Meting van de kracht-gevoelige eiwitten Dynamics in levende cellen met behulp van een combinatie van Fluorescent technieken

Deze methode kan belangrijke vragen op het gebied van mechanobiologie beantwoorden, zoals hoe krachten worden overgedragen en waargenomen in cellen en tussen cellen en hun omgeving. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het toegang geeft tot de moleculaire schaal informatie over hoe eiwitten reageren op mechanische krachten binnen de inheemse context van de levende cel. Hoewel deze methode specifiek is toegepast op het bestuderen van het focale eiwit vinculin, kan het ook worden toegepast op andere mechanisch gevoelige eiwitten, zoals talin, cadherinen of nesprin.

Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang, omdat een goede beeldvormingsopstelling moeilijk is, maar noodzakelijk voor het succes van de analyse. Begin deze procedure met stabiele expressie van de spanningssensor die in het gewenste celtype is gebouwd, zoals beschreven in het tekstprotocol. Om substraten te bereiden voor celzaaien, verwerven vier 35 millimeter glazen bodem schotels.

Werken in een cel cultuur kap, in een 15 milliliter conische buis, maken vier milliliter van 10 microgram per milliliter fibronectin in steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing, of PBS. Draai de buis voorzichtig om om te mengen en laat de oplossing vijf minuten in de celkweekkap zitten. Dan pipette een milliliter fibronectin oplossing op elke glazen bodem schotel.

Laat de fibronectin-oplossing een uur op kamertemperatuur of 's nachts op vier graden Celsius op de borden. Spoel vervolgens de fibronectin-oplossing aan en spoel één keer met PBS. Laat een milliliter PBS op de borden tot de cellen klaar zijn voor het zaaien.

Na het tellen van de cellen, zaad 30,000 cellen op elke fibronectin-gecoate glazen schotel met de juiste volledige media voor een eindvolume van 1,5 milliliter. Laat de cellen zich na het zaaien vier uur lang verspreiden. Na twee uur van de verspreiding, aspirate de groei media en spoel een keer met imaging media.

Laat 1,5 milliliter van de beeldmedia achter. Warm de microscoop op zoals beschreven in het tekstprotocol voordat u begint met kalibreren. Open eerst het laserconfiguratievenster om de FRAP-laser te kalibreren.

Stel de verlichtingsinstelling in op de juiste FRAP-verlichtingsinstellingen voor laserblootstelling aan het monster. Stel vervolgens de verlichtingsinstelling in op de verlichtingsinstellingen die geschikt zijn voor het beeldvorming van alleen de acceptorfluorfluorofoof. Selecteer de doelstelling die u wilt kalibreren onder De systeeminstelling Van coördinaat.

Schakel handmatig op kalibratiepunten klikken en controleer Afbeeldingen weergeven tijdens kalibratie. Stel de verblijfstijd in op 10.000 microseconden en het aantal pulsen op 100. Plaats nu de kalibratieschuif, gemaakt van ethidium bromide verzegeld tussen een glazen schuif en een afdekslip, in de podiumadapter met de cover slip kant naar beneden.

Gebruik de instellingen voor de verlichting van de acceptor om zich te concentreren op het oppervlak van de dia, herkenbaar als het brandpuntsvlak met het helderste signaal. Kleine defecten in de coating zullen zichtbaar zijn om te helpen bij het scherpstellen. Verplaats de dia naar een gebied met uniforme fluorescentie over het beeldvormingsvlak.

Klik op Instelling maken voor de eerste kalibratie- of update-instelling voor volgende kalibraties. De software zal het kalibratieproces initialiseren, automatisch bleken en het detecteren van de positie van het gebleekte punt. Zorg voor een succesvolle kalibratie door het uiteindelijke beeld te beoordelen, dat een drie-bij-drie raster van gebleekte punten zal zijn dat gelijkmatig moet worden verdeeld en scherp moet zijn.

Sla de kalibratieafbeelding op voor toekomstige referentie. Verwijder de kalibratieschuif en bewaar deze veilig. Kalibratie moet worden uitgevoerd voordat elk experiment begint, maar hoeft niet tussen de monsters te worden uitgevoerd.

Bereid de microscopie-opstelling voor op live celbeeldvorming, bij voorkeur met een verwarmd podium en een doelstelling, evenals een koolstofdioxide-controle. Laat 20 minuten equiliberen. Plaats nu een van de gegenereerde monsters van cellen die de spanningssensor uitdrukken in de microscoophouder voor beeldvorming.

Laat de cellen gedurende 10 minuten in evenwicht brengen. Om de gezondheid van de afgebeelde cellen te garanderen, moet u de temperatuur op 37 graden Celsius in de beeldkamer houden. Gebruik een peristaltische pomp om bevochtigde 5% kooldioxide over de monsters met 15 milliliter per minuut om de pH te behouden.

Open het gereedschap Multi-Dimensional Acquisition of MDA en stel deze in met FRET-beeldvormingsparameters, waaronder de verschillende filtersets. Sla deze MDA op in de experimentele map met de naam MDA_FRET_date. Stel een andere MDA in met de FRAP-beeldparameters, waaronder de verschillende filtersets, de Timelapse-instellingen en het Journaal om de laser te pulseren na de overname van pre-bleach.

Sla deze MDA op in de experimentele map met de naam MDA_FRAP_date. Selecteer Dagboek, Opname starten op de werkbalk boven aan het scherm. Open het MDA-venster, laad de MDA_FRET_date status en druk op Acquire.

Laad vervolgens de MDA_FRAP_date staat en druk op Acquire. Aan het einde van de overname selecteert u op de werkbalk boven aan het scherm Dagboek, Opname stoppen. Sla dit dagboek op in de experimentele map met de naam FRETFRAP_date en voeg het toe aan een werkbalk voor eenvoudige toegang.

Sluit het MDA-venster. Navigeer door het voorbeeld met behulp van de afbeeldingsverwerving onder Acquire, Acquire met minimale belichtingstijd en een filter met neutrale dichtheid om de cellen van belang te identificeren. Stel continue autofocus in door te navigeren naar Apparaten, Focus.

Concentreer u handmatig op het monster totdat het juiste beeldvlak is bereikt. Klik op Continue focus instellen en wacht tot het systeem is aangepast. Zodra het systeem is aangepast, klikt u op Continu scherpstellen starten.

Zoek vervolgens een cel die de spanningssensor met duidelijke lokalisatie naar een structuur van belang uitdrukt en maak een afbeelding. Teken een rechthoekig interessegebied of ROI om te markeren waar u moet bleken. Sla deze ROI-locatie op.

Initialiseer nu het FRETFRAP_date dagboek, dat zal beginnen met de verwerving van FRET-beelden, gevolgd door de initialisatie van de FRAP-timelapse. Herhaal deze stappen tot 10 tot 15 beeldsets zijn aangeschaft. Analyseer vervolgens de FRET-FRAP-gegevens zoals beschreven in het tekstprotocol.

Hier zijn representatieve resultaten voor FRET beeldvorming van de vinculin spanningssensor, na segmentatie en maskeren om brandpuntsverklevingen te isoleren. Ruimtelijke variatie van vinculine belasting kan worden gezien over de cel. FRAP beeldvorming en analyse kunnen worden beïnvloed door focale hechting stabiliteit.

Een brandpuntshechting die tijdens de beeldtijd snel wordt oververdeeld, kan moeilijk nauwkeurig te volgen zijn. Vaak wordt dit aangegeven door een FRAP-curve die discontinuïteiten bevat en in oninterpreteerbaar. Voor een wild-type vinculin, is er een omgekeerde correlatie tussen eiwitbelasting en omloopsnelheid, wat aangeeft dat vinculin wordt gestabiliseerd door kracht.

De invoering van een mutatie in vinculin om de binding met talin uit te voeren resulteert in een omkering van de correlatie, wat aangeeft dat vinculine die talin niet kan binden, met geweld wordt gedestabiliseerd. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om monsters goed voor te bereiden, ervoor te zorgen dat cellen de sensor op endogene niveaus uitdrukken en zorgvuldig imagingparameters kiezen. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals immunofluorescentie, het meten van cellulaire schaaldynamiek of uitdagende cellen met verschillende remmers worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals hoe het eiwit van belang interageert met andere subcellulaire componenten om de respons op kracht te coördineren.