Detectie van Tilapia Lake Virus met behulp van conventionele rechts-PCR en SYBR groene RT-qPCR
10 november 2018
Dit protocol diagnose Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia weefsels met behulp van de RT-PCR methodes. De hele methode is beschreven van weefsel dissectie totaal RNA extractie, gevolgd door de cDNA synthese en opsporing van TiLV door conventionele PCR of kwantitatieve PCR dsDNA bindend een bindende fluorescerende kleurstof gebruiken.
Welkom iedereen. Mijn naam is Win Surachetpong. Ik ben universitair docent diergeneeskunde en immunologie faculteit diergeneeskunde aan de Kasetstart Universiteit, Thailand.
Ik en mijn team zijn gespecialiseerd in opkomende virale ziekte in tilapia. We werken nu aan het tilapiameervirus dat een hoge sterfte in tilapia veroorzaakt. Aangezien tilapia de tweede belangrijkste vissoort is die wereldwijd cultuur is, biedt het eiwitbron voor een miljoen mensen en speelt het een belangrijke rol voor de voedselzekerheid.
Dus de recente uitbraak van tilapia lake virus veroorzaken sociaal-economische impact die veel wetenschappers ertoe bracht om te proberen een oplossing te vinden voor dit probleem. Tot nu toe hebben we een zeer gevoelige, snelle en nauwkeurige methode nodig om het virus op te sporen. In deze video laten we u stap voor stap zien om het tilapiameervirus te detecteren in visweefsel vanaf monsterverzameling, monsterpopulatie en realtime PCR-analyse.
Ten eerste, oplos de overdosis van doek olie in water om de vis te euthanaseren. Leg de dode vissen op een dienblad, steriliseer de apparatuur met behulp van 95%ethanol, dan verbrand met een alcoholbrander. Snijd de vis langzaam open uit de onderbuik naar boven, om de lever te verzamelen.
Verzamel een deel van de lever in een 1,5 milliliter centrifuge buis. Het eerste deel van de RNA-extractie moet worden uitgevoerd in een Laminar Flow Hood en beschermende apparatuur dragen. Voeg een milliliter RNA extractie reagens in de buis.
Verpulver de lever met behulp van een weefsel stamper in homogeen. Voeg 200 microliter chloroform in de buis. Meng vervolgens voorzichtig door de buis meerdere keren om te keren.
Zet apart voor drie minuten op kamertemperatuur. Centrifuge op vier graden Celsius op 12.000 RCF gedurende 15 minuten. Verzamel de buizen voorzichtig uit de centrifuge.
Breng voorzichtig 500 microliter van de kleurloze bovenste waterige fase over in een nieuwe buis. Voeg een volume isopropanol in de buis. Verwarm bij min 20 graden celsius gedurende twee uur of tot 's nachts om het RNA neer te zetten.
Na de incubatie, centrifugeren de oplossing op dezelfde centrifuge voorwaarde. Verzamel de buizen van de centrifuge en gooi de supernatant weg. De RNA pellet kan worden gezien als puntig door de pijl.
Voeg een milliliter van 75% ethanol in de buis om de RNA pellet te wassen, en omkeren meerdere malen. Centrifuge op vier graden Celsius, op 10.000 RCF gedurende 15 minuten. Verzamel de buizen van de centrifuge en gooi de supernatant weg.
Trek de overgebleven ethanol met behulp van de automatische pipet, en de lucht droog op kamertemperatuur gedurende vijf tot 10 minuten. Voeg 30 tot 60 microliters RNase vrij water, voor opgewarmd tot 55 tot 60 graden Celsius om de RNA pellet op te nemen. Gebruik een tot twee microliters RNA-oplossing om de concentratie te meten met behulp van een micro volume spectrofotometer.
De resultaten worden weergegeven op het scherm. Verdun de concentratie tot 200 nanogram per microliter met RNase vrij water. Voer cDNA synthese uit met behulp van de chemische stoffen en voorwaarden die als volgt worden vermeld.
Gebruik een thermocycler om RNA om te zetten in cDNA met voorgestelde voorwaarden. De volgende zijn de chemische stoffen en voorwaarden die worden gebruikt voor het bepalen van de TiLV belasting met behulp van real-time PCR. Doe zes milliliter van de qPCR master mix in elke flacon van witte qPCR strip buis.
Vervolgens wordt vier milliliter cDNA-monster in de put geladen. In dit stadium moet in elke put een nieuwe pijppunt worden vervangen om besmetting van monster tot monster te voorkomen. Sluit de qPCR-strip goed af met een transparante qPCR-stripdop.
Meng de oplossing voorzichtig door op een puntje van de strip te vegen. Draai dan naar beneden met behulp van microcentrifuge om alle vloeistof te verzamelen op de bodem van de vaten. Gebruik de twee stappen voorwaarde zoals weergegeven in de video, selecteer de put in 96 goed plaat die je gaat gebruiken.
Selecteer cybergroen als de flora voor kleurstof. Selecteer onbekend als voorbeeldtype en voeg een naam in een voorbeeldnaamvak. Open het deksel van een real-time PCR-machine en plaats de qPCR-strip in de toegewezen put.
Sluit dan het deksel. Voer de machine uit met de geselecteerde voorwaarde. De machine start en loopt nadat het deksel de gewenste temperatuur heeft bereikt.
Na het einde van qPCR-omstandigheden wordt de versterkingscurve weergegeven. Hier wijst de koerspijl aan waar het drempelniveau wordt afsnijdt tussen de exponentiële fase en de lineaire fase, wat resulteert in ct-waarde. De CT-waarde wordt vervolgens geëxtrapoleerd in virus log kopie nummer om een aantal virus blijft met behulp van de standaard curve te berekenen.
De smeltpiek wordt ook weergegeven om te bepalen of het virus gedetecteerd door qPCR is, inderdaad, TiLV waarin de smeltpieken over het algemeen variëren tussen 79,5 en 80,5 graden Celsius. Dus we hopen dat deze methode zal belangrijke instrumenten voor boeren en organisaties over de hele wereld, die kunnen vereisen implementeren van een controle en de verspreiding van TiLV-infectie te beperken.
Overzicht
Dit protocol beschrijft in detail de diagnose van het Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia-weefsels met behulp van RT-PCR-methodologieën. Het omvat het gehele proces van weefseldissectie tot RNA-extractie, cDNA-synthese en TiLV-detectie via conventionele of kwantitatieve PCR.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Veterinaire microbiologie
- Virologie
- Gezondheidsmanagement van vissen
Achtergrond
- Het Tilapia Lake Virus veroorzaakt aanzienlijke sterfte bij tilapia, wat gevolgen heeft voor de voedselzekerheid.
- Tilapia is wereldwijd de op één na belangrijkste vissoort.
- Snelle en nauwkeurige detectiemethoden zijn essentieel voor het beheersen van uitbraken.
- Dit protocol heeft tot doel een betrouwbare methode te bieden voor de detectie van TiLV.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een zeer gevoelige methode voor het detecteren van TiLV in visweefsels.
- Het ondersteunen van kwekers en organisaties bij het beheersen van de verspreiding van TiLV.
- Het bieden van een stapsgewijze handleiding voor onderzoekers en praktijkmensen.
Gebruikte methoden
- Monstername en euthanasie van vissen met behulp van kruidnagelolie.
- RNA-extractie uit leverweefsel onder een laminaire flowkast.
- cDNA-synthese gevolgd door real-time PCR voor de detectie van TiLV.
- Analyse van amplificatiecurves en CT-waarden om de TiLV-last te kwantificeren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle extractie en kwantificering van RNA uit tilapia-weefsels.
- Detectie van TiLV met behulp van real-time PCR onder specifieke condities.
- Opstelling van een standaardcurve voor viruskwantificering.
- Identificatie van TiLV via smeltpuntanalyse.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor de detectie van TiLV.
- Het kan helpen bij het beheersen van uitbraken en het waarborgen van de voedselzekerheid.
- Toekomstige toepassingen kunnen de beheersing van virale ziekten in de aquacultuur verbeteren.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Snelle en gevoelige detectie van het Tilapia Lake Virus (TiLV) is van cruciaal belang voor de biosecurity en ziektebeheersing in de aquacultuur, wat een directe impact heeft op de voedselzekerheid en mondiale eiwitvoorzieningsketens. De integratie van conventionele RT-PCR en SYBR Green RT-qPCR maakt zowel kwalitatieve als kwantitatieve virale detectie mogelijk, wat vroege interventie en surveillanceprogramma's ondersteunt. Deze moleculaire diagnostiek leveren bruikbare gegevens op voor risicobeperking en resource-allocatie binnen zowel onderzoeks- als operationele omgevingen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt nauwkeurige detectie van TiLV RNA mogelijk, wat hypothese-gestuurde surveillance van pathogenen ondersteunt.
- Faciliteert biologische risicoreductie door geïnfecteerde weefselmonsters te onderscheiden van niet-geïnfecteerde monsters.
- Ondersteunt voorspellende betrouwbaarheid bij ziektemonitoring en strategieën voor de respons op uitbraken.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Biedt gevalideerde protocollen voor RNA-extractie en de opzet van qPCR-assays, wat de reproduceerbaarheid waarborgt.
- Levert kwantitatieve resultaten (CT-waarden, viraal kopiegetal) voor een robuuste standaardisatie van de assay.
- Maakt schaalbare screening van grote steekproefcohorten mogelijk voor surveillances en onderzoeksstudies.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij de ontwikkeling van translationele biomarkers door de virale load in subklinische gevallen te kwantificeren.
- Ondersteunt de continuïteit van laboratoriumdetectie naar veldsurveillance en interventieplanning.
- Vermindert het biologische risico bij de validatie van preklinische modellen voor onderzoek naar aquatische ziekten.
Integratie van Pijplijn & Workflow
Deze dubbele PCR-workflow slaat een brug tussen vroege ontdekking, assay-ontwikkeling en translationeel onderzoek naar aquatische virale pathogenen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en mechanistische verduidelijking van de infectiedynamiek van TiLV.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor high-throughput monsteranalyse.
- Analytiek: Biedt CT-waarden en kwantificering op basis van standaardcurven voor vergelijkende studies.
- Translationeel onderzoek: Maakt detectie van laaggradige infecties mogelijk, wat bijdraagt aan surveillance- en interventiestrategieën.
- Bedrijfsmatig hergebruik: Biedt een gestandaardiseerd, aanpasbaar protocol voor doorlopende surveillan- en onderzoeksprogramma's.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert ambiguïteit bij de detectie van pathogenen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van diagnostische workflows.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go-beslissingen voor de respons op uitbraken en de inzet van middelen.
- Impact op de portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van surveillance- en interventie-inspanningen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in moleculaire biologie en het opzetten van qPCR-assays.
- Toegang tot RNA-extractiereagentia, thermocyclers en real-time PCR-instrumentatie is noodzakelijk.
- Strikte standaardisatie tussen teams is vereist om de vergelijkbaarheid van gegevens te waarborgen.
- Aanpasbaar aan verschillende weefseltypen en monstermatrices door middel van protocoloptimalisatie.
- Afhankelijk van monsterkwaliteit en RNA-integriteit voor betrouwbare resultaten.
