriënteer de monsterhouder zodat het gezicht van het gaas loodrecht op de röntgenstraalrichting staat door de omega-as te draaien met behulp van de beamline-besturingssoftware. Klik in de beamline control software op het vervolgkeuzemenu Aperture en selecteer een waarde. Klik vervolgens op het pictogram van het netgereedschap om het venster met het netgereedschap weer te nemen.

Teken in de voorbeeldweergave van de beamline-besturingssoftware het net door links te klikken en de muis over het gebied te slepen dat kristallen op de monsterhouder bevat. Als u het net wilt opslaan, klikt u op de plusknop in het venster van het netgereedschap. Voer in het resolutieveld van de beamline-besturingssoftware de resolutie in waarbij diffractiebeelden moeten worden verzameld.

Als er geen voorafgaande informatie bekend is over de diffractiekwaliteit van de kristallen, wordt een waarde tussen twee en 2,5 aanbevolen. Selecteer MeshAndCollect op het tabblad Geavanceerde gegevensverzameling. Voeg het toe aan de wachtrij en klik op De wachtrij verzamelen.

Gebruik in het parametervenster de standaardparameters van de bundellijnafhankelijke. In het hier beschreven experiment zijn standaardparameters 0,037 seconde belichtingstijd per mesh-scanpunt, 100% transmissie en één graad oscillatie per mesh-scanlijn. Klik op Doorgaan.

De mesh-scan loopt en de diffractiebeelden die op elk rasterpunt worden verzameld, worden geanalyseerd en gerangschikt op basis van diffractiesterkte met de software Dozer. Na de Dozer-analyse wordt een warmtekaart gegenereerd en wordt de volgorde voor volgende deelgegevensverzamelingen automatisch toegewezen op basis van diffractiesterkte. Klik tot slot op Doorgaan om de gedeeltelijke gegevensverzamelingen te starten.

MeshAndCollect zoals geïmplementeerd in MXCuBE werd gebruikt voor het verzamelen van gedeeltelijke diffractie gegevenssets van kleine kristallen van Cerulean gelegen op dezelfde monsterhouder waarin visuele identificatie van kristallen moeilijk was. Om de monsterhouder te screenen, werd een raster over het midden van de mesh-lus getrokken en op basis van de Dozer-score heatmap werden automatisch 85 deeldiffractiegegevenssets verzameld. Deze werden individueel geïntegreerd en vervolgens samengevoegd tot een dataset met 99,8% volledigheid bij een resolutie van 1,7 angstroms.

Zoals verwacht kan de kristalstructuur van Cerulean worden opgelost door moleculaire vervanging met behulp van de gegenereerde gegevensset. Na verfijning werden een R-werk van 22,8% en een R vrij van 25,4% verkregen. Super positie van de eerder bepaalde structuur toont een globale RMSD op c-alpha posities van 0.1 angstroms.

Voor projecten waarbij de optimalisatie van de kristalgroeifase, MeshAndCollect biedt de mogelijkheid om een complete dataset te verkrijgen op basis van de combinatie van deze amorfe gedeeltelijke datasets verkregen uit kleinere kristallen. Deze techniek maakte de weg vrij voor structurele biologen om een structuur op te lossen uit onderdelen monster waar slechts een paar tienden van microkristallen niet kon worden geproduceerd.