Meten en interpreteren van zuurstof verbruik geheel vliegen hoofd segmenten

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van metabolisme, zoals, hoe metabole activiteit wordt veranderd tijdens het proces van veroudering. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het gebruik van een intact lichaamssegment dat gegevens heeft die sterk lijken op de natuurlijke en fysiologische toestand in vergelijking met de klassieke mitochondriale isolatie. Het aantonen van de procedure zal Anuroop en Annika, een grad student in mijn laboratorium.

Om het protocol te beginnen, schakelt u de machine een uur voor het starten van het experiment in, zodat er voldoende tijd is om de gewenste temperatuur te bereiken en stabiel te blijven. Kies vervolgens in de software-installatie, onder beheermodus, de lengte van de cartridgekalibratie en de gewenste temperatuur. Voer vervolgens het volgende protocol in:Afhankelijk van het experimentele ontwerp voegt u na een gekozen meetstap injectiestappen toe van poorten A naar D.

Om de kwaliteit en de bepaling van de basale OCR te controleren, past u het protocol voor ten minste drie meetcycli aan voordat u de injectie van het eerste geneesmiddel via poort A.Pre-kalibreren van de cartridge een dag, of ten minste vier uur voor het testen, door het toevoegen van 1,0 milliliter kalifrant aan elke put, en plaats de sensor cartridge op de top van de plaat. Bedek de cartridge met Parafilm als deze langer dan 24 uur moet hydrateren om verdamping te voorkomen. Bewaar de cartridge op 37 graden Celsius zonder CO2, 's nachts.

Zorg er vervolgens voor dat de experimentele geneesmiddelen grondig worden opgelost in vers medium, plus 2,5% glucose. Meet en pas de pH van de medicijnoplossing aan op de pH van het voertuig op de gewenste temperatuur. Pipette de drug oplossing in het toegewezen injectie poort.

Laad vervolgens de cartridge in de machine en begin met kalibreren. Pas vers bereide media plus 2,5% glucose aan op de gewenste pH met één normale HCl. Bereid vervolgens een ijsdoos en leg een metalen plaat op het ijs.

Open het eyelet plate pakket. Dompel de netten in de media door 16 millimeter Petri schotel. Verzamel een net met de inserter en laat de inserter naast de microscoop staan.

Voeg een kleine druppel media toe aan het net dat aan de inserter is bevestigd. Verdoven de vliegen vervolgens door ze op een ijskoude metalen plaat te plaatsen. Met behulp van tangen, pak de buik van een vlieg en dompel het onder in de media in een petrischaaltje onder de microscoop.

Met behulp van een tweede paar tangen, verwijder voorzichtig het hoofd van de vlieg. Plaats het hoofd in het midden van het net bevestigd aan de inserter, en controleer of het hoofd is ondergedompeld in de media. Verwijder overbodige vloeistof voordat u de hoofden centreren om te voorkomen dat u hoofden verliest terwijl u ze in de put plaatst.

Als er 16 hoofden op het net, centreren ze. Met behulp van de inserter, plaats het net in de put. Zorg ervoor dat de koppen zijn gevangen onder het net en langzaam toe te voegen 700 microliter van de media plus 2,5%glucose.

Zorg ervoor dat de lege putten, die worden gebruikt voor achtergrond, bevatten ook een net met 700 microliter van de buffer plus 2,5%glucose. Controleer de putten op luchtbellen onder de netten via de microscoop. Pipet zachtjes op en neer met behulp van een een millimeter pipet om eventuele bubbels te verwijderen.

Houd de hoofden gecentreerd voor een betrouwbare OCR lezing. Voeg vervolgens de plaat toe aan de machine en start de meting. Verwijder aan het einde van het protocol de cartridge.

Bevestig visueel dat er geen zichtbare restjes in de poortvullingen zijn. Gooi vervolgens de cartridge en plaat weg als de koppen niet mogen worden gebruikt voor eiwitextractie. Vergeet niet om te kijken naar de zuurstof en de pH-niveaus, om eventuele abnormale putten voorafgaand aan de analyse te detecteren.

Verder is het belangrijk om de juiste berekening van het zuurstofverbruik te kiezen, op basis van het zuurstofgehalte. Bij het uitvoeren van het protocol, werd opgemerkt dat de zuurstofniveaus van midlife hoofden daalde sneller dan jonge vliegen hoofden. Wanneer het bereik van het zuurstofgehalte is vergelijkbaar tussen de omstandigheden, is het beter om de AKOS algoritme te gebruiken om automatisch het zuurstofverbruik te genereren, of OCR, die betrouwbaar weerspiegelt het zuurstofniveau veranderingen tijdens een meting tussen jonge versus midlife hoofden.

De toevoeging van natrium butyraat, of SB, een KDAC-remmer, verandert tijdelijk de dynamiek van het zuurstofgehalte. Terwijl de voertuigcontroles tijdens de eerste en laatste teken een stabiel zuurstofgehalte vertonen, veroorzaakt de toevoeging van SB een aanzienlijke en voorbijgaande daling van het zuurstofgehalte in deze teken. Omdat de AKOS-berekening alle teken in rekening brengt en een anoxische toestand negeert, genereert het een misleidende OCR, zoals waargenomen in de niet-genormaliseerde AKOS-gebaseerde OCR-niveaus, die weinig verandering vertonen bij de injectie van poort A.Het vaste algoritme, dat meer modellen en lijkt op de OCR en zuurstofniveau veranderingen, onthult een verhoogde OCR bij SB behandeling.

Bij het proberen van deze procedure is het belangrijk om samen met twee personen te werken om een relatief korte tijd te garanderen om een enkele plaat voor te bereiden. Na deze procedure kunnen andere biochemische methoden, zoals Western Blot en massaspectrometrie worden uitgevoerd om vragen met betrekking tot moleculaire mechanismen te beantwoorden, bijvoorbeeld die die metabolische veranderingen matigen.