Geoptimaliseerde Interferon-gamma ELISpot Assay maatregel T cel antwoorden in het Model van de cavia na vaccinatie

In het verleden was de karakterisering van immunotherapeutica in het caviamodel beperkt tot het meten van humorale immuniteit. De ELISpot-test overwint die beperking en het zal onderzoekers helpen om zinvollere gegevens in dat diermodel te genereren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de cellen worden verkregen uit perifeer bloed.

Er is geen obductie vereist. Dit maakt het mogelijk om niet alleen de omvang te meten, maar ook kinetiek van T-celreacties bij individuele cavia's tijdens een natuurlijke infectie of in een vaccinregime. Het demonstreren van de procedure zal Holly Pugh zijn.

Ze is een onderzoeksmedewerker van Inovio's Preclinical R en D Afdeling. Om te beginnen voeg 15 microliters van 35% ethanol aan elke put van een ELISpot testplaat. Na 60 seconden voeg 150 microliter PBS aan elke put.

En de plaat omkeren om ethanol voorbehandeling te stoppen. Bij het hanteren van de ELISpot-testplaten moet ook grote zorg worden uitgeoefend om besmetting te voorkomen of het membraan te beschadigen. Om de plaat te wassen voeg 250 microliter PBS aan elke put.

Na het herhalen van de was nog twee keer, voeg 100 microliter van de vangst anti-cavia interferon gamma antilichaam VE4 aan elke put. Dan incubeer de plaat voor ten minste 12 uur op 4 graden Celsius. Na de incubatietijd was je de platen drie keer.

Voeg 200 microliter van het blokkeren buffer aan elke put. Broed de plaat twee uur lang op kamertemperatuur. Was de borden dan nog drie keer.

Bereid conische buizen met 4,5 ml ruimtetemperatuur dichtheidsgradiënt medium. Meng vervolgens een gelijk volume van Hanks'Balanced Salt Solution met het bloed. Laag het verdunde bloed geleidelijk over het dichtheidsgradiëntmedium, waarbij u ervoor zorgt dat het de interface niet verstoort.

Daarna u de buizen gedurende 30 minuten op 800 x g centrifugeren zonder remmen bij kamertemperatuur. Haal de buis uit de centrifuge en zorg ervoor dat de lagen niet worden verstoord. Na het correct identificeren van de lagen de complete buffy laag aanzuigen om de PBMCs te oogsten.

Langzaam laag de HBSS verdund bloed op de dichtheid gradiënt medium. Voorkom verstoring van de buis en zet de centrifugeremmen uit. Breng de cellen over op een nieuwe buis van 15 ml.

Verdun vervolgens de cellen in R10 medium tot een totaal volume van 15 ml. Na het pelleteren van de cellen, gooi de supernatant en resuspend de cellen in 15 ml R10 medium. Geef de celopening door een 70 micrometer celzeef in een nieuwe buis.

Tel de cellen en bepaal het aantal levende cellen met de Trypan blauwe uitsluitingstest. Verdun vervolgens de cellen met R10 medium. Verwijder eerst de blokkeerbuffer en was de platen.

Voor elk PBMC-monster geven verdrievoudigingen van de positieve controle, negatieve controle, en elk experiment-specifieke stimulerende middelen. Verdun het eiwitpeptidepool in R10 medium tot drie keer de gewenste uiteindelijke concentratie. Voeg hierna 50 microliters van het peptide R10 medium mengsel toe aan de stimulerende testputten van de plaat.

Voeg vervolgens 50 microliters MT peptide formulering in R10 medium aan de negatieve controle putten van de plaat. Voeg ConA in R10 medium toe aan de positieve controleputten van de plaat en voeg vervolgens 100 microliter van de PBMC-ophanging toe aan alle putten. Plaats de ELISpot plaat op een gelijkmatig oppervlak in de couveuse en vermijd verstoring van de plaat tijdens de incubatietijd.

Na het voorzichtig verwijderen van de plaat uit de couveuse, omkeren van de plaat om de supernatant te verwijderen. Was vervolgens de plaat drie keer. Voeg 100 microliters van verdunde biotinylated detectie vangen anti-cavia interferon gamma antilichaam N-G3 aan elke put.

Vervolgens de plaat twee uur lang op kamertemperatuur uitbroeden. Keer de plaat om om de antilichaamoplossing te verwijderen en herhaal de was drie keer. Na het verwijderen van de PBS van de plaat, voeg 100 microliters van ALP geconjugeerde streptavidin verdund in het blokkeren van buffer aan elke put.

Vervolgens de plaat een uur lang op kamertemperatuur uitbroeden. Keer de plaat om om de ALP streptavidin-oplossing weg te gooien en was de plaat twee keer. Keer de plaat om en dep het tegen een schone papieren handdoek om overtollige PBS te verwijderen.

Na deze wasbeurt de plaat met 250 microliters ultrapure DI water per put. Keer de plaat om en verwijder het overtollige water met een schone papieren handdoek. Voeg vervolgens 100 microliters van BCIP/NBT substraatoplossing toe aan elke put.

Broed de plaat 20 minuten lang op kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Spoel de plaat vier keer af met DI water. Vervolgens omkeren en tik op de plaat om overtollig water te verwijderen.

Verwijder ten slotte de kunststof drainage van de bodem van de plaat en laat het membraan volledig drogen. Na succesvolle dichtheidgradiëntcentrifugatie zoals eerder aangetoond, moet de rode viskeuze vloeistof aan de onderkant van de buis de meeste rode bloedcellen bevatten. De buffy laag bevindt zich tussen de laag plasma en het dichtheidsgradiëntmedium.

Pretreating de putten voorafgaand aan het toevoegen van de vangst antilichaam, de test weergegeven verbeterde definitie samen met een vermindering van het aantal niet-specifieke plekken in de negatieve controle putten. Vlekken zijn indicatief voor interferon gamma producerende T-cellen binnen de PBMC-populatie. Bij het proberen van deze techniek, is het belangrijk om te onthouden om zorgvuldig, maar snel verwerken van het bloed.

Dit zal de levensvatbaarheid van de cel verbeteren, de positievorming verbeteren en de vorming van niet-specifieke vlekken verminderen. Vergeet niet dat het werken met bloed en BCIP / NBT substraat kan gevaarlijk zijn en voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van passende PPE moet altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure. Ik denk dat dit protocol onderzoekers in staat stelt om ziekten te bestuderen met een belangrijke T-celcomponent zoals tbc, ebola en HSV.

Belangrijk is dat het de ontwikkeling van vaccinprotocollen in het proefkonijnmodel zal verfijnen en het gebruik van minder relevante diermodellen zal verminderen.