Schatting van het Nephron aantal in hele nieren met behulp van de zure methode
22 mei 2019
Schattingen van de hele nier nephron nummer zijn belangrijk klinisch en experimenteel, want er is een omgekeerde associatie tussen nephron aantal en een verhoogd risico op nier-en hart-en vaatziekten. Hierin, wordt het gebruik van de zure methode van de vergisting, die snelle en betrouwbare ramingen van het gehele nephron aantal van de nier verstrekt, aangetoond.
De zure maceratiemethode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de nier en hoe specifieke genen bijdragen aan of de ontwikkeling van nefrijnen beïnvloeden en hoe specifieke aandoeningen, zoals diabetes of hypertensie, het nefrronnummer beïnvloeden. Dit is belangrijk omdat een totaal aantal nefrons waarmee een persoon geboren is, wordt bepaald tijdens de foetale ontwikkeling en het verlies van nefrons is geassocieerd met nierpathologie. De belangrijkste voordelen van de zure maceratie methode zijn dat het sneller, meer reproduceerbaar, goedkoop, en minder tijdrovend dan andere nephron tellen methoden, zoals magnetische resonantie beeldvorming.
Deze techniek vergemakkelijkt de correlatie van de impact in nefrofreetal op de nierfunctie, wat belangrijk is om ons begrip van hoe specifieke genen de functie en ontwikkeling van Nephron beïnvloeden verder te bevorderen. De studie van genen of factoren die het totale aantal nefroden beïnvloeden, zal een belangrijke rol spelen bij de ontwikkeling van farmacologische of genetische benaderingen die zijn ontworpen om het geassocieerde nefroleverlies van ziekten te beperken. Met een goede experimentele techniek en praktijk, individuen nieuw op deze methode moet gemakkelijk krijgen beheersing van de zure maceratie methode waardoor betrouwbare en reproduceerbare schattingen van de hele nier nefrofische nummers.
Begin met het gebruik van fijne chirurgische schaar om de muis buikholte te openen langs de middellijn. Verplaats de darmen en het voortplantingsvet voorzichtig naar de rechterkant van het dier. Met behulp van grove dissectie, isoleren van de linker nier en snijd de linker nierslagader en ader om zorgvuldig te verwijderen van de nier het plaatsen van het orgaan in een passend gelabeld woog boot van PBS.
Verzamel de juiste nier op dezelfde manier en plaats beide nieren op een chirurgisch gaas voorbevocht met PBS. Verwijder snel elk aanhangend niet-nierweefsel en de niercapsules. Dan gewicht elke nier individueel het opnemen van het gewicht van de linker en rechter orgaan afzonderlijk.
Na het wegen, plaats elke nier terug in een passend gelabelde weegboot zonder PBS en gebruik een schoon scheermesje om elk orgaan in de lengte doormidden te snijden. Plaats elke nier half gesneden kant naar beneden en snijd elk half in twee millimeter of kleinere stukken. Breng met hetzelfde scheermesje de gehakte nierstukken voorzichtig over in een op de juiste manier gelabelde conische buis van 15 milliliter.
Voeg in een goed geventileerde rookkap vijf milliliter van zes molair zoutzuur toe aan elke buis. Vervolgens, zachtjes roeren de nierzuur mengsels voor het plaatsen van de buizen in een 37 graden Celsius waterbad gedurende 90 minuten. Bevestig aan het einde van de zure maceratie een 18-meterige naald aan één vijf milliliter spuit per nier en verwijder voorzichtig de spuit plungers.
Plaats de spuiten in individuele 50 milliliter conische buizen in de rookkap en giet de nieroplossingen in het open uiteinde van elke spuit en zet de lege buizen opzij in een reageerbuisrek. Vervang vervolgens voorzichtig de zuigers voor de langzame extrusie van elke oplossing door de naalden in de 50 milliliter buizen. Was de 15 milliliter conische buizen met vijf milliliter PBS-oplossing per buis die de PBS wervelt om het resterende nierweefsel op te stropen.
Extrudeer de wasinhoud in de juiste 50 milliliter buis zoals net aangetoond. Na het extruderen van de derde was, rust elke spuit uit met een 21-meter naald. Extrudeer de inhoud van de 50 milliliter buizen in een tweede set van 50 milliliter buizen door de kleinere boring naald wassen en extruderen van de eerste 50 milliliter buis inhoud drie keer met verse PBS zoals aangetoond.
Na de derde was- en extrusie, breng het totale volume in elke buis tot 50 milliliter met extra PBS en plaats de buizen in een rek op een tuimelplaat op vier graden Celsius 's nachts. Binnen vijf dagen na verwerking plaatst u een raster met 16 afzonderlijke secties op de bodem van zes putten van een 12 putplaat. Draai de buisjes van de nieroplossing meerdere malen voorzichtig om om de pelleted weefsels opnieuw op te geven.
Voeg voorzichtig drie 500 microliter aliquots van elke gehomogeniseerde oplossing per nier toe aan elk van de drie putten van de 12 putplaat. Verdun de inhoud van elke put met een gelijk volume PBS. Plaats de plaat op het podium van een omgekeerde microscoop.
Identificeer de glomeruli aan de sferische structuur, roodachtige tint en de voor- of naslagaders die aan de lichamen van individuele glomeruli zijn bevestigd. Tel het aantal glomeruli per elke roostersectie om de telling per raster op te tellen voor de berekening van het totale aantal glomeruli per put. Vermenigvuldig vervolgens het aantal glomeruli per goed maal 100 om het gemiddelde aantal glomeruli per nier te verkrijgen.
In dit representatieve experiment, het totale nefrennummer in muizen doordrenkt met voertuig voor 14 dagen was ongeveer 12, 500 nefrons per nier. Angiotensin twee infusie echter, verhoogde de atriumdruk met ongeveer 40 millimeter kwik en werd geassocieerd met een aanzienlijke bijna 26%-vermindering van het totale aantal nephrons. In dit genetische model van ratten niergeneese, dieren geboren met twee nieren werden berekend op ongeveer 27,00 nefrons per nier bevatten na zure maceratie zoals aangetoond, terwijl ratten geboren met een eenzame nier bleken te hebben aanzienlijk lagere totale nefren aantallen.
Schattingen van beide experimenten kwamen overeen met de eerder gemelde bereiken bij ratten. De zure maceratiemethode is ideaal voor het schatten van nefronsnummers in hele nieren, vooral in laboratoria die niet zijn uitgerust met meer arbeidsintensieve en kostenondre technieken voor het tellen van nefrons, zoals de disectorse fractionatormethode of magnetische resonantiebeeldvorming. Deze methode maakt een hoge doorvoer, efficiënte en reproduceerbare schatting van de hele nier nefron nummer dat binnen 5% van de nummers bepaald door magnetische resonantie beeldvorming.
De beoordeling van het aantal nefroens is van klinisch belang omdat verminderde nefroennummers gepaard zijn gegaan met een verhoogd risico op hart- en vaatziekten, zoals chronische nierziekten. Vergeet niet dat het werken met zoutzuur zeer gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van handschoenen, beschermende brillen en een laboratoriumjas.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
De methode van zure maceratie biedt een snelle en betrouwbare manier om het aantal nefronen in de gehele nier te schatten, wat cruciaal is voor het begrijpen van de renale en cardiovasculaire gezondheid. Deze techniek is bijzonder relevant voor het bestuderen van hoe genetische en omgevingsfactoren de ontwikkeling en het verlies van nefronen beïnvloeden.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Nefrologie
- Genetica
- Nierpathologie
Achtergrond
- Het aantal nefronen is gekoppeld aan het risico op renale en cardiovasculaire ziekten.
- Het totale aantal nefronen wordt vastgesteld tijdens de foetale ontwikkeling.
- Verlies van nefronen is geassocieerd met diverse renale pathologieën.
- Inzicht in de ontwikkeling van nefronen kan therapeutische strategieën informeren.
Doel van de studie
- Om de effectiviteit van de zuurmaceratiemethode voor het tellen van nephronen aan te tonen.
- Om de impact van genen en aandoeningen zoals diabetes op het aantal nephronen te onderzoeken.
- Om onderzoek naar de functie en ontwikkeling van nephronen te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Zuurmaceratietechniek voor het schatten van het aantal nefronen.
- Vergelijking met traditionele methoden voor het tellen van nefronen.
- Beoordeling van de reproduceerbaarheid en efficiëntie van de methode.
- Toepassing in diverse experimentele contexten.
Belangrijkste resultaten
- De methode van zure maceratie is sneller en reproducebaarder dan andere technieken.
- Het biedt betrouwbare schattingen van het aantal nefronen.
- Het vergemakkelijkt de studie naar genetische invloeden op de nefronontwikkeling.
- Het vergroot het begrip van nefronverlies in relatie tot ziekten.
Conclusies
- De methode van zure maceratie is een waardevol instrument voor onderzoek naar nefronen.
- Het kan helpen bij het identificeren van factoren die het aantal en de functie van nefronen beïnvloeden.
- Beheersing van deze techniek kan leiden tot aanzienlijke vorderingen in het onderzoek naar de gezondheid van de nieren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Een nauwkeurige schatting van het aantal nefronen in de gehele nier is essentieel voor het begrijpen van de renale pathofysiologie en het cardiovasculaire risico, in het bijzonder bij de validatie van targets voor nefroprotectieve therapieën. De methode van zure maceratie biedt een snelle, reproduceerbare en kosteneffectieve benadering om de nefronvoorraad en het verlies ervan te kwantificeren, wat bijdraagt aan mechanistische risicoreductie in preklinische modellen. Hierdoor kunnen biopharma R&D-teams genetische of omgevingsfactoren correleren met functionele renale uitkomsten, wat het voorspellende vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase verhoogt.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door gen- of factormodulatie te koppelen aan meetbare veranderingen in het aantal nefronen.
- Operationele waarde: Maakt biologische risicoreductie mogelijk door kwantitatieve beoordeling van de nefronontwikkeling en het verlies daarvan in genetische en ziektemodellen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de triage van portfolio's door een betrouwbare biomarker van de renale structurele integriteit te bieden die is gekoppeld aan functionele langetermijnresultaten.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerd nierweefsel voor op high-throughput screening van verbindingen of genetische modifiers die het aantal nefronen beïnvloeden.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve glomerulaire tellingen met <5% variantie ten opzichte van MRI, wat de reproduceerbaarheid van de assay over verschillende experimentele condities waarborgt.
- Schaalbaarheid: Faciliteert de verwerking van grote steekproefsets, waardoor dosis-respons- en tijdverloopstudies in discovery-workflows mogelijk worden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Handhaaft translationele continuïteit door metingen van het aantal nefronen af te stemmen op klinische risicomerkers voor chronische nier- en hart-vaatziekten.
- Operationele waarde: Verbindt targetmodulatie in de ontdekkingsfase met preklinische validatie via consistente fenotypering die is afgestemd op het eindpunt.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Informeert go/no-go-criteria door het behoud of verlies van nefronen te kwantificeren als een mechanistische readout van de effectiviteit of toxiciteit van een verbinding.
Integratie van pipeline en workflow
De methode van zuurmaceratie past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische werkzaamheidstests, waarbij een kwantitatief structureel fenotype wordt verschaft dat ten grondslag ligt aan daaropvolgende functionele en veiligheidsbeoordelingen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten door directe meting van het aantal nefronen mogelijk te maken als uitkomstmaat voor nefrogenese of nefronverlies in reactie op genetische of farmacologische interventies.
- Screening: Levert assay-klare weefselsuspensies met reproduceerbare glomerulaire isolatie, wat screening van verbindingenbibliotheken op nefronbeschermende activiteit faciliteert.
- Analytiek: Genereert kwantitatieve glomerulaire tellingen per well, schaalbaar naar statistische analyse voor het vergelijken van experimentele groepen en het identificeren van significante effecten.
- Translationeel onderzoek: Koppelt het aantal nefronen aan ziekterelevantie, wat de afstemming van biomarkers met klinische eindpunten in renale en cardiovasculaire pathologie ondersteunt.
- Enterprise-hergebruik: Vestigt een gestandaardiseerd, kostenefficiënt platform voor nefronkwantificatie dat toepasbaar is over meerdere projecten, modellen en therapeutische gebieden.
Operationele & Enterprise Impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door ambiguïteit in structurele renale fenotypes te verminderen.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid en standaardisatie tussen laboratoria en experimentele batches via een goed gedefinieerd, toegankelijk protocol.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door high-throughput nefron-telling mogelijk te maken zonder afhankelijkheid van dure beeldvormingsinfrastructuur.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door een vertaalbare maatstaf te bieden voor de structurele renale gezondheid in verband met het risico op ziekten op lange termijn.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in de histologische identificatie van glomeruli op basis van morfologie en kleuringskenmerken.
- Afhankelijk van toegang tot zuigkasten, centrifuges, microscopen met rasterretikels en standaard histologie-verbruiksartikelen.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor weefselpreparatie, de timing van zuurexpositie en telprotocollen om variabiliteit tussen operators te minimaliseren.
- Overwegingen voor adaptatie omvatten soortspecifieke niergrootte en glomerulaire dichtheid, wat optimalisatie via een pilotstudie vereist voor niet-muismodellen.
- Praktische beperkingen omvatten de doorvoer van handmatig tellen en de afhankelijkheid van training van de operator voor een nauwkeurige identificatie van glomeruli, zoals vermeld in het protocol.
