Name: Optogenetische manipulatie van neurale circuits tijdens het monitoren van slaap/wakkerheid toestanden in muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Leer optogenetische manipulatie van neurale circuits bij muizen met real-time EEG/EMG-monitoringsmethoden. Deze techniek onderzoekt de causale relaties tussen BNST-neuronen en slaap-waaktransities.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door het Merck Investigator studies-programma (#54843), een KAKENHI-subsidie voor wetenschappelijk onderzoek op innovatieve gebieden, "WillDynamics" (16H06401) (T.S.), en een KAKENHI-subsidie voor verkennend onderzoek naar innovatieve gebieden (T.S.) (18H02595).

Alle experimenten hier werden goedgekeurd door het dier experiment en het gebruik Comité van de Universiteit van Tsukuba, die voldoen aan de NIH richtlijnen.
1. dieren chirurgie, virus injectie, elektrode voor EEG/EMG en implantatie van optische vezels
Let op: Er moeten passende beschermings-en behandelingstechnieken worden gekozen op basis van het bioveiligheidsniveau van het te gebruiken virus. AAV moet worden gebruikt in een geïsoleerde P1A gegradeerde ruimte voor injectie, en de buis met AAV moet worden gesteriliseerd met een autoclaaf nadat al het volume is opgebruikt. De chirurgische plaats en alle geïmplanteerde materialen moeten tijdens het gebruik schoon en steriel zijn. Opmerking: Zie Figuur 1.
<ol><li>Desinfecteer de chirurgische apparatuur met de autoclaaf.</li>
	<li>Anesthetiseer muizen met Isofluraan met behulp van een anestheticum vaporizer. Observeer tot de muis de gewenste diepte van anesthesie heeft bereikt, bepaald door een verlies van respons om de staart met een tang te knijpen. Breng oftalmische zalf aan op de ogen om te voorkomen dat ze drogen.</li>
	<li>Desinfecteer het chirurgische veld met jodiumoplossing of 70% EtOH (3x) en voldoende droog. Laat het virus ontdooien op ijs als de operatie wordt uitgevoerd. Bedek het chirurgische gebied met een absorberend laboratorium Bank papier.</li>
	<li>Bevestig het hoofd van de muis in het stereotactische apparaat met oorstangen en een neus knijp. Na bevestiging van het hoofd stabiel wordt gehouden, maak een midsagittale incisie in de hoofdhuid om ervoor te zorgen dat de posities van de bregma en Lambda bevinden zich op hetzelfde niveau op een horizontale lijn.</li>
	<li>Om te voorkomen dat een positionering Gap, op de juiste wijze de niveaus van de neus knijpen en oor balken op en neer aanpassen. De bregma en Lambda verwijzen naar de kruising tussen de sutura saggitalis en sutura coronalis of sutura lambdoidal, respectievelijk (Figuur 2).</li>
	<li>Gebruik de Serafin klemmen om de huid te houden om de toegang tot de cranium te behouden. Desinfecteer na blootstelling van de schedel het oppervlak van de schedel met jodium of 5% H2O2, zodat de craniale hechtingen, inclusief de bregma en lambda, duidelijker kunnen worden gevisualiseerd.</li>
	<li>AAV vector injectie voorbereiden:
	<ol>
<li>Was de binnenkant van een 10 mL spuit (Zie tabel van de materialen) opeenvolgend met 70% etoh, 100% EtOH, en gesteriliseerd water, 5 keer per stuk. Bevestig de spuit in de klem van een microinjectiearm en zorg ervoor dat alle oplossing in de spuit ontladen is.</li>
		<li>Zuig voorzichtig 2 μL minerale olie op zonder luchtbellen en zuig vervolgens het aangewezen volume van de virusoplossing op. Na de aspiratie manipuleer je de zuiger knop en bevestig je dat de virusoplossing aan de punt van de naald verschijnt. Opmerking: Het injectievolume van de virusoplossing werd bepaald in proef experimenten met dezelfde muis stam en hetzelfde virus product. De verhouding tussen het volume van de virusoplossing en de omvang van het infectie gebied moet vooraf worden geschat.</li>
	</ol></li>
	<li>Injecteer AAV vector:
	<ol>
<li>Stel de punt van de microinjectienaald op de bregma in en noteer de coördinaten als het oorspronkelijke punt. Beweeg de punt naar de aangewezen injectieplaats (voor de bnst: anteroposterieure + 0,2 mm, Mediolaterale ± 1,0 mm, dorsoventral-4,2 mm) en plaats de punt van de naald op de positie. Zet een merkteken op de schedel en boorgaten van ongeveer 2 mm in diameter met behulp van een tandheelkundige boor met een 0,7 mm Carbide frees. Wees voorzichtig niet te beschadigen de Dura of hersenweefsel.</li>
		<li>Na het verwijderen van bloed uit rond de gaten met een wattenstaafje, beweeg de naald langzaam in de positie van de BNST. Injecteer de aangewezen hoeveelheid virusoplossing (0,07 μl/min) langzaam met een mechanische micro injector. Na het voltooien van de injectie, laat de naald 5 min om de oplossing voldoende infiltreren het BNST weefsel. Verwijder voorzichtig de naald.</li>
		<li>Voor bilaterale injectie herhaalt u de stappen 1.8.1-1.8.2 aan de andere kant. Houd de schedel gedurende de hele procedure vochtig met toepassingen van steriele zoutoplossing. Opmerking: We gebruikten aangepaste EEG/EMG implantaten (W: 5 mm, D: 7 mm, H: 1 mm) met vier EEG elektroden (4 mm), twee EMG elektroden (2 mm; Knip de 4 mm-elektrode op 2 mm met Nippers) en 6 elektroden (4,5 mm) (Figuur 2a).</li>
	</ol></li>
	<li>Soldeer twee RVS draden (Zie tabel van materialen) waarvan 1 mm van de isolatie is ontdaan van beide uiteinden aan de EMG-elektroden. Pas het midden van de elektroden aan de bregma en markeer de positie van elke EEG-elektrode (anteroposterior ± 1,5 mm, Mediolaterale ± 1,0 mm), en bepaal de positie van het implantaat (Figuur 2b).</li>
	<li>Optische vezels voor implantaten:
	<ol>
<li>Bevestig een glasvezel-Ferrule aan de manipulator en draai aan de manipulator-arm zodat deze een hoek van ± 30 ° heeft tegen een horizontale lijn (dit proces is alleen nodig om interferentie tussen elektroden en optische vezels te voorkomen, zoals in het geval van BNST-stimulatie). Plaats de vezel punt op de bregma en noteer de coördinaten.</li>
		<li>Verplaats de punt naar de beoogde plaatsings lijn en markeer de positie op de schedel. Plaats ook extra markeringen in de buurt van de plaatsings plaats voor de anker schroeven. Boor de schedel op elke plaats met een tandheelkundige boor om de glasvezel in te voegen en bevestig de schroef. Bevestig de schroef op de schedel. Wees voorzichtig niet te breken de Dura of beschadigen van een weefsel door schroef.</li>
		<li>Plaats de glasvezel zachtjes totdat u boven de BNST met een manipulator bereikt. De Ferrule moet op de overgebleven cranium rusten (Figuur 1b).</li>
		<li>Breng fotocurable Dental cement (Zie tabel van de materialen) om de vezels en de schroef te bedekken. De reactietijd voor het stollen van de lijm moet worden gespecificeerd door de handleiding van de fabrikant (ons materiaal moet blootstelling aan licht voor ten minste 10 s met een specifieke golflengte foto generator. Het is niet nodig om de lijm na deze te drogen).</li>
		<li>In deze stap, zorg ervoor dat er geen materialen (schroef of lijm) bezetten de montageruimte voor de elektroden. Bovendien, Vermijd het maken van een onderbreking in het cement voor de Ferrule aansluiten op de glasvezel en kabel. Herhaal stap 1.10.1-1.10.4 aan de andere kant voor bilaterale stimulatie.</li>
	</ol></li>
	<li>Boorgaten voor EEG/EMG elektroden. Steek de uiteinden van de elektroden in de gaten. Houd het implantaat en breng Cyanoacrylaat lijm aan op de ruimte tussen de schedel en de elektroden. Plaats opnieuw met de aandacht om niet te interfereren met alle materialen.</li>
	<li>Bedek de omtrek van de elektroden en optische vezels met Cyanoacrylaat lijm gevolgd door toepassing van cyanoacrylaat katalysator op de lijm. Deze stap vermijdt het veroorzaken van enige onderbreking bij de Ferrule-to-Optic kabel en elektrode-to-lead draad verbindingszone (figuur 1c). Opmerking: Cyanoacrylaat lijm en zijn katalysator zijn schadelijk voor het oog van de muis. Let op dat deze chemische stoffen niet morsen. Ook, wees voorzichtig niet te sterk aanraken van de elektroden en de vezels om onverwachte afwijking onmiddellijk na lijm stollen te voorkomen.</li>
	<li>Stel de muis nekspieren bloot en steek de draden voor de EMG-elektrode onder de spier. Pas de lengte van de EMG-elektrode aan zodat deze net onder de dwarskam-spieren lokaliseert. Licht verbinding tussen de punt van de elektrode en de spier fascia is genoeg om het EMG-signaal te vangen.</li>
	<li>Breng Cyanoacrylaat lijm aan om de implantaten te vullen en de lijm met acceleratie vloeistof stollen. Plaats vervolgens de muis op een warmte pad voor herstel totdat de houdings reflex verschijnt. Pas de warmte pad temperatuur aan de dierlijke rust lichaamstemperatuur (36,0 °C in ZT 0-12 in het geval van C57BL6 muizen; niet meer dan 38,0 °C). Opmerking: Een antibioticum is niet vereist voor steriele chirurgie.</li>
	<li>Volg uw lokale institutionele richtlijnen voor postoperatieve analgesie. Houd de muizen in een huis kooi voor een herstelperiode van ten minste 7 dagen.</li>
</ol>2. EEG/EMG monitoring met foto-excitatie van gerichte neuronen in specifieke slaap toestanden
Let op: Dit protocol omvat het gebruik van klasse 3B-laserapparatuur of LED-apparaten. Experimenteurs moeten zich bewust zijn van veiligheidsinformatie. Een beschermende oogbril is vereist.
<ol><li>Voordat u de laser kabel aansluit op de optische vezel, past u de laserintensiteit aan met een Scaler. Tether de punt van de laser kabel aan een ongebruikte glasvezel met een Ferrule en bevestig dat er geen ruimte op de kruising tussen de vezel en de kabel.</li>
	<li>Zet de hoofdschakelaar van de laser aan en wacht 20 minuten om op te warmen.</li>
	<li>Stoot de laser uit naar de intensiteits Checker en pas de laserintensiteit aan op 10 mW/mm2. Verander de laser modus naar transistor logica en bevestig dat lichtpulsen worden uitgezonden uit de vezel gecontroleerd door de patroon regulator die is ingesteld op 10 MS voor duur, 40 MS voor rust, 20 tijden voor cyclus, en 20 keer herhalen (dat wil doen, 20 Hz van 10 MS lichtpulsen voor 20 s).</li>
	<li>Beweeg na de herstelperiode de muizen naar de experimentele kamer voor het opnemen van EEG/EMG. Huis muizen op een constante 23 ° c met een 12 h licht/donker cyclus met voedsel en water beschikbaar ad libitum.</li>
	<li>Sluit de geïmplanteerde elektrode en kabel adapter aan die aan een slip ring is vastgebonden om verstrikking te voorkomen. Het wordt aanbevolen om de kruising te bedekken met lichtdoorlatbaar materiaal zoals aluminiumfolie om laser lekkage te voorkomen. Als een bilateraal experiment vereist is, gebruik dan een slip ring met een bifurcate-bevestiging voor de kabels.</li>
	<li>In dit protocol, we beoordelen latentie tot wakkerheid van NREM-slaap of REM-slaap, zodat de opnametijd moet worden beperkt in geoptimaliseerde zeitgeber tijd (ZT0 wordt gedefinieerd als de tijd wanneer het lampje brandt). Dit protocol werd uitgevoerd tussen ZT4-ZT10. Laat de muizen gedurende ten minste 1 uur vrij in de experimentele kamer blijven als acclimatisatie.</li>
	<li>Bewaak tijdens de experimentele periode EEG-en EMG-signalen in dezelfde monitor en evalueer de toestand van de muis als wakkerheid, NREM-slaap of REM-slaap. Gebruik de versterkingsregeling voor elke golf om het onderscheid tussen elke status te vereenvoudigen.</li>
	<li>Voor het meten van de NREM-slaap tot wakkerheid latentie, observeren stabiele NREM-slaap voor 40 s of stabiele REM-slaap voor 30 s, dan zet de schakelaar van de patroon Generator voor photostimulatie (dit protocol genereert 20 Hz van 10 MS lichtpulsen voor 20 s). Bevestig de laser emissie aan de geïmplanteerde optische vezels.</li>
	<li>Record EEG/EMG signalen totdat de slapende toestand verandert in wakkerheid. Als twee of meer experimentele proeven nodig zijn, beperk optogenetische manipulatie tot één keer per dag, omdat foto stimulatie een kunstmatige ingreep is die de architectuur van slaap/wakkerheid kan beïnvloeden.</li>
	<li>Na het experiment, diep anesthetiseren en parfuseren met steriele zout en Paraformaldehyde (PFA) voor het bemonsteren van de hele hersenen voor immunohistochemische analyse26.</li>
</ol>3. analyse van latentie tijd van NREM-slaap naar wakkerheid
<ol><li>Na het opnemen van EEG/EMG signalen, overdracht van de signaal gegevens naar een computer voor het scoren van slaap/wakkerheid Staten. Dit protocol beschrijft de methode voor EEG-analyse met opname software (Zie tabel met materialen).</li>
	<li>Start de toepassing Sleep Sign en klik op het tabblad bestand en selecteer openen om de opgenomen gegevens (. kcd-bestand) te kiezen. Klik op het tabblad slaapstand om Epoch time te selecteren voor het aanpassen van het tijdvenster voor elk Epoch (we gebruiken 1 Epoch/4 sec).</li>
	<li>Handmatig Score slaap/wakkerheid Staten op basis van EEG/EMG signalen, volgens de volgende criteria: wakkerheid, hoge EMG en lage EEG spanning met hoge frequentie; NREM, lage EMG Toon en hoge EEG spanning met hoge δ (0.5-4 Hz) frequentie; en REM, EMG geeft spier atonia en lage EEG spanning met hoge θ (6-9 Hz) frequentie. Een staat die niet opeenvolgend doorgaat voor 16 sec. (d.w.z. 4 tijdperken) wordt niet gedefinieerd als een statuswijziging omdat het geen stabiele staat is.</li>
	<li>Klik en houd de linker muisknop op de eerste Epoch en sleep de cursor totdat de specifieke trend van meer dan 16 s (4 tijdperken) is beëindigd. Laat vervolgens de linker muisknop los en kies de juiste status (wakkerheid of NREM-slaap of REM-slaap) in het pop-upvenster. Herhaal deze procedure om alle EEG/EMG-signalen te scoren die in het bestand zijn opgenomen.</li>
	<li>Zoek het exacte tijdstip van de stimulatie in het tijdperk waar het EEG NREM of REM-slaap toont, en de epoche die de status overgang weergeeft na het stimulatie punt. Tel het aantal tijdperken tussen de perioden net na de stimulatie en vlak voor de overgang van de staat.</li>
	<li>Vermenigvuldig dan het getelde aantal tijdperken met 4 s (A). In het tijdperk van stimulatie neemt u een schermopname en meet u de breedte tussen het stimulatie punt en het einde van de epoche. Verdeel vervolgens de gemeten lengte door de gehele Epoch-lengte en vermenigvuldig deze met 4 s (B). Op dezelfde manier, bereken de duur van de NREM-slaap in het tijdperk van de statuswijziging, wat betekent dat de periode tussen het begin van de Epoch en de status wijzigen punt (C).</li>
	<li>Som A, B en C om de latentie van NREM-slaap te verkrijgen tot wakkerheid. Dezelfde procedure wordt gebruikt voor de analyse van de status overgang van REM-slaap naar wakkerheid.</li>
</ol>

<ol><li>Spoormaker, V. I., Montgomery, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disturbed+sleep+in+post-traumatic+stress+disorder%3A+Secondary+symptom+or+core+feature%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep+Medicine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Disturbed sleep in post-traumatic stress disorder: Secondary symptom or core feature?</a> Sleep Medicine Reviews. 12 (3), 169-184 (2008).</li>
<li>Dworak, M., Wiater, A., Alfer, D., Stephan, E., Hollmann, W., Struder, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+slow+wave+sleep+and+reduced+stage+2+sleep+in+children+depending+on+exercise+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep+Medicine%22%5BJournal%5D)">Increased slow wave sleep and reduced stage 2 sleep in children depending on exercise intensity.</a> Sleep Medicine. 9 (3), 266-272 (2008).</li>
<li>Mellman, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+and+anxiety+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Psychiatric+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Sleep and anxiety disorders.</a> Psychiatric Clinics of North America. 29 (4), 1047-1058 (2006).</li>
<li>Scammell, T. E., Arrigoni, E., Lipton, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuitry+of+wakefulness+and+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural circuitry of wakefulness and sleep.</a> Neuron. 93 (4), 747-765 (2017).</li>
<li>Chemelli, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Narcolepsy+in+orexin+knockout+mice%3A+Molecular+genetics+of+sleep+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Narcolepsy in orexin knockout mice: Molecular genetics of sleep regulation.</a> Cell. 98 (4), 437-451 (1999).</li>
<li>Borbély, A. A., Daan, S., Wirz-Justice, A., Deboer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two-process+model+of+sleep+regulation%3A+A+reappraisal%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Sleep+Research%22%5BJournal%5D)">The two-process model of sleep regulation: A reappraisal.</a> Journal of Sleep Research. 25 (2), 131-143 (2016).</li>
<li>Daan, S., Beersma, D. G., Borbely, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+human+sleep%3A+recovery+process+gated+by+a+circadian+pacemaker%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Regulatory%2C+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Timing of human sleep: recovery process gated by a circadian pacemaker.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 246 (2), R161-R183 (1984).</li>
<li>Saper, C. B., Cano, G., Scammell, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic%2C+circadian%2C+and+emotional+regulation+of+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Homeostatic, circadian, and emotional regulation of sleep.</a> Journal of Comparative Neurology. 493 (1), 92-98 (2005).</li>
<li>Saper, C. B., Fuller, P. M., Pedersen, N. P., Lu, J., Scammell, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+state+switching%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sleep state switching.</a> Neuron. 68 (6), 1023-1042 (2010).</li>
<li>LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emotion+circuits+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Emotion circuits in the brain.</a> Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).</li>
<li>Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+circuits+for+fear+and+anxiety%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal circuits for fear and anxiety.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).</li>
<li>Lebow, M. A., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overshadowed+by+the+amygdala%3A+the+bed+nucleus+of+the+stria+terminalis+emerges+as+key+to+psychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Overshadowed by the amygdala: the bed nucleus of the stria terminalis emerges as key to psychiatric disorders.</a> Molecular Psychiatry. 21 (4), 450-463 (2016).</li>
<li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tangential+migration+and+proliferation+of+intermediate+progenitors+of+GABAergic+neurons+in+the+mouse+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tangential migration and proliferation of intermediate progenitors of GABAergic neurons in the mouse telencephalon.</a> Development. 138 (12), 2499-2509 (2011).</li>
<li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251-266 (2012).</li>
<li>de Lecea, L., Carter, M. E., Adamantidis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shining+light+on+wakefulness+and+arousal%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Shining light on wakefulness and arousal.</a> Biological Psychiatry. 71 (12), 1046-1052 (2012).</li>
<li>Carter, M. E., Brill, J., Bonnavion, P., Huguenard, J. R., Huerta, R., de Lecea, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+for+hypocretin-mediated+sleep-to-wake+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanism for hypocretin-mediated sleep-to-wake transitions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2635-E2644 (2012).</li>
<li>Weber, F., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit-based+interrogation+of+sleep+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Publishing+Group%22%5BJournal%5D)">Circuit-based interrogation of sleep control.</a> Nature Publishing Group. 538, 51-59 (2016).</li>
<li>Weber, F., Chung, S., Beier, K. T., Xu, M., Luo, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+REM+sleep+by+ventral+medulla+GABAergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of REM sleep by ventral medulla GABAergic neurons.</a> Nature. 526, 435-438 (2015).</li>
<li>Oishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow-wave+sleep+is+controlled+by+a+subset+of+nucleus+accumbens+core+neurons+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Slow-wave sleep is controlled by a subset of nucleus accumbens core neurons in mice.</a> Nature Communications. 8 (1), 1-12 (2017).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-light+sensitivity+optical+neural+silencer%3A+development+and+application+to+optogenetic+control+of+non-human+primate+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Systems+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 1-8 (2011).</li>
<li>Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+optogenetics+with+complementary+methodologies+in+systems+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).</li>
<li>Saito, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+in+the+preoptic+area+send+direct+inhibitory+projections+to+orexin+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons in the preoptic area send direct inhibitory projections to orexin neurons.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7 (December), 1-3 (2013).</li>
<li>Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FLEX+switch+targets+Channelrhodopsin-2+to+multiple+cell+types+for+imaging+and+long-range+circuit+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping.</a> Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).</li>
<li>Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitation+of+GABAergic+neurons+in+the+bed+nucleus+of+the+stria+terminalis+triggers+immediate+transition+from+non-rapid+eye+movement+sleep+to+wakefulness+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Excitation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis triggers immediate transition from non-rapid eye movement sleep to wakefulness in mice.</a> Journal of Neuroscience. 37, 7174-7176 (2017).</li>
<li>Lin, F., Pichard, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLin%2C+F+%22Handbook+of+practical+immunohistochemistry%3A+frequently+asked+questions%22">Handbook of practical immunohistochemistry: frequently asked questions</a>. , Springer. (2011).</li>
<li>Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+neurons%3A+tools%2C+applications%2C+and+experimental+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Silencing neurons: tools, applications, and experimental constraints.</a> Neuron. 95 (3), 504-529 (2017).</li>
<li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Prigge, M., Schneider, F., Davidson, T. J., O’Shea, D. J., Sohal, V. S., Goshen, I., Finkelstein, J., Paz, J. T., Stehfest, K., Fudim, R., Ramakrishnan, C., Huguenard, J. R., Hegemann, P., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortical+excitation%2Finhibition+balance+in+information+processing+and+social+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction.</a> Nature. 40 (6), 1301-1315 (2012).</li>
</ol>

Dit project werd deels financieel ondersteund door Merck & Co.

We hier presenteerde een methode voor het evalueren van het effect van optogenetische stimulatie van neuronen met bepaalde chemische identiteiten op staat overgangen van slaap/wakkerheid en gaf een voorbeeld van manipulatie van GABABnst neuronen. Onze gegevens toonden aan dat optogenetische excitatie van GABABnst neuronen resulteert in onmiddellijke overgang van NREM slaap naar wakkerheid.
Verschillende experimentele ontwerpen zijn beschikbaar vanwege de ontwikkeling van ...

Slaap is essentieel voor een optimale cognitieve functie. Recente bevindingen suggereren ook dat verstoringen in de slaap worden geassocieerd met een breed scala aan ziekten1,2,3. Hoewel de functies van de slaap zijn nog grotendeels onopgeloste, substantiële vooruitgang is onlangs gemaakt in het begrijpen van de neurale circuits en mechanismen die controle slaap/wakkerheid Staten4. In zoogdieren, er zijn drie staten van waakzaamheid: wakkerheid, non-Rapid Eye Movement (NREM) slaap, en Rapid Eye Movement (REM) slaap. Wakkerheid wordt gekenmerkt door snelle EEG-oscillaties (5-12 Hz) van lage amplitude met doelbewuste en aanhoudende motorische activiteit. NREM-slaap wordt gedefinieerd door langzame oscillaties (1-4 Hz) van hoge amplitude (delta golven), met gebrek aan bewustzijn en doelbewuste motorische activiteit. REM-slaap wordt gekenmerkt door relatief snelle oscillaties (6-12 Hz) van lage amplitude en bijna volledige bilaterale spier atonia5.
Borbely stelde een theorie van slaap-wakkerheid verordening voor, bekend als de twee procesmodel6,7. Een homeostatisch proces, ook wel proces S genoemd, vertegenwoordigt slaap druk die zich ophoteert tijdens wakkerheid en verdwijnt tijdens de slaap. Een ander proces, aangeduid als proces C, is een circadiane proces, die verklaart waarom waakzaamheid niveaus fluctueren in de 24 h cyclus. Naast deze twee processen, allostatische factoren zijn ook belangrijk voor de regulering van de slaap/wakkerheid8,9. Allostatische factoren omvatten voedings toestanden en emotie. Angst en angst gaan meestal gepaard met een toename van de opwinding samen met autonome en neuro-endocriene reacties10,11,12. Het limbisch systeem wordt verondersteld om een rol te spelen in de regulering van angst en angst, en mechanismen die onderliggende autonome en neuro-endocriene reacties zijn uitgebreid bestudeerd, maar het pad waardoor het limbisch systeem beïnvloedt slaap/wakkerheid Staten heeft niet nog niet is onthuld. Een groot aantal recente studies met behulp van opto-en farmacogenetica hebben gesuggereerd dat neuronen en neuronale circuits die reguleren van slaap/wakkerheid Staten zijn verdeeld over de hersenen, met inbegrip van de cortices, basale forebrain, thalamus, hypothalamus, en hersenstam. In het bijzonder, recente ontwikkelingen in optogenetics hebben ons toegestaan om te stimuleren of te remmen specifieke neurale circuits in vivo met hoge ruimtelijke en tijdelijke resoluties. Deze techniek zal leiden tot vooruitgang in ons begrip van de neurale substraten van slaap en wakkerheid, en hoe slaap/wakkerheid Staten worden gereguleerd door circadiane processen, slaap druk, en allostatische factoren, met inbegrip van emotie. Dit artikel is bedoeld om te introduceren hoe optogenetische manipulatie gecombineerd met slaap/waak opname, die het potentieel hebben om ons begrip van de connectomes en mechanismen in de hersenen die een rol spelen in de regulering van NREM slaap, REM slaap, en wakkerheid. Begrip van dit mechanisme waardoor het limbisch systeem slaap/wakkerheid regelt is van het allergrootste belang voor de gezondheid, omdat slapeloosheid meestal wordt geassocieerd met angst of angst om niet in staat om te slapen (somniphobia).
De BNST wordt verondersteld een essentiële rol te spelen in angst en vrees. Gad 67-het uitdrukken van GABAergic neuronen zijn een grote populatie van de bnst12,13. We onderzochten het effect van optogenetische manipulatie van deze neuronen (GABABnst) op slaap/wakkerheid Staten. Een van de grootste vooruitgang in de neurowetenschappen in de afgelopen jaren is methoden die manipulatie van neuronen met bepaalde chemische identiteiten in vivo mogelijk maken, met hoge ruimtelijke en temporele resoluties. Optogenetics is zeer nuttig voor het aantonen van causale verbanden tussen neurale activiteit en specifieke gedrags responsen14. We beschrijven optogenetics als een methode voor het onderzoeken van de functionele connectiviteit van gedefinieerde neurale circuits in de regulering van de slaap/wakkerheid Staten. Door gebruik te maken van deze techniek, grote vooruitgang is bereikt in het begrijpen van de neuronale circuits die slaap/wakkerheid staten reguleren15,16,17,18,19 . In veel gevallen worden opsins specifiek geïntroduceerd in neuronen met specifieke chemische identiteiten in selectieve hersengebieden door een combinatie van CRE-driver muizen en CRE-inducible AAV-gemedieerde genoverdracht. Verder, focale uitdrukking van foto-gevoelige opsins zoals channelrhodopsin 2 (ChR2)20 of archaerhodopsin (archt)21 in combinatie met een CRE-Loxp of FLP-FRT-systeem stelt ons in staat om een selectieve neuronale populatie te manipuleren en specifieke Neural pathway22.
We beschrijven hier experimenten op GABAergic neuronen in de BNST als voorbeeld. Om opzonden in een aangewezen neuronale populatie uit te drukken, worden geschikte CRE driver muizen en CRE-afhankelijke virus vectoren het vaakst gebruikt. Transgene of knock-in lijnen waarin opsins worden uitgedrukt in het bijzonder neuronale populaties zijn ook nuttig. In de volgende experimenten gebruikten we GAD67-CRE knock-in muizen23 waarin alleen GABAergic neuronen Express CRE of met een C57BL/6j genetische achtergrond, en een Aav vector die CHR2 bevat (hChR2 H134R) gesmolten met eyfp of eyfp als een controle met een "FLEx (Flip-excision) schakelaar"24. De procedure specifiek beschrijft optogenetische excitatie van GABAergic neuronen in de BNST tijdens het monitoren van de slaap/wakkerheid Staten25.

<table><tbody><tr><td>1x1 Fiber-optic Rotary Joints</td><td>Doric</td><td>FRJ 1x1 FC-FC</td><td>voor optogenetics</td></tr><tr><td>6-pin header</td><td>KEL corporation</td><td>DSP02-006-431G</td><td></td></tr><tr><td>6-pin socket</td><td>Hirose</td><td>21602X3GSE</td><td></td></tr><tr><td>A/D converter</td><td>Nippon koden</td><td>N/A</td><td>Analog naar digitaal converter</td></tr><tr><td>AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP</td><td></td><td></td><td>3.70&times;1013(genomische kopieën/ml)</td></tr><tr><td>AAV10-EF1a-DIO-EYFP</td><td></td><td></td><td>5.82&times;1013(genomische kopieën/ml)</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fuji film</td><td>014-23302</td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Nippon koden</td><td>N/A</td><td>voor EEG/EMG opname</td></tr><tr><td>Anesthetic vaporizer</td><td>Muromachi</td><td>MK-AT-210D</td><td></td></tr><tr><td>Automatic injecter</td><td>KD scientific</td><td>780311</td><td></td></tr><tr><td>Carbide cutter</td><td>Minitor</td><td>B1055</td><td>&phi;0.7 mm. Ook bekend als tandheelkundige boor, gebruikt met hoge snelheid roterende micromotor&nbsp;</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate adhesie&nbsp; (Aron alpha A) en acceleratie</td><td>Konishi</td><td>#30533</td><td></td></tr><tr><td>Dental curing light</td><td>3M</td><td>Elipar S10</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy lijm</td><td>Konishi</td><td>#04888</td><td>isolatie rond de soldeerverbinding van 6-pin en afgeschermde kabel</td></tr><tr><td>Fiber optic patch cord (vertakking)</td><td>Doric</td><td>BFP(#)_50/125/900-0.22</td><td></td></tr><tr><td>Gad67-Cre muizen</td><td>verstrekt door Dr. Kenji Sakimura</td><td></td><td>Cre recombinase gen is ingebouwd in de Gad67 allel</td></tr><tr><td>Hamilton spuit</td><td>Hamilton</td><td>65461-01</td><td></td></tr><tr><td>High speed rotary micromotor kit</td><td>FOREDOM</td><td>K.1070</td><td>Gebruikt met carbide cutter</td></tr><tr><td>Interconnecting sleeve</td><td>Thorlab</td><td>ADAF1</td><td>&phi;2.5 mm Keramisch&nbsp;</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Pfizer</td><td>871119</td><td></td></tr><tr><td>Laser&nbsp;&nbsp;</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>N/A</td><td>473 nm golflengte</td></tr><tr><td>Laser intensiteitschecker</td><td>COHERENT</td><td>1098293</td><td></td></tr><tr><td>Laser stimulator</td><td>Bio research center</td><td>STO2</td><td>Ook bekend als pulsgenerator in tekst</td></tr><tr><td>Optische vezel met ferrule&nbsp;</td><td>Thorlab</td><td>FP200URT-CANNULA-SP-JP</td><td></td></tr><tr><td>pAAV2-rh10</td><td>verstrekt door PennVector Core</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA</td><td>Addgene</td><td>plasmid # 20296</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA</td><td>verstrekt door Dr. Karl Deisseroth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Patch cord</td><td>Doric</td><td>D202-9089-0.4</td><td>0.4m lengte, lasergeleider tussen laser en roterende verbinding</td></tr><tr><td>pHelper</td><td>Stratagene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fotohardende tandheelkundige cement</td><td>3M</td><td>56846</td><td></td></tr><tr><td>Serafin klem</td><td>Stoelting</td><td>52120-43P</td><td></td></tr><tr><td>Afgeschermde kabel</td><td>mogami</td><td>W2780</td><td>Solderen naar 6-pin socket voor EEG/EMG opname</td></tr><tr><td>Slaapopnamekamer</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Op maat gemaakt (21 cm&times; 29 cm &times; 19 cm) met watertank houder</td></tr><tr><td>Slaap signaal software</td><td>KISSEI COMTEC</td><td>N/A</td><td>voor EEG/EMG analyse</td></tr><tr><td>Slip ring</td><td>neuroscience,inc</td><td>N/A</td><td>voor EEG/EMG analyse</td></tr><tr><td>Roestvrij schroef</td><td>Yamazaki</td><td>N/A</td><td>&phi;1.0 x 2.0</td></tr><tr><td>Roestvrij draad</td><td>Cooner wire</td><td>AS633</td><td>&nbsp;0.0130 inch diameter</td></tr><tr><td>Stereotaxic frame met digitaal console</td><td>Koph</td><td>N/A</td><td>Model 940</td></tr><tr><td>Spuitnaald</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>Vital recorder software</td><td>KISSEI COMTEC</td><td>N/A</td><td>voor EEG/EMG opname</td></tr></tbody></table>

optogenetische manipulatie van neurale circuits tijdens het monitoren van slaap/wakkerheid toestanden in muizen

Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice

In de afgelopen jaren, optogenetics is op grote schaal gebruikt in vele gebieden van neurowetenschappelijk onderzoek. In veel gevallen, een opsin, zoals kanaal rhodopsine 2 (ChR2), wordt uitgedrukt door een virus vector in een bepaald type van neuronale cellen in verschillende CRE-driver muizen. Activering van deze opsins wordt veroorzaakt door de toepassing van lichtflitsen die worden geleverd door laser of geleid door optische kabels, en het effect van activering wordt waargenomen met zeer hoge tijdresolutie. Experimenteurs zijn in staat om acuut neuronen te stimuleren tijdens het monitoren van gedrag of een andere fysiologische uitkomst bij muizen. Optogenetics kan nuttige strategieën om te evalueren van de functie van neuronale circuits in de regulering van de slaap/wakkerheid toestanden in muizen mogelijk te maken. Hier beschrijven we een techniek voor het onderzoeken van het effect van optogenetische manipulatie van neuronen met een specifieke chemische identiteit tijdens elektro-encefalogram (EEG) en electromyogram (EMG) monitoring om de slaap fase van muizen te evalueren. Als voorbeeld beschrijven we manipulatie van GABAergic neuronen in de bed kern van de Stria terminalis (BNST). Acute optogenetische excitatie van deze neuronen activeert een snelle overgang naar wakkerheid wanneer toegepast tijdens de NREM-slaap. Optogenetische manipulatie samen met EEG/EMG opname kan worden toegepast om te ontcijferen van de neuronale circuits die slaap/wakkerheid staten reguleren.

De huidige studie toonde het effect van optogenetische excitatie van GABABnst neuronen op slaaptoestand overgang. ChR2-EYFP werd focaal uitgedrukt in GABA neuronen in de BNST. Een in situ hybridisatie histochemische studie toonde aan dat ChR2-EYFP werd gelokaliseerd in neuronen die de GAD 67 mRNA signalen uitdrukken, wat aangeeft dat dit GABAergic neuronen zijn. Immunohistochemical slice samples bevestigden de positie van de optische vezel, waarvan de punt net boven de BNST<sup...

Hier beschrijven we methoden van optogenetische manipulatie van bepaalde soorten neuronen tijdens het monitoren van de slaap/wakkerheid toestanden in muizen, het presenteren van onze recente werk op de bed kern van de Stria terminalis als voorbeeld.

Optogenetische manipulatie van neurale circuits tijdens het monitoren van slaap/wakkerheid toestanden in muizen

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 ...

Deze procedure kan ons helpen bij het identificeren van de functie van specifieke neuro-circuit die betrokken zijn bij de slaap wakkerheid verordening met minder invasieve manipulatie en hoge temporele resolutie. Deze methode stelt ons in staat de monitoring oppervlak EEG in real time in combinatie met manipulatie van een specifieke neuro-circuit om de causale relatie tussen circuits en slaap wakkerheid staten te onderzoeken. Shota Kodani gaat de procedure demonstreren.Na bevestiging van een gebrek aan respons op teensnuifje, breng zalf aan op de ogen van het dier en gebruik de oorspen en neuspen op het stereotactische apparaat om het hoofd van de verdoofde muis op een absorberend pad te stabiliseren. Wanneer het hoofd is vastgesteld in positie, maak een mid-sagittale incisie in de hoofdhuid om te bevestigen dat de kruising tussen de sutura sagittalis en sutura coronalis of sutura lambdoidea zijn in een horizontale lijn op hetzelfde niveau. Om een positioneringsgat te voorkomen, stelt u de neussneus en de oorbalken zo nodig aan.Dan met behulp van serafin klemmen aan het houden van de huid open desinfecteren het blootgestelde oppervlak van de schedel om de craniale hechtingen te visualiseersen duidelijker. Om de adeno-geassocieerde virusvector te injecteren, laadt u een ethanol gesteriliseerd 10 milliliter spuit met twee microliter minerale olie, gevolgd door het experimentele volume van het virus te injecteren. Gebruik de microinjectiepomp om de punt van de microinjectienaald op de bregma aan te passen en noteer de coördinaten als punt van oorsprong.Verplaats vervolgens de punt naar de aangewezen injectieplaats en plaats de punt van de naald op de positie. Markeer de schedel op de injectieplaats en gebruik een tandboor uitgerust met een 0,7 millimeter carbidsnijder om een gat met een diameter van ongeveer twee millimeter in de schedel te boren. Na het verwijderen van bloed uit de buurt van het gat met een wattenstaafje, langzaam verplaatsen van de naald naar het bed kern van de stria terminalis of BSNT en langzaam injecteren van de aangewezen volume van het virus oplossing.Laat de naald vervolgens vijf minuten op zijn plaats staan om de oplossing voldoende te laten infiltreren in het BNST-weefsel voordat u de naald zorgvuldig intrekt. Voor elektro-encefalogram, of EEG, en elektromyogram, of EMG, elektrode implantatie, eerst soldeer twee roestvrijstalen draden waaruit een millimeter isolatie is ontdaan van beide uiteinden aan de EMG-elektroden en plaats het centrum van de elektroden op de bregma. Markeer vervolgens de positie voor elke EEG-elektrode.Om de positie van het optische vezelimplantaat te bepalen, bevestigt u een optische vezel ferrule aan de manipulator en draait u de manipulatorarm naar een plus- of min 30 graden hoek tegen een horizontale lijn. Zet de vezeltip op de bregma en leg de coördinaten vast. Verplaats de tip naar de beoogde invoeglijn en markeer de positie op de schedel en de positie voor de ankerschroef naast de invoegplaats.Gebruik de tandheelkundige boor om de schedel te boren op elke site en gebruik de manipulator om voorzichtig invoegen van de optische vezel totdat het boven de BNST. De ferrule moet rusten op de resterende schedel. Zet de vezel vast aan de schedel met een ankerschroef, waarbij u ervoor zorgt dat de dura niet wordt gebroken of weefsel wordt beschadigd.Bedek vervolgens de vezel en schroef met foto-geneesbaar tandcement. Boor vervolgens gaten voor EEG/EMG-elektroden en steek de punt van de eerste elektrode in één gat. Houd het implantaat met één hand vast, breng cyanoacrylaatlijm aan op de ruimte tussen de schedel en de elektrode en steek de elektrode de rest van de weg in, waarbij ervoor wordt gezorgd dat er geen weefsel wordt beschadigd.Wanneer alle elektroden zijn geplaatst, bedek dan de omtrek van de elektroden en de optische vezels met extra cyanoacrylaatlijm en cyanoacrylaatversneller om te voorkomen dat er onderbrekingen in de ferrule tot optische kabel en elektrode naar looddraad verbindingszones. Stel nu de nekspieren bloot en steek de draden voor de EMG-elektrode onder de spier. Pas de lengte van de EMG-elektrode zo aan dat deze net onder de nuchal-spieren past en vul de implantaten met meer cyanoacrylaatlijm en brandversneller.Plaats vervolgens de muis op een warmtekussen met controle tot volledige recompensy. Voor EEG/EMG monitoring tijdens de foto-excitatie van gerichte neuronen, eerst gebruik maken van een scalar om de laser intensiteit aan te passen en gebruik een ferrule om de punt van de laserkabel tether aan een ongebruikte optische vezel. Bevestig dat er geen ruimte is op de kruising tussen de vezel en de kabel.Na 20 minuten, stoot de opgewarmde laser aan de intensiteitscontrole uit en pas de intensiteit aan 10 milliwatt per millimeter kwadraat. Stel de lichtpulsduur in op 10 milliseconden, de rusttijd op 40 milliseconden, de cyclus op 20 en de herhaling op 20. Verander de lasermodus in transistorlogica en bevestig dat lichtpulsen worden uitgezonden door de vezel die wordt aangestuurd door de patroonregelaar.Sluit de geïmplanteerde elektrode en kabeladapter aan en bedek de verbinding met licht ondoordringbaar materiaal om laserlekkage te voorkomen. En wanneer de laser klaar is, verplaats de muizen naar de experimentele kamer voor EEG / EMG opname. Om de latentie te beoordelen op wakkerheid van niet-snelle oogbeweging of snelle oogbeweging slaap, beperk de opnametijd en geoptimaliseerde site tijd winnen en laat de muizen vrij bewegen in de experimentele kamer voor ten minste een uur.Tijdens de experimentele periode, monitor de EEG en EMG signalen in hetzelfde opnamescherm. Evalueer de toestand van de muis als wakkerheid, niet-snelle slaap van oogbewegingen of snelle slaap van oogbewegingen met behulp van de gain control voor elke golf voor het gemak van het onderscheiden van elke toestand. Voor het meten van de niet-snelle slaap van de oogbeweging naar wakkerheid latentie, observeren stabiele niet-snelle oogbeweging slaap gedurende 40 seconden, zet dan de patroon generator voor foto stimulatie en bevestigen laser emissie aan de geïmplanteerde optische vezels.Neem vervolgens de EEG/EMG-signalen op totdat de slaaptoestand verandert in wakkerheid. Hier vertegenwoordigde EEG/EMG worden de sporen vóór en na fotostimulatie tijdens niet snelle slaap van de oogbeweging getoond. Een hoge spanning en langzame frequentie EEG zonder EMG signalen, vertegenwoordigt niet snelle oogbeweging slaap.Foto stimulatie leidde tot een acute overgang naar wakkerheid ongeveer twee seconden na stimulatie in channelrhodopsine-2 uitdrukken muizen, terwijl de controle muizen niet aantonen deze overgang, wat suggereert dat de opwinding van BNST GABA neuronen tijdens niet-snelle oogbeweging slaap triggers een snelle inductie van wakkerheid. Omgekeerd, foto stimulatie tijdens snelle oogbeweging slaap had geen effect, zodat een overgangseffect alleen ontstaan in niet-snelle oogbeweging slaap. Het is belangrijk om te zorgen voor nauwkeurige coördinaties voor de virusinjectie en optische vezel implantatie stappen.De EEG/EMG sporen die tijdens de slaapanalyse zijn vastgelegd, kunnen worden gebruikt om de gevolgen van de fotomanipulatie op de verschillende waakzame toestanden bij muizen te beoordelen. Deze techniek zal ons ook helpen bij het identificeren van andere componenten en circuits die betrokken zijn bij het reguleren van de slaap wakkerheid staten. Gebruik een veiligheidsbril om laserschade aan het oog te voorkomen en zorg ervoor dat u de adeno-geassocieerde virusvector container na gebruik altijd autoclave steriliseert.

optogenetic-manipulation-neural-circuits-during-monitoring

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een procedure beschreven voor het manipuleren van de activiteit van cerebrale corticale piramidale neuronen optogenetically terwijl de elektro, elektromyogram en cerebrale lactaatconcentratie bewaakt. Experimentele opnamen worden uitgevoerd op kabel-tethered muizen, terwijl ze ondergaan spontane slaap / waak cyclus. Optogenetic apparatuur geassembleerd in ons laboratorium controleapparaat handel verkrijgbaar.

Gelijktijdig Elektro, Real-time meting van lactaatconcentratie en Optogenetic Manipulatie van neuronale activiteit in de Rodent Cerebral Cortex

Source: Kodani, S., et.al. Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the optogenetic manipulation of neural circuits involved in the sleep-to-wakefulness transition in mice. The procedure involves surgically implanting an optic fiber and electrodes into the brain and muscles to enable light stimulation and electrophysiological recording. By delivering light to activate light-sensitive cation...

Optogenetic Manipulation of Neural Circuits for the Sleep-to-Wakefulness Transition in Mice

This video demonstrates a protocol to modulate theta oscillations in a genetically engineered mouse model with light-sensitive ion channels in its GABAergic medial septum neurons. By delivering light pulses to the hippocampus, the protocol aims to synchronize neuronal activity and generate theta oscillations, which are recorded as local field potentials.

Selective Manipulation of Theta Oscillations in a Mouse Model

De recente ontwikkeling van de neurowetenschappen tools die genetica en optica combineren, aangeduid als "optogenetics", stelt de controle over neurale circuit activiteit met een ongekend niveau van ruimtelijke en temporele resolutie. Hier bieden wij een protocol voor de integratie in vivo opnemen met optogenetic manipulatie van genetisch gedefinieerde subsets van de prefrontale cortex en subicular piramidale neuronen.

Een methode voor High Fidelity optogenetic controle van individuele piramidale neuronen<em&gt; In vivo</em

De registratie van elektro-encefalogram (EEG) en elektromyogram (EMG) bij muizen die zich vrij kunnen bewegen, is een cruciale stap om gedrag en fysiologie te correleren met slaap en waakzaamheid. Het experimentele protocol dat hier wordt beschreven, biedt een kabelgebaseerd systeem voor het verkrijgen van EEG- en EMG-opnamen bij muizen.

Huisstijlen Opname Procedure voor het meten van de Slaap in Muizen

Hier presenteren we experimentele en analytische procedures om de temporale dynamiek van de neurale en hartvariabelen van niet-REM slaap in muizen te beschrijven, die de respons op slaapresponsen voor akoestische stimuli moduleren.

Quantum Infra-slow Dynamics of Spectral Power en Heart Rate in slaapmuizen

We beschrijven het gebruik van optogenetics en elektrofysiologische opnames voor selectieve manipulaties van hippocampal theta oscillaties (5-10 Hz) in gedragend muizen. De werkzaamheid van de entrainment ritme wordt gecontroleerd met behulp van lokale veld potentieel. Een combinatie van opto- en Farmacogenetische inhibitie adressen de efferent uitlezing van hippocampal synchronisatie.

Optogenetic meevoeren van Hippocampal Theta oscillaties in het gedrag van muizen

Beschrijven we een hoge-doorvoer-methode voor het meten van de slaap door middel van activiteiten gebaseerde home-kooi bewaking. Deze methode biedt voordelen ten opzichte van traditionele EEG gebaseerde methoden. Het kan is goed gevalideerd voor de bepaling van de totale slaap duur en een krachtig hulpmiddel voor de monitoring van de slaap in knaagdier modellen van ziekten bij de mens.

Noninvasive, High-throughput bepaling van de duur van de slaap in knaagdieren

Dit werk introduceert een methode voor het uitvoeren van een optogenetic single-eenheid betrouwbaar opnemen vanaf een wakker muis met behulp van een op maat gemaakte glazen optrode.

Optogenetics identificatie van een neuronale Type met een glazen Optrode in wakker muizen

Met optogenetische manipulatie van specifieke neuronale populaties of hersengebieden kan gedrag worden gewijzigd met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie bij vrij bewegende dieren. Door het gebruik van verschillende optogenetische tools in combinatie met chronisch geïmplanteerde optische vezels, kan een verscheidenheid aan neuronale modulaties en gedragstesten worden uitgevoerd.

Optogenetische manipulatie van neuronale activiteit om gedrag te moduleren in vrij bewegende muizen

Dit artikel beschrijft een protocol voor de manipulatie van moleculaire doelen in de hersenschors met behulp van adeno-geassocieerde virussen en voor het monitoren van de effecten van deze manipulatie tijdens wakkerheid en slaap met behulp van elektrocorticografische opnames.

Elektrocorticografische opname van hersenschorsgebieden gemanipuleerd met behulp van een Adeno-geassocieerd virus gericht op cofilin bij muizen

Leer optogenetische manipulatie van neurale circuits bij muizen met real-time EEG/EMG-monitoringsmethoden. Deze techniek onderzoekt de causale relaties tussen BNST-neuronen en slaap-waaktransities.

Optogenetische manipulatie van neurale circuits tijdens het monitoren van slaap/wakkerheid toestanden in muizen

Meer video's verkennen