Hoge resolutie patroon Biofilm afzetting met behulp van pDawn-Ag43

We ontwikkelden een methode genaamd biofilm lithografie om licht te schijnen op een oppervlak, en bacteriën accumuleren waar het licht is. Deze methode stelt ons in staat om belangrijke vragen in biofilmonderzoek te beantwoorden, bijvoorbeeld hoe ruimtelijke structuren de maatschappelijke functies beïnvloeden. Er zijn vele voordelen aan deze methode.

Bijvoorbeeld, het werkt op een zeer hoge resolutie van 25 micrometer, het vereist geen oppervlak pre-patroon, en werkt ook in gesloten vloeistofapparaten. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de structuur-functie relatie van natuurlijke biofilms, kan het ook worden toegepast op andere disciplines, zoals biofilm engineering, biomaterialen, en meercellige synthetische biologie. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang omdat er belangrijke voorbereidende stappen zijn om de optische kweekopstelling en bacteriële steekproef voor te bereiden voorafgaand aan biofilmpatronen.

Ten eerste, zet pDawn-Ag43 plasmid in de E.coli stam van belang, en plaat op een LB agar plaat aangevuld met spectinomycine. Inenting een enkele kolonie in LB bouillon met spectinomycine in een cultuur buis, en groeien tot exponentiële fase in een schudden incubator op 250 rpm en 37 graden Celsius. Bereid na inenting een voorraad van 25%glycerol van de pDawn-Ag43 getransformeerde stam door één milliliter van 50% steriele glycerol te mengen met één milliliter cultuur in een cryobuis.

Bewaar de voorraad in een min 80-graden Celsius vriezer. Begin vervolgens met het voorbereiden van de optische setup door een draagbare projector aan de onderkant van een bacteriële incubator te plaatsen met het diafragma dat direct naar boven wijst op het plafond, waar de biofilmcultuurkamer zal worden bevestigd. Sluit een laptop via de displaykabel aan op de projector in de couveuse.

Gebruik tape om een lege dummy cultuur schotel hechten aan het plafond van de incubator. Pas de focus op de projector door het draaien van de focus knop, zodat de focus vlak samenvalt met het onderste oppervlak van de biofilm cultuur schotel bevestigd aan het plafond van de incubator. De projector moet een scherp, niet-wazig beeld op de bodem van het kweekschotel verlichten.

Verwijder de dummy kweekschotel zodra de projectie is geoptimaliseerd. Met behulp van laptopsoftware richt u de projector om het volledige gezichtsveld te verlichten met maximale blauwe verlichting door een volledig blauwe dia te presenteren. Meet de verlichtingsintensiteit van de projector met behulp van een optische vermogensmeter door de fotodetectorkop bij het plafond van de incubator te plaatsen en de intensiteit van de overeenkomstige vermogensmeter te lezen die is gekalibreerd op lichtgolflengte van 460 nanometer.

Pas vervolgens de verlichtingsintensiteit aan met behulp van een verstelbaar neutraal dichtheidsfilter dat bij het diafragma van de projector is geplaatst. Draai het filter om de verlichtingsintensiteit aan te passen gemeten door de vermogensmeter totdat de verlichtingsintensiteit in het midden van het door blauw licht geprojecteerde gebied 50 microwatt per vierkante centimeter leest. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de verlichtingsintensiteit op een goed niveau wordt ingesteld met behulp van de gekalibreerde fotodetector die aan het plafond van de couveuse is geplaatst.

Dit maakt een nauwkeurige afstemming van de verlichtingsintensiteit mogelijk door het neutrale dichtheidsfilter te draaien. Teken nu willekeurige patronen met behulp van de presentatieprojectorsoftware op de laptop en geef deze patronen weer op het plafond van de incubator, met behulp van de projector. Voorafgaand aan de verlichting, streep een pDawn-Ag43 stam uit de glycerol voorraad op een LB-plus-spec agar plaat.

Laat de kolonies 's nachts groeien bij 37 graden Celsius. Inenting een kolonie van pDawn-Ag43 bacteriën uit een agar plaat in LB-plus-spec bouillon, en groeien de cultuur 's nachts tot stationaire fase in een schudden incubator op 250 rpm en 37 graden Celsius. Op de volgende dag, subdilute de cultuur op een verhouding van een tot 1.000 in LB bouillon met spectinomycine.

Laat de onderverdunde cultuur groeien in een schudden incubator op zes uur bij 250 rpm en 37 graden Celsius tot laat exponentiële, vroege stationaire fase. Het is belangrijk om de nachtelijke cultuur te verdunnen en te groeien tot de late exponentiële fase voorafgaand aan verlichting. Dit zorgt ervoor dat de bacteriën betrouwbaar gezond en actief zijn bij inductie.

Na incubatie, subdilute de late-exponentiële-fase cultuur op een verhouding van een tot 100 met eerder voorbereide M63 media aangevuld met 50-microgram-per-milliliter spectinomycine. Breng vervolgens de verdunning in een biofilmcultuurschotel. Omdat de monsters nu klaar zijn voor verlichting, plakt u de kweekschotel aan het plafond van de couveuse, zodat het oppervlak aan de onderkant van de schotel transparant is voor verlichting van onderen door de projector.

Na de nachtelijke groei van de biofilmmonsters, verwijder de kweekschotel uit de couveuse. De schotel zal biofilm bacteriën bevestigd aan het onderste oppervlak waar het is verlicht, evenals planktonische bacteriën verspreid in de vloeibare media hierboven. Gooi de planktoncellen weg door de vloeibare media uit de kweekschotel te verwijderen.

Spoel het monster vervolgens twee keer af met PBS om de resterende planktoncellen te verwijderen door voorzichtig te pipetten in PBS, gevolgd door aspiratie. Als de cellen fluorescerend zijn getagd, u de monsters rechtstreeks in beeld brengen met fluorescentiemicroscopie. Zoals hier te zien, pDawn-Ag43 bacteriën werden gebruikt om biofilms patroon in polystyreen goed platen met projector verlichting te genereren.

Biofilms kunnen worden gevisualiseerd met behulp van kristal violet kleuring of als alternatief door middel van fluorescentie microscopie bij het gebruik van fluorescerende bacteriën. Fluorescerende biofilm monsters kunnen ook worden afgebeeld met behulp van confocale microscopie om beelden van de biofilm in 3D te verkrijgen. Hoge resolutie patroon is mogelijk met behulp van een film fotomasker om patroon verlichting te bieden aan de biofilm monster.

Voorbeelden van patronen op glas- en PDMS-oppervlakken, evenals ingesloten PDMS-kweekkamers, worden hier getoond en illustreren de verschillende soorten omgevingen waar pDawn-Ag43-patronen kunnen worden toegepast. Tijdens een poging tot deze procedure is het belangrijk om eerst pDawn-Ag43 om te zetten in uw interessestam, dan uw projector goed te concentreren en te kalibreren, en uiteindelijk de vereiste cultuur- en rugverdunningsstappen te volgen om uw bacteriën voor te bereiden op verlichting. Volgens deze methode kunnen andere technieken worden ingezet, bijvoorbeeld het monitoren van biofilm op lange termijn onder verschillende kweekomstandigheden.

Op die manier kunnen we begrijpen hoe een biofilmstructuur zijn functie beïnvloedt. Deze techniek zal breed toepasbaar zijn, bijvoorbeeld voor synthetische biologie en materiaalonderzoek, om biofilms naar verschillende toepassingen te ontwikkelen.