Absorberend Microbiopsy bemonsterings- en RNA extractie voor minimaal invasieve, gelijktijdige bloed en huid analyse

Deze methode kan de oprichting van biomarkers voor huidziekten vergemakkelijken en ook het risico voor deelnemers aan klinisch onderzoek verminderen. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het geen intensieve training vereist en geen littekens achterlaat. Vijf minuten voor de microbiopsie, plaats een lege twee milliliter centrifuge buis op droog ijs gedurende vijf minuten.

Het dragen van wegwerphandschoenen, spray de handen en gereedschappen met 70% ethanol voor het ontsmetten van de applicatie site op het onderwerp met een alcohol doekje. Verwijder de microbiopsie uit het gesteriliseerde gammastralingpakket zonder de microneedle aan te raken en trek de zuiger totdat een klik wordt gehoord en de zuiger op zijn plaats vergrendelt. Richt het geladen apparaat in een ongeveer loodrechte hoek op de te bemonsteren huid, zorg ervoor dat het bemonsteringsgebied zich in een vaste positie bevindt en breng het apparaat binnen ten minste één kilogram kracht op de huid aan.

Druk vervolgens op de trekker en houd het apparaat minstens tien seconden op zijn plaats. Als het apparaat wordt vrijgegeven vóór tien seconden, is er een hogere kans op variatie in de bloedabsorptie en ook de daaropvolgende analyse. Wanneer het monster is geabsorbeerd, trek voorzichtig de zuiger en absorberende microneedle uit de behuizing en gebruik steriele tangen te trekken op de twee gaten van de microneedle om het te verwijderen uit de zuiger.

Voeg 50 microliter extractiebuffer aan de buis toe op droogijs en plaats de intacte microneedle in de buis op de droge ijsnaald naar beneden. Zorg ervoor dat de punt van de microneedle niets aanraakt tijdens het verwijderingsproces. Vortex de buis gedurende drie tot vijf seconden om wat bemonsterd materiaal te verzamelen van de microneedle tip en de buis in een warmteblok of waterbad gedurende 30 minuten bij 42 graden Celsius uit te broeden.

Gebruik aan het einde van de incubatie steriele tangen om de achterkant van het microneedleniveau met de bovenrand van de microfugebuis te plaatsen en het deksel van de buis zodanig te sluiten dat de bovenkant van het microneedle tussen de dop en de buis wordt gehouden. Centrifugeer de buis om het bemonsterde materiaal uit de absorberende laag van het apparaat te verzamelen en gebruik de tangen om de microneedle zorgvuldig te verwijderen zonder de punt terug in de bufferoplossing te dompelen. Centrifuge het monster opnieuw en breng het supernatant voorzichtig over in een nieuwe microcentrifugebuis.

Voeg vervolgens 250 microliters conditioneringsbuffer toe aan een filtermembraan van een zuiveringskolom voor een incubatie van vijf minuten bij kamertemperatuur en verdun de buffer door centrifugatie. Voeg 50 microliter van 70% ethanol toe aan het geëxtraheerde RNA-monster met zachte menging en breng het mengsel over in de geconditioneerde zuiveringskolom. Onmiddellijk centrifugeren de buis twee keer om de flow-through te verwijderen, gevolgd door een wasbeurt in honderd microliters van wasbuffer een.

Voor DNA-vertering, voeg 40 microliters van vers bereide DNAs incubatiemix direct op de zuivering kolom membraan voor een 15 minuten incubatie bij kamertemperatuur, gevolgd door een wasbeurt met 40 microliter van wasbuffer een. Aan het einde van de centrifugatie, was de kolom met 100 microliters van wasbuffer twee en controleer de zuiveringskolom voor eventuele resterende wasbuffer. Breng de zuiveringskolom over in een 0,5 milliliter microcentrifugebuis in de RNA-extractiekit en plaats de punt van de pipet direct op het membraan van de zuiveringskolom om 11 microliter RNA-sPRE-water aan de kolom toe te voegen.

Na een incubatie van twee minuten bij kamertemperatuur, centrifugeer de kolom een keer om het RNA sPRE water te verdelen door de kolom, en een keer om het RNA te ontwijken. Bewaar vervolgens het totale RNA-monster op min 80 graden Celsius als de cDNA-synthese niet onmiddellijk wordt uitgevoerd. De absorberende microbiopsie microneedle bestaat uit twee lagen stalen plaat met een absorberende laag ertussen voor gelijktijdige bemonstering van de huid en het bloed.

Het gebruik van een absorberende microbiopsie veroorzaakt slechts kleine erythema, dat is niet merkbaar na 48 uur. Na punctie worden een paar kleine stukjes huid gevangen in de buurt van het puntje van de microneedle en wordt bloed opgenomen in het filterpapier. Wanneer het absorberende microneedle onmiddellijk na punctie wordt verwijderd, is het monstervolume en de daaropvolgende hoeveelheid geëxtraheerd mRNA aanzienlijk lager dan die verkregen na het vasthouden gedurende tien seconden na punctie.

Vergelijkbare niveaus van huidmarkeringsexpressie worden gedetecteerd na het gebruik van absorberende microbiopsie en zijn voorganger huidmicrobiopsie door kwantitatieve PCR-analyse. Maar een aanzienlijk hoger niveau van witte bloedcel bio marker expressie wordt gedetecteerd na absorberende microbiopsie bemonstering, wat suggereert dat de absorberende microbiopsie microneedle presteert beter voor de bloedafname met behoud van dezelfde capaciteit voor het vangen van huidmonster als bij de huid microbiopsie. Dus tijdens het toepassen van de techniek, is het cruciaal om te onthouden dat het toepassen van het apparaat volgens wat we voorstellen essentieel is voor het verkrijgen van betrouwbare resultaten.

Dus na deze procedure kunnen andere methoden, zoals real-time PCR, worden gevolgd voor relatief genexpressie profilering. Hoewel we het apparaat nog steeds ontwikkelen, zijn we ervan overtuigd dat de techniek de weg heeft vrijgemaakt voor klinisch onderzoek voor het uitvoeren van bemonstering, voor dermatologische cosmetische of pediatrische toepassing omdat het gewoon zo eenvoudig is en minimaal invasief.