Een Rat Methyl-Seq Platform om epigenetische veranderingen Associated with Stress Exposure te identificeren

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van epigenomics door aan te tonen hoe een op sequencing gebaseerd instrument te ontwerpen en te implementeren om de impact van omgevingsfactoren op DNA-methylatie te beoordelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een meer uitgebreide en kwantitatieve methode kan bieden om DNA-methylatieniveaus te beoordelen in vergelijking met arraygebaseerde platforms. De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot de identificatie van DNA-methylatieveranderingen als gevolg van verschillende soorten fysiologische processen in elk organisme waarvan de sequentiegegevens beschikbaar zijn.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in de impact van stress op DNA-methylatie, kan het ook worden toegepast op andere omgevingsfactoren of fysiologische aandoeningen, zoals de blootstelling aan milieutoxicanten in vetrijke voeding en aandoeningen zoals diabetes en hart- en vaatziekten. Na het scheren van DNA en het verifiëren van de grootte via bioanalyzer, voeg 180 microliters van DNA-bindende magnetische kralen aan elk monster, en incubeer bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Pellet de kralen op een magnetische plaat, en verwijder de supernatant.

Resuspend de pellet in 200 microliters van 70% ethanol. Gebruik vervolgens een magnetische plaat om de kralen te pelleteren en zoveel mogelijk ethanol te verwijderen. Droog de kralen in een hitteblok op 37 graden Celsius gedurende drie tot vijf minuten.

Dan, resuspend de pellet in 44 microliters van nuclease-vrij water, en verzamel ongeveer 42 microliter van de supernatant. Na het ligateren van de adapters en het verifiëren van ligatie via bioanalyzer, breng de monsters over naar lage DNA-bindende microcentrifugebuizen. Gebruik vervolgens een verwarmde vacuümconcentrator om het monstervolume onder de 3,4 microliter te verminderen.

Voeg hierna 5,6 microliter methyl-Seq-blokmix toe aan elk monster en broed ze uit in een thermische cycler. Maak De hybridisatiemix van capture library voor volgens het tekstprotocol. Voeg vervolgens 20 microliter van Capture Library Hybridization Mix toe aan elk monster en broed gedurende 16 uur uit op 65 graden Celsius.

Bereid tegen het einde van de incubatietijd streptavidin magnetische kralen voor door 50 microliter streptavidin magnetische kralen per monster toe te voegen aan een nieuwe achtputige stripbuis. Was de kralen met 200 microliter methyl-Seq Binding Buffer. Plaats de stripbuis op een magnetische plaat en verwijder de supernatant uit de kralen.

Vervolgens, resuspend de kralen in 200 microliters van Methyl-Seq Binding Buffer. Voeg de monsters toe aan de gewassen streptavidin kralen en broed ze 30 minuten op kamertemperatuur op een roterende mixer. Terwijl de monsters mengen, aliquot 200 microliters van Methyl-Seq Wash Buffer Twee in drievoudige putten van een 96-put plaat en pre-warm tot 65 graden Celsius.

Na de monsters incubeer, pellet de magnetische kralen met een magnetische plaat en verwijder de supernatant. Dan, resuspend de kralen in 200 microliters van Methyl-Seq Wash Buffer One. Broed de kralen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en gebruik een magnetische plaat om de supernatant te verwijderen.

Daarna, resuspend de kraal pellet in 200 microliters van voorverwarmde Wash Buffer Two. Vervolgens, incubeer de kralen in een thermische cycler alvorens een magnetische plaat om de kralen pellet. Voeg 20 microliter methyl-Seq Elution Buffer toe aan de gewassen kralen en broed ze 20 minuten op kamertemperatuur.

Gebruik een magnetische plaat om de kralen pellet, en breng de supernatant naar een nieuwe strip buis. Voeg eerst 130 microliter bisulfieconversiereagereagereageagentia toe aan het eerder verzamelde supernatant. Verdeel de 150-microliter reacties even in twee putten.

Vervolgens, inculbateren van de reacties in een thermische cycler. Gebruik 600 microliters bindingsbuffer om de monsters aan de draaikolommen te binden en de kolommen te wassen met 100 microliter van Wash Buffer. Vervolgens centrifugeren de kolommen, en gooi de flow-through.

Voeg hierna 200 microliters van Desulfonatiebuffer toe aan de kolommen. Broed de kolommen 15 tot 20 minuten bij kamertemperatuur. Was de kolommen twee keer met 200 microliters van Wash Buffer.

Voeg vervolgens 10 microliter elutionbuffer toe aan de kolom. Incubeer bij kamertemperatuur, en centrifuge. Bereid de PCR-reactiemastermix volgens het tekstprotocol voor.

Voeg vervolgens 82 microliter van de mastermix toe aan elk monster en ontcubeer de monsters in een thermische cycler. Bereid eerst de PCR Master Mix Two op ijs volgens het tekstprotocol. Voeg vervolgens aan elk monster 25,5 microliter PCR Master Mix Two en vijf microliter commerciële indexeringsprimeren toe en ontcunet de monsters in een thermische cycler.

Beoordeel de DNA-concentratie van de monsters met zeer gevoelige DNA-detectiereagentia op een bioanalyzer. De Methyl-Seq bibliotheken worden vervolgens ingediend voor sequencing op de volgende generatie sequencer. Na bisulfite converteren en PCR versterken validatie monsters, bereiden een master mix met Binding Buffer, water, en streptavidin-gecoate sepharose kralen.

Voeg vervolgens 75 microliter van de mastermix en vijf microliter van het geneste PCR-product toe aan een 96-putplaat en schud de plaat 15 tot 60 minuten op een plaatshaker. Terwijl de plaat schudt, voeg 12 microliter primer aan de putten van een pyrosequencing testplaat. Na het schudden plaatst u een vacuümgereedschap in een met water gevulde trog en plaats het gereedschap vervolgens met bindende reacties in de plaat.

Vervolgens dompel het vacuümgereedschap onder in halfgevulde troggen met 70% ethanol, natriumhydroxide en Tris-acetaatbuffer. Koppel het vacuüm los en plaats het vacuümgereedschap in de HS pyrosequencing-testplaat om de kralen over te brengen. Plaats de plaat op een warmteblok, en incubeer op 80 graden Celsius gedurende twee minuten.

Laat ten slotte de plaat vijf minuten afkoelen voordat u met het pyro-programma begint. In dit protocol, analyse van de Methyl-Seq bibliotheken op voorwaarde dat een gerangschikte lijst van gedifferentieerd methylated regio's, of DMRs, tussen gestreste en niet-belaste dieren en een grafisch perceel van de DMRs. Validatie via bisulfite pyrosequencing bleek dat de gestreste dieren alle tentoongesteld hogere methylatieniveaus in alle Cp's dan de onbekwaam dieren.

Methylatieniveaus bij CpG 10 werden ook vergeleken met de gemiddelde drie weken durende CORT-niveaus voor elk dier. De resultaten geven aan dat er een bescheiden correlatie is tussen de endocriene en methylatiegegevens. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om de toename van de gemiddelde DNA-grootte tussen DNA-afschuif- en adapterligatiestappen te vergelijken en om voldoende bibliotheekhoeveelheid te garanderen voorafgaand aan sequencing.

Na deze procedure kunnen andere soortgelijke benaderingen worden toegepast om nieuwe vragen te beantwoorden, zoals de impact van milieutoxicanten op de neuroontwikkeling van ratten. Na de ontwikkeling ervan, deze techniek de middelen voor onderzoekers op het gebied van epigenetica om genoom-brede DNA-methylatie veranderingen in een niet-model of model organismen waar genomische sequenties beschikbaar zijn te verkennen. Vergeet niet dat het werken met de temperatuurgevoelige enzymen opslag op ijs vereist tijdens het gebruik en opslag in de min 20-graden vriezer.

De RNA-kralen die worden gebruikt voor het vastleggen van het doel vereisen ontdooien en opslaan op ijs tijdens gebruik en langdurige opslag in de min 80-graden vriezer.