Detectie van een circulerende MicroRNA Custom Panel bij patiënten met uitgezaaide darmkanker
14 maart 2019
Presenteren we een protocol om te evalueren van de expressie niveaus van circulerende microRNA (miRNAs) in plasma monsters van kankerpatiënten. In het bijzonder, hebben we gebruikt een verkrijgbare kit voor circulerende miRNA extractie en omgekeerde transcriptie. Ten slotte, geanalyseerd wij een panel van 24 geselecteerde miRNAs met behulp van real-time vooraf gevlekte sonde aangepaste platen.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van translationeel onderzoek, zoals de relatie tussen circulerende biomarkers en de patiëntenprognose. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de kans om de expressie van een paneel van circulerende biomarkers te evalueren met een eenvoudige en betrouwbare methodologie met een lage hoeveelheid inputmateriaal. De implicaties van deze techniek uit te breiden tot therapie van kankerpatiënten, omdat het kon identificeren circulerende biomarkers nuttig in de besluitvorming en behandeling monitoring van patiënten.
Ook kan deze methode inzicht geven in circulerende biomarkers analyse. Het kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals weefsel biomarker expressie analyse voor moleculaire karakterisering van de ziekte. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang, omdat de extractiestappen moeilijk te leren zijn.
Om te beginnen, breng 400 microliter van het plasmamonster over in een RNase-vrije, twee milliliter buis. Voeg vervolgens 400 microliter denatureringsoplossing toe aan de buis. Voeg vier microliters van een nanomolar spike-in.
Voeg na het mengen van de oplossing 800 microliter zuurfenol-chloroform toe. Vortex de oplossing voor 60 seconden, en centrifuge op maximale snelheid gedurende 15 minuten. Breng vervolgens het lysaat in de bovenste waterige fase over naar een schone buis, waarbij u ervoor zorgt dat de interfase niet wordt verstoord.
Meet het volume van de waterige fase hersteld, en voeg 1/3 volume ethanol aan het lysaat. Plaats vervolgens een filtercartridge in een verse opvangbuis. Breng tot 700 microliter van het ethanollysaatmengsel over naar de filtercartridge.
Centrifugeren de filtercartridge gedurende 30 seconden bij 10.000 keer zwaartekracht. Meet vervolgens het totale volume van de doorstroom. Voeg vervolgens 2/3 van het volume ethanol toe aan het filtraat en meng goed.
Plaats een tweede filtercartridge in een verse opvangbuis. Breng vervolgens tot 700 microliter van het monster over naar de cartridge en vercentrifuge 30 seconden bij 10.000 keer zwaartekracht voordat de flow-through wordt weggegooid. Voeg 700 microliter micropleters microRNA-wasoplossing toe aan de filtercartridge en vercentrifuger deze met een opvangbuis bij 10.000 keer zwaartekracht gedurende 15 seconden.
Gooi de doorstroom weg en plaats de filtercartridge weer in dezelfde buis. Verplaats hierna de filtercartridge naar een nieuwe opvangbuis. Voeg vervolgens 100 microliters voorverwarmde elutieoplossing toe aan de cartridge.
Centrifugeren de filtercartridge op 10.000 keer zwaartekracht gedurende 30 seconden om de microRNAs te herstellen. Bereid de polyadenylation reactie mix cocktail volgens het tekstprotocol. Breng twee microliter van het monster over naar elke put van een reactieplaat.
Voeg vervolgens drie microliters van de reactiecocktail toe aan elke put. Vortex en centrifugeren de plaat kort om de inhoud te draaien. Plaats vervolgens de plaat in een thermische cycler en volg de procedure die in het tekstprotocol wordt beschreven.
Bereid de ligatiereactiemixcocktail in een centrifugebuis. Voeg vervolgens 10 microliter van de cocktail toe aan elke put van de reactieplaat. Meng vervolgens gedurende een minuut de inhoud van de reactieplaat op een shaker bij 1, 900 tpm, gevolgd door een korte centrifuge van de plaat.
Plaats hierna de reactieplaat in een thermische cycler en volg de procedure die in het tekstprotocol wordt beschreven. Om de omgekeerde transcriptiereactie uit te voeren, bereidt u de reactiemix voor in een centrifugebuis volgens het tekstprotocol. Voeg vervolgens 15 microliter van het mengsel toe aan elke put van de plaat die ligatieproduct bevat.
Meng de inhoud van de plaat op een shaker bij 1, 900 rpm gedurende een minuut, gevolgd door een korte centrifuge van de plaat. Plaats vervolgens de plaat in een thermische cycler en volg de procedure die in het tekstprotocol wordt beschreven. Bereid vervolgens de miR-Amp-reactiemix voor en voeg 45 microliter van de mix toe aan elke put van een nieuwe reactieplaat.
Voeg hierna vijf microliter van het RT-product toe aan elke put van de reactieplaat. Meng de plaat op een shaker bij 1, 900 rpm gedurende een minuut, gevolgd door een korte centrifuge van de plaat. Plaats vervolgens de plaat in een thermische cycler en volg de procedure die in tabel een van het tekstprotocol wordt beschreven.
Verdun eerst elk cDNA-monster in DE-buffer. Bereid vervolgens de PCR-reactiemix in een centrifugebuis. 10% van het volume te veel toe te voegen.
Breng 19 microliter van de reactiemix over op elke put van de plaat. Sluit de plaat af en vercentrifuge het kort. Ten slotte voert u het thermische protocol uit op een RT-PCR-systeem, zoals beschreven in tabel twee van het tekstprotocol.
Seriële verdunningen van spike-in controle werden uitgevoerd om te kiezen welke was de beste concentratie toe te voegen in alle plasma monsters van deze specifieke case serie. Dankzij dit protocol was het mogelijk om alle biomarkers bij elke patiënt te evalueren, evenals een enkele biomarker in de algemene caseserie. In dit protocol werd een panel van angiogenesegerelateerde circulerende miRNAs met betrekking tot progressievrije overleving, algehele overleving en objectieve respons geanalyseerd bij patiënten met colorectale kanker die met een chemotherapieregime werden behandeld.
Door de expressieniveaus van miRNA tussen baseline en eerste klinische evaluatie te vergelijken, werd een toename van has-miR-155-5p waargenomen. Deze stijging ging gepaard met kortere PFS en OS. Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om de stappen uit te voeren met behulp van fenol-chloroform onder een rookkap. Na deze procedure kunnen andere methoden worden toegepast, zoals isolatie en analyse van circulerende eiwitten of coderings-RNAs om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de evaluatie van een meer uitputtend panel van circulerende biomarkers.
Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van vloeibare biopsie om de expressie van circulerende biomarkers bij kankerpatiënten te onderzoeken. Vergeet niet dat het werken met bloed en chemische reagentia zeer gevaarlijk kan zijn, en voorzorgsmaatregelen zoals handschoenen en laboratoriumjas moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het evalueren van expressieniveaus van circulerend microRNA (miRNA) in plasmaproeven van kankerpatiënten. De techniek maakt gebruik van een commercieel beschikbare kit voor miRNA-extractie en reverse transcriptie, gevolgd door de analyse van een panel van 24 geselecteerde miRNA's.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Biomarkers
- Kankeronderzoek
Achtergrond
- Circulerende biomarkers kunnen inzicht bieden in de prognose van de patiënt.
- Het evalueren van miRNA-niveaus kan helpen bij het nemen van beslissingen over de behandeling.
- De methodologie maakt analyse mogelijk met een minimale hoeveelheid inputmateriaal.
- Visuele demonstraties zijn essentieel voor het begrijpen van het extractieproces.
Doel van de studie
- Om de expressie van circulerende miRNA's bij kankerpatiënten te beoordelen.
- Om potentiële biomarkers te identificeren voor het monitoren van de behandeling.
- Om het begrip van de relatie tussen biomarkers en prognose te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Extractie van circulerende miRNA's uit plasmaproeven.
- Reverse transcriptie van geëxtraheerde miRNA's.
- Analyse van een panel van 24 geselecteerde miRNA's.
- Gebruik van real-time pre-spotted probe custom plates.
Belangrijkste resultaten
- De methode levert betrouwbare resultaten op met een lage hoeveelheid inputmateriaal.
- Het maakt de gelijktijdige evaluatie van meerdere circulerende biomarkers mogelijk.
- De verkregen inzichten kunnen worden gebruikt voor behandelmonitoring en besluitvorming.
- Potentiële toepassingen strekken zich uit tot de analyse van weefselbiomarkers.
Conclusies
- Deze techniek is waardevol voor translationeel onderzoek naar kanker.
- Het kan leiden tot verbeterde patiëntenuitkomsten door een betere identificatie van biomarkers.
- Visuele hulpmiddelen zijn essentieel voor het beheersen van de extractiemethodologie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Liquid biopsy-benaderingen met gebruik van circulerende microRNA's bieden een minimaal invasieve strategie voor het monitoren van de progressie van gemetastaseerd colorectaal carcinoom en de therapeutische respons. Deze methode maakt een kwantitatieve beoordeling van biomarker-panels mogelijk vanuit beperkte plasmavolumes, wat bijdraagt aan de vroege detectie van resistentiemechanismen en helpt bij het informeren van aanpassingen in de behandeling. Door reproduceerbare, kwantitatieve miRNA-expressiegegevens te leveren, draagt deze techniek bij aan besluitvorming op basis van biomarkers bij de ontwikkeling van oncologische geneesmiddelen en het ontwerp van klinische studies.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de dynamiek van circulerende biomarkers te onderzoeken ter ondersteuning van hypothesevorming bij angiogenese-gerelateerde pathways.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerde workflow voor de extractie en kwantificering van miRNA uit plasma, waardoor de variabiliteit bij vroege biomarker-screening wordt verminderd.
Screening & assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de bereiding van gevalideerde plasmaproeven voor downstream qRT-PCR-analyse van multi-miRNA-panels.
- Operationele waarde: Ondersteunt assay-standaardisatie via gedefinieerde extractie-, retrotranscriptie- en normalisatiestappen met behulp van GeNorm- en Expression Suite-software.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Koppelt veranderingen in de expressie van circulerende miRNA (bijv. hsa-miR-155-5p) aan klinische uitkomsten, zoals progressievrije overleving en totale overleving, wat evaluatie van prognostische biomarkers mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Vestigt een technisch robuuste methode die geschikt is voor longitudinale monitoring in preklinische en klinische studies.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm door biomarkeranalyse mogelijk te maken die informatie verschaft voor targetvalidatie, assay-gereedheid en translationele overbrugging van ontdekking naar preklinische validatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing met betrekking tot de rol van circulerende miRNA's bij kankerprogressie en therapeutische respons.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten uit plasmaproeven, wat een betrouwbare beoordeling van het effect van verbindingen of biomarkers mogelijk maakt.
- Analytics: Genereert genormaliseerde expressiegegevens die geschikt zijn voor statistische analyse en correlatie met klinische eindpunten.
- Translationeel onderzoek: Verbindt moleculaire metingen met patiëntuitkomsten, ter ondersteuning van beslissingen over risico-gecorrigeerde voortgang.
- Enterprise hergebruik: Vormt een herbruikbaar platform voor de analyse van circulerende biomarkers over meerdere oncologische indicaties.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in biomarker-ziekterelaties door middel van kwantitatieve, reproduceerbare metingen.
- Operationele waarde: Levert een workflow met een lage input en een hoge technische robuustheid, geschikt voor high-throughput biomarker-screening.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege identificatie van prognostische biomarkers die gekoppeld zijn aan overlevingsuitkomsten mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van therapeutische kandidaten op basis van biomarkermodulatie en klinische correlatie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in RNA-handling en qRT-PCR om degradatie te voorkomen en nauwkeurige kwantificering te waarborgen.
- Is afhankelijk van toegang tot fenol-chloroformextractiesystemen, thermocyclers en real-time PCR-instrumentatie.
- Necessiteert standaardisatie van extractie- en normalisatieprotocollen tussen teams voor reproduceerbare resultaten over verschillende locaties.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij het toepassen van de methode op verschillende typen biofluïda of ziektemodellen.
- Bevat praktische beperkingen met betrekking tot de omgang met gevaarlijke reagentia en de noodzaak van het gebruik van een zuurkast tijdens de fenol-chloroformstappen.
