Photobleaching maakt super resolutie beeldvorming van de FtsZ Ring in de Cyanobacterium Prochlorococcus

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over eiwitlokalisatie en de dynamiek in fotosynthetische organismen. Door de fotobleachingmethode te combineren met een microscoop met superresolutie, zijn we in staat om de eiwitdynamiek van fotosynthetische organismen tot in de kleinste details te detecteren. Deze methode geeft niet alleen inzicht in de eiwitdynamiek van Prochlorococcus.

Het kan ook worden toegepast op vele andere organismen die radio-re-dop-sing en bacteriochlorofyl. Het aantonen van deze procedure zal Yanxin Liu zijn, een afgestudeerde student van mijn laboratorium. Om te beginnen, voeg vijf milliliter van zeewater gebaseerde Pro99 medium aan een cultuurfles en inenting met een milliliter prochlorococcus MED4.

Laat de Prochlorococcus groeien bij 23 graden Celsius onder een licht met een intensiteit van 35 micromole fotonen per vierkante meter. Na vijf dagen, verzamel een milliliter van de cultuur in een 1,5 milliliter buis. Voeg 100 microliter vers bereide formaldehyde toe aan de buis om de cultuur te repareren.

Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Draai vervolgens het monster een minuut lager dan 13,500 keer G. Verwijder de supernatant en resuspend de cellen in 100 microliter van Pro99 medium.

Bewaar het monster op vier graden Celsius in het donker tot het klaar is om immunostaining uit te voeren. Ten eerste, vortex de flacon van polystyreen kralen. Bereid met 50% ethanol een één-op-20.000 verdunning als werkende drijfmest.

Zet de kookplaat aan en stel de temperatuur in op 120 graden Celsius. Plaats vervolgens de coverslips op de kookplaat. Laad 100 microliter van de werkende drijfmest op elk deklip en ontcubeer de afdekplaten gedurende 10 minuten op de kookplaat.

Breng vervolgens voorzichtig de coverslips over naar Petri gerechten kraal-kant omhoog voor opslag bij kamertemperatuur. Wanneer klaar om de coverslips jas, op te halen een, ervoor te zorgen dat het kraal-kant omhoog. Voeg 100 microliter van een 1 milligram per milliliter poly-L-lysine oplossing toe aan het midden van de coverslip en laat het 30 minuten op kamertemperatuur zitten.

Gebruik hierna een pipet om ongebonden poly-L-lysine voorzichtig aan tezuiden en over te brengen naar een buis van 1,5 milliliter. Bewaar deze poly-L-lysine op vier graden Celsius voor later gebruik. Spoel de coverslip met 10 milliliter ultra gefilterd water in een petrischaaltje van 60 millimeter en droog deze vervolgens kort met een papieren handdoek.

Breng de gecoate coverslip naar een nieuwe petrischaal met Parafilm aan de onderkant, die zal worden gebruikt als de kleuring schotel. Laad 100 microliter van het vaste monster op de coverslip en laat het 30 minuten zitten om de celbevestiging toe te staan. Gebruik vervolgens een papieren handdoek om de resterende oplossing te absorberen en breng de coverslip vervolgens over naar een put in een 12-put plaat om te wassen.

Voeg een milliliter PBS buffer aan de put om de coverslip te wassen. Verwijder vervolgens de PBS en voeg een milliliter verse PBS toe om de coverslip een tweede keer te wassen. Gebruik een pipet om de PBS te verwijderen en te vervangen door een milliliter vers bereide permeabilisatie buffer.

Broed de wasschaal 20 minuten lang uit op 37 graden Celsius. Verwijder vervolgens de permeabilisatiebuffer. Begin het wasproces door het toevoegen van een milliliter verse PBS buffer.

Leg de wasschaal op een shaker om de schotel vijf minuten zachtjes te roeren. Verwijder hierna de PBS en herhaal het wasproces drie keer. Breng de gewassen hoezenlip naar de kleuring schotel.

Voeg 50 microliter blokkeerbuffers toe aan de bovenkant van de coverslip. Plaats de gehele kleuring schotel op ijs en dan verplaatsen onder de xenon lichtbron voor fotobleaching voor ten minste 60 minuten. Nadat u fotobleaching en blokkering hebt gemaakt, gebruikt u de rand van een papieren handdoek om de blokkeringsbuffer te verwijderen.

Ten eerste, verdun een microliter anti-FtsZ-antilichaam in 99 microliter blokkeerbuffers. Plaats 50 microliter van het verdunde primaire antilichaam op de afdekken en broed het 30 minuten op kamertemperatuur. Breng de hoezenlip over in een put van de wasschaal.

Om te beginnen met de was, voeg een milliliter PBS. Breng de wasschaal vervolgens over op een shaker en schud deze zachtjes gedurende vijf minuten. Verwijder de PBS en herhaal het hele wasproces drie keer.

Breng vervolgens de hoezenlip over op de kleuringsschaal. Plaats 50 microliter van het verdunde secundaire antilichaam op de coverslip en broed het 30 minuten in het donker en bij kamertemperatuur. Breng de hoezenlip terug naar de wasschaal.

Om te beginnen met de was, voeg een milliliter PBS. Wikkel de wasschaal in aluminiumfolie om het te beschermen tegen licht. Breng de plaat naar de shaker en schud hem vijf minuten zachtjes.

Verwijder de PBS en herhaal het hele wasproces drie keer. Bereid vlak voor de STORM-beeldvorming een milliliter beeldverkeringsbuffer voor, zoals beschreven in het tekstprotocol. Laad de afdek in de laadkamer.

Voeg de vers bereide beeldvorming buffer, zacht om te voorkomen dat het afwassen van de cyanobacteriële cellen. Plaats hierna een rechthoekige coverslip bovenop de beeldbuffer om te voorkomen dat deze reageert met de zuurstof in de lucht. Zet de camera, het LED-licht en de laser aan en open de STORM-software.

Voeg een halve druppel onderdompelingsolie toe bovenop de lens. Laad de kamer, om ervoor te zorgen dat de objectieve lens contact maakt met de coverslip. En onderzoek het signaal met een laser van 750 nanometer.

Identificeer een voorbeeldgebied dat zowel cellen als fiduciële markeringen bevat. Start dan de software voor monster drifting correctie. Verwerf een breed gearchiveerde beelden als referentie, met de camera elektronen vermenigvuldiging te krijgen op 300 en een belichtingstijd van 30 milliseconden.

Verhoog de 750 nanometer excitatie laser intensiteit tot ongeveer 4,5 kilowatt per vierkante centimeter. Zodra de fluoroforen zijn overgestapt naar een schaars knipperend patroon, verkrijg je één afbeelding met een superresolutie door 10.000 frames op 33 hertz te verzamelen. Reconstrueer vervolgens de afbeeldingen met superresolutie uit de ruwe gegevens zoals beschreven in het tekstprotocol.

In deze studie, STORM wordt gebruikt om super-resolutie beeldvorming te bereiken door het activeren van individuele foto-switchable fluorofoof stoofspeld. De locatie van elke fluorofophore wordt geregistreerd en een afbeelding met een superresolutie wordt vervolgens op basis van deze locaties geconstrueerd. Terwijl de absorptiespectra van Prochlorococcus pieken op 447 en 680 nanometer en heeft minimale absorptie boven 700 nanometer, Prochlorococcus MED4 cellen nog steeds uitstoten hoge autofluorescentie bij blootstelling aan een extreem hoge intensiteit van de 750 nanometer laser, die nodig is voor STORM beeldvorming.

Na het gebruik van de hier beschreven fotobleachingmethode gedurende 30 minuten, wordt de autofluorescentie van de cellen gezien om af te nemen, hoewel verschillende cellen met autofluorescentie nog steeds worden gedetecteerd. Het verlengen van de fotobleaching tot 60 minuten resulteert in de meerderheid van de cellen verliezen hun autofluorescentie. Deze resultaten geven aan dat de ontwikkelde fotobleaching methode in staat is om de autofluorescentie van fotosynthetische organismen sterk te verminderen.

Na het fotobleaching wordt STORM gebruikt om het celdelingeiwit FtsZ in de cellen te visualiseren. Met behulp van STORM wordt een gedetailleerde morfologie van de FtsZ-ring onthuld. Door het draaien van de 3D STORM beelden, vier verschillende soorten morfologieën werden geïdentificeerd, clusters, een onvolledige ring, een complete ring, en dubbele ringen.

Het is belangrijk om te onthouden dat de lichtintensiteit en de duur van de fotobleach kan verschillen voor verschillende organismen. Na de ontwikkeling maakt deze methode de weg vrij voor onderzoekers die eiwitorganisatie en potentiële functie in fotosynthetische cellen tot in detail willen bestuderen.