Spijsvertering van de lymfkliertest lever voor een analyse van de cytometrische stroom van lymfatische endotheliale cellen
7 januari 2019
Het doel van dit protocol is het identificeren van lymfatische endothelial cel populaties binnen de lever beschreven markeringen gebruiken. Wij gebruiken collagenase IV en DNase en een zachte hakken van weefsel, gecombineerd met stroom cytometry, ter identificatie van een aparte populatie van lymfatische endotheliale cellen.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in lymfe- en levervelden, zoals hoe lymfatische endotheelcellen, of LECs, reageren op specifieke stimuli en hoe dat bijdraagt aan ziektepathogenese. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we leverlymfatische endotheelcelfenotype en functie per cel kunnen evalueren en kunnen worden gebruikt voor downstream-toepassingen na celsordeing. Hoewel deze methode inzicht kan geven in leverlymfatische biologie, kan het ook worden gebruikt om lymfe- endotheelcellen uit verschillende weefsels te evalueren, zoals huid- en borstklier.
Het aantonen van de procedure zal Jeffrey Finlon zijn, een professionele onderzoeksassistent van mijn laboratorium. Om een eencellige suspensie van geïsoleerde levercellen voor te bereiden, begin met het besproeien van de muis met zeventig procent ethanol en het vastzetten van de poten naar een dissectiebord. Gebruik dissectie schaar om de huid te snijden ongeveer een centimeter boven de anus en gebruik getande tangen om de huid weg te tillen van het lichaam.
Steek de schaartips tussen de huid en het buikvlies en open de schaar om de weefsels te scheiden voordat u de huidincisie tot aan de nek voortzet. Zet de huid vast aan de dissectiebord onder elke voorpoot en boven elke achterpoot en trek de buikvlieszak omhoog om de incisie naar de nek uit te breiden. Pak de lobben van de lever en snijd net onder het borstbeen om dissectie rond de lever mogelijk te maken.
Breng het orgel vervolgens over in vier milliliter van Click's EHAA-medium. Gebruik de scalpel om de lever te snijden in ongeveer een millimeter diameter stukken en verteren de stukken in vijfhonderd microliter van vers bereide spijsvertering oplossing en vijfhonderd microliter van DNase 1. Na vijftien minuten op zevenendertig graden Celsius, gebruik maken van een vijfhonderd milliliter pipet om de weefsels grondig te mengen en de container terug te keren naar de couveuse voor nog eens vijftien minuten.
Breng aan het einde van de incubatie het verteerde monster over via een honderd micron zeef in een conische buis van vijftig milliliter en gebruik de zuiger van een spuit van één milliliter om de resterende stukken weefsel voorzichtig door het gaas te drukken. Was het filter met vijf milliliter isolatiebuffer en druk het resterende weefsel voorzichtig door de zeef. Verzamel de geïsoleerde levercellen door centrifugatie en schort de pellet opnieuw op in vier milliliter rode bloedcellysebuffer.
Na vijf minuten bij kamertemperatuur, was de cellen in tien milliliter isolatiebuffer en tel de cellen op de hemocytometer om het volledige leveraantal te bepalen. Stel de pellet opnieuw op in vijf milliliter van twintig procent iodixanol en overlay de celsuspensie met één milliliter PBS. Scheid de cellen door dichtheidgradiëntscheiding en oogst de laag tussen de PBS en de iodixanol.
Dan filteren de cellen door een honderd micrometer zeef in een nieuwe vijftig milliliter conische buis. Was de cellen in tien milliliter verse isolatiebuffer en schort de resulterende pellet opnieuw op in vijfhonderd microliter PBS, aangevuld met twee procent foetaal runderserum, of FBS. Na het tellen, aliquot ongeveer vijf keer tien tot de zesde niet-parenchymale cellen in elke controle en experimentele put van een zesennegentig put plaat voor centrifugatie en opnieuw op te schorten de pellets in negentig microliter van PBS plus FBS per goed.
Voeg de juiste experimentele en controle primaire antilichaam cocktails aan elke put en vlek alle putten met een geschikte levensvatbaarheid marker. De belangrijkste stap in deze procedure is de juiste titratie van de antilichamen en het gebruik van ice type controles en fluorescentie-1 controles om de kleuring te valideren. Na dertig minuten bij vier graden Celsius, centrifuge wassen de cellen met honderd microliter van PBS plus FBS per goed en breng de cellen van elke put in individuele vijf milliliter ronde stroom cytomemetrie buizen naar een vierhonderd microliter eindvolume van PBS plus FBS per buis.
Gebruik vervolgens een klein volume cellen om de laser- en compensatieinstellingen op de stroomcytometer aan te passen en alle gebeurtenissen voor elke buis te lezen. Wanneer alle buizen zijn gelezen, importeer de gegevens in een geschikt analyseprogramma voor stroomtristometrie. Poort op levende cellen op basis van de levensvatbaarheid marker kleurstof waar negatieve expressie wordt beschouwd als live.
Poort op de levende cellen op basis van de grootte en granulariteit van de cellen, evenals hun levensvatbaarheid marker kleurstof expressie, gevolgd door gating op de CD45 negatieve CD31 positieve cel populatie met behulp van de juiste isotype controle en fluorescentie-1 gegevens om de positieve en negatieve populaties te bepalen. Dan poort de CD45 negatieve CD31 positieve cellen volgens hun CD16/32 en podoplanin uitdrukking om identificatie van de CD45 negatieve CD31 positief, CD16/32 negatieve podoplanine positieve lymfotische endotheelcelpopulaties, en CD45 negatieve CD31 positief, CD16/32 positieve podoplanin negatieve leverholte endotlier cel populaties. Nadrukkelijke endotheelcellen drukken lymfevat en endotheelhyaluronan één uit, maar niet CD146.
Lever geïsoleerde CD31 positieve CD16/32 positieve cellen geïsoleerd zoals aangetoond zijn ook CD146 positief en podoplanin positief, terwijl de CD31 positieve CD16/32 negatieve cellen zijn voornamelijk CD146 negatief en ofwel podoplanin positief of negatief. Positiviteit werd bepaald op basis van fluorescentie-1 kleuring. De leverlymfefatische endotheelcellen zijn CD146 negatief en PDPN positief.
Noch de vasculaire endotheel noch murine lever macrofagen uitdrukken podoplanin. Podoplanin kleuring kan ook worden gebruikt om cholangiocyten te onderscheiden van lymfevaten op basis van de verschillende nucleaire structuren van de galwegen en door cytokeratine 7 kleuring. Aangezien alleen lymfe-endotheelcellen co-express vasculaire endotheelgroeifactor receptor 3 en Prospero homeobox eiwit 1 in de lever, deze markers kunnen verder worden gebruikt om de zuiverheid van de gesorteerde lever lymfotische endotheelcel populatie te bevestigen.
Tijdens een poging tot deze procedure is het belangrijk om te onthouden om snel te werken en cellen in ijs te houden. Na deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd, zoals het sorteren van LEC-populaties om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals transcriptieprofilering van LED's. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van leverspecifieke lymfatische biologie om te onderzoeken hoe lymfatische gevolgen heeft voor leverziekte bij muizen en mensen.
Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn bij deze methode het moeilijk hebben omdat lymfe-endotheelcellen een zeldzame, geleidelijke populatie in een lever zijn en de methode snel moet worden uitgevoerd.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol heeft tot doel lymfatische endotheelcelpopulaties in de lever te identificeren met behulp van specifieke markers. De methode combineert een behandeling met collagenase IV en DNase met flowcytometrie om specifieke lymfatische endotheelcellen te isoleren.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Lymfatische biologie
Achtergrond
- Lymfatische endotheelcellen (LEC's) spelen een cruciale rol bij verschillende fysiologische en pathologische processen.
- Inzicht in de respons van LEC's op stimuli kan inzicht bieden in ziektemechanismen.
- Deze methode maakt het mogelijk om het fenotype en de functie van LEC's op single-cell niveau te evalueren.
- De methode kan worden aangepast voor gebruik met LEC's uit verschillende weefsels, waaronder de huid en melklieren.
Doel van de studie
- Om het gedrag van lymfatische endotheelcellen in de lever te onderzoeken in reactie op specifieke stimuli.
- Om bij te dragen aan het begrip van de pathogenese van ziekten die verband houden met lymfatische biologie.
- Om downstream-toepassingen mogelijk te maken na cel sortering.
Gebruikte methoden
- Bereiding van een single-cell suspensie uit geïsoleerde levercellen.
- Gebruik van collagenase IV en DNase voor weefseldigestie.
- Flowcytometrie voor celidentificatie en sortering.
- Dissectietechnieken voor weefselafname uit muismodellen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle identificatie van verschillende populaties lymfatische endotheelcellen.
- Inzichten in het fenotype en de functie van LEC's in de lever.
- Potentiële toepassingen bij het bestuderen van LEC's uit diverse weefsels.
- Demonstratie van de procedure door een getrainde professional.
Conclusies
- Deze methode biedt een waardevolle tool voor het bestuderen van lymfatische endotheelcellen.
- Het vergroot het begrip van de lymfatische biologie van de lever en de implicaties hiervan bij gezondheid en ziekte.
- Toekomstig onderzoek kan deze techniek benutten voor bredere toepassingen in lymfatische studies.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor management
Dit protocol maakt analyse op single-cell resolutie van lymfatische endotheelcellen (LEC's) uit de muizenlever mogelijk, waarmee een kritisch gat in de hulpmiddelen voor het bestuderen van lever-specifieke lymfatische biologie wordt gedicht. Door een reproduceerbare methode te bieden voor het isoleren en fenotyperen van zeldzame LEC-populaties, ondersteunt het de mechanistische risicovermindering bij inspanningen voor targetvalidatie met betrekking tot leverontsteking, trafficking van immuuncellen en fibrose. De aanpak vergroot het voorspellend vertrouwen in preklinische modellen door directe beoordeling van de respons van LEC's op stimuli in een ziekterelevant systeem mogelijk te maken.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om het fenotype en de functie van lymfatische endotheelcellen op individueel celniveau te onderzoeken om biologische mechanismen in de pathofysiologie van de lever te verduidelijken.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerde workflow voor digestie en kleuring om levensvatbare LEC's uit leverweefsel te isoleren voor daaropvolgende functionele assays.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantificeerbare read-outs op single-cell niveau van LEC-markers (bijv. podoplanine, CD31, CD45, VEGFR3, Prox1) ter ondersteuning van assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid.
- Operationele waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor die geschikt zijn voor high-throughput screening van verbindingen die de activiteit van lymfatische endotheelcellen of leverspecifieke pathways moduleren.
Translationeel en preklinisch onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de modellering van ziekterelateerde systemen door de isolatie van lever-LEC's mogelijk te maken om hun rol bij ontsteking, immuunbewaking en de progressie van fibrose te bestuderen.
- Operationele waarde: Faciliteert translationele continuïteit van ontdekking naar preklinische validatie door een herbruikbare methode te bieden voor de verrijking van LEC's onder meerdere experimentele condities.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van het testen van doelhypotheses tot de identificatie van lead-verbindingen, met name voor projecten die gericht zijn op de lymfatische biologie van de lever, immuunmodulatie of stroma-gerichte therapieën.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door fenotypische analyse van lever-LEC's mogelijk te maken als reactie op experimentele stimuli.
- Screening: Levert assay-klare cel-suspensies met gedefinieerde endotheliale en lymfatische markers voor betrouwbare evaluatie van verbindingen in 96-well formats.
- Analytiek: Maakt kwantitatieve flowcytometrie-readouts mogelijk om de LEC-frequentie, activatietoestand en co-expressie van functionele markers tussen verschillende condities te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt ontdekkingsresultaten met preklinische continuïteit door de isolatie van LEC's mogelijk te maken voor downstream-applicaties zoals transcriptionele profilering of functionele assays.
- Bedrijfsmatige herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbaar platform voor het bestuderen van lymfatische endotheliale cellen, niet alleen in de lever, maar ook in andere weefsels zoals de huid en de melkklier, waardoor de efficiëntie van middelen wordt gemaximaliseerd.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit rond de betrokkenheid van lymfatische endotheelcellen bij leverziekteprocessen te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van LEC-isolatie door gestandaardiseerde enzymatische digestie, densiteitsgradiëntseparatie en multiparametrische flowcytometrie-gating.
- Strategische waarde: Verbetert de besluitvorming over go/no-go-beslissingen door vroege, mensrelevante biologische inzichten te verschaffen in lymfatisch-gemedieerde mechanismen in de leverpathofysiologie.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk die de lymfatische functie van de lever moduleren via directe fenotypische beoordeling van LEC-populaties.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in muisweefseldissectie, enzymatische digestie en multi-color flowcytometrie met适当 compensatiecontroles.
- Afhankelijk van toegang tot flowcytometers, centrifugatieapparatuur en reagentia, waaronder collagenase IV, DNase 1, iodixanol en antilichaampanels voor CD31, CD45, podoplanine, CD16/32, VEGFR3 en Prox1.
- Noodzaak tot cross-team standaardisatie van gating-strategieën en antilichaamtitratie om consistentie tussen laboratoria en experimentele batches te waarborgen.
- Aanpassing aan andere weefsels (bijv. huid, melkklier) kan optimalisatie van digestietijden en zeefstappen vereisen, afhankelijk van de weefseldichtheid en cellulariteit.
- Praktische beperkingen omvatten de lage frequentie en fragiliteit van lymfatische endotheelcellen in de lever, waardoor snelle verwerking en koude behandeling noodzakelijk zijn om de levensvatbaarheid en markerintegriteit te behouden.
