Name: Meting van de energie-stofwisseling in transplanteren retinale weefsel met behulp van extracellulaire Flux-analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Leer hoe je energiestofwisseling meet in geëxplanteerd muizenretina met behulp van extracellulaire fluxanalyse. Deze methode registreert zuurstofverbruik en glycolyse in realtime voor farmacologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Dr. Alexander Kolesnikov en Dr. Vladimir Kefalov voor het verstrekken van Gnat1- / -muizen, voor nuttige feedback en advies en voor het lezen van het manuscript.
Dit werk werd gesteund door NIH EY025269 (RR), het onderzoekscentrum van de Diabetes aan de Washington University - NIH DK020579 (JRM en RR), een carrière ontwikkeling Award van onderzoek te voorkomen blindheid (RR), de Horncrest Foundation (RR), een carrière ontwikkeling Award van JDRF () JRM), NIH DK101392 (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS) en DK114233 (JRM).

Protocollen gevolgd van de Association for Research in visie en oogheelkunde-instructie voor het gebruik van dieren en zijn goedgekeurd door de Universiteit van Washington.
1. dierlijke voorbereiding
<ol><li>Dieren houden in standaard behuizing met een 12 uur donker aan 12 uur licht cyclus. Begin experimenten op gestandaardiseerd keer circadiane-effecten te vermijden, meestal in de ochtend kort na de lichten zijn ingeschakeld.</li>
</ol>2. oplossing voorbereiding
<ol><li>Base media voor te bereiden door het oplossen van 8.4 mg poeder media in tweemaal gedestilleerd H2O (ddH2van O) en breng aan 7.4 met HCl of NaOH pH, tot een eindvolume van 1 L. Filter steriliseren deze oplossing met een 0,22 µm weefselkweek filter.<ol>
<li>Voeg 1 M glucose en 100 mM natrium pyruvaat naar de media om de eindconcentraties van 5 mM glucose en pyruvaat van 1 mM.</li>
		<li>Plaats een hoeveelheid van 50 mL van de base media in een waterbad 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lysis van de oplossing, voorbereiden op weefsel kwantificatie aan het einde van de flux-analyse, door toevoeging van tris basis aan 10 mM, polyethyleenglycol tert-octylphenyl ether tot 0,2% (v/v) en EDTA tot 1 mM, alle in ddH2O. Mix totdat alle onderdelen volledig ontbonden en aanpassen pH ten slotte op 8.0.</li>
	<li>Voorbereiden voor het protocol mitochondriale stress een 11 µM voorraad van oligomycin, een inhibitor van ATP-Synthase, opgelost in base media te richten een eindconcentratie van 1 µM in de put. Bereiden van een voorraad 11 µM carbonyl cyanide - 4-(trifluormethoxy) phenylhydrazone (FCCP), een ontkoppelingseiwit agent, opgelost in base media te richten een eindconcentratie van 1 µM in de put. Bereiden van een cocktail van het elektronentransport keten remmers, rotenon en antimycin A (RAA) door toevoeging van rotenon 11 µM en antimycin A naar 22 µM, opgelost in base media te richten een eindconcentratie van 1 µM rotenon en 2 µM antimycin A in het goed.</li>
	<li>Voor het protocol glycolyse bereiden een 220 mM voorraad van glucose opgelost in base media, te richten op een eindconcentratie van 20 mM in de put. Bereiden ook een 1.1 M voorraad van 2-deoxyglucose (2-DG), een concurrerende inhibitor van glucose en glycolytic antagonist, door het oplossen van het in base media. Dit zal richten op een eindconcentratie van 100 mM 2-DG in de put.</li>
</ol>3. kalibreren van het instrument
<ol><li>Als u wilt kalibreren de instrumentatie voor een extracellulaire flux assay, voeg 1 mL kalibratie-oplossing aan elk putje van de sensor-patroon (24 wells totaal) en Incubeer bij 37 ° C in een CO-2-gratis incubator overnachting (of ten minste 8 uur).</li>
	<li>Additieven voor het mitochondriaal stress-protocol of de glycolyse protocol in elke injector poort, A t/m D, op de sensor patroon, gecorrigeerd voor de veranderingen van het volume in de put te laden. Opmerking: Als voorbeeld, zou een typisch assay 45 µL van een toevoegingsmiddel in de eerste haven van de injector, 49,5 µL in de tweede, 54.5 µL in de derde, en 60 µL in de laatste, uitgaande van een aanvankelijke goed volume van 450 µL omvatten.</li>
	<li>Tijdens de eerste verschillende experimenten, door base media te laden op poort A om te meten hoeveel weefsel verkeer/artefact treedt op na de injectie van een poort.</li>
	<li>Laat de plaat geladen sensor te incuberen bij 37 ° C in een niet-CO2 -incubator voor ten minste 60 min.</li>
</ol>4. isolatie van verse muis retinale weefsel
Opmerking: Deze stap is aangepast van de techniek van Dr. Barry Winkler15.
<ol><li>Na beheren diepe verdoving met euthanaseren een standaard ketamine/xylazine cocktail, muizen door cervicale dislocatie.</li>
	<li>Gebruik een paar kleine en middelgrote gebogen pincet voorzichtig toepassing voorwaartse druk uit op proptose het oog (figuur 1A) te begrijpen van de posterieure globe op de oogzenuw.<ol>
<li>Met een schone scheermesje, door een limbus aan limbus incisie te maken door het hoornvlies met behulp van een enkele, doelbewuste pass van het blad.</li>
		<li>Met behulp van boete, knijpen schuine McPherson-stijl Tang, de posterieure globe wil de lens en de voorste hyaloid membranen uit het hoornvlies incisie. Gooi deze weefsels.</li>
		<li>Herhaal de knijpen manoeuvreren met een tang om uit te drukken de neurale netvlies.</li>
		<li>Met behulp van de verlostang als een lepel om te heffen van het netvlies, in plaats van te begrijpen van het weefsel, breng het netvlies uit de buurt van de cornea incisie en direct in de warme media in een 3 cm schotel of een 6-well weefselkweek cluster plaat plaatsen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Twee paren van fijne, schuine McPherson-stijl Tang gebruiken om te ontleden zachtjes overige glasvocht van het netvlies. Dit gebeurt best door grijpen het glasvocht aan de rand van de retinale cup en trekken naar het centrum, met een definitieve disinsertion van het glasvocht lichaam van het centrum als geheel. Met behulp van de verlostang, Verwijder eventuele resterende retinale pigment epitheel van de fotoreceptor oppervlak van het netvlies.<ol>
<li>Snijd een P1000 Pipetteer tip met een scheermesje maken een ~ 4 mm opening om te voorkomen dat onnodige trauma aan het kwetsbare netvlies weefsel tijdens overdracht manoeuvres.</li>
		<li>Breng het geïsoleerde retinale weefsel in verse media met behulp van een gesneden P1000 Pipetteer tip.</li>
		<li>Snijd 1 mm stoten van netvlies rond de oogzenuw met een 1 mm biopsie punch uitgerust met een zuiger te verjagen van het weefsel in het geval het wordt ingediend in de boring (figuur 1B). Het netvlies stoten opzij in schone media op een blok 37 ° C bewaard of verwarming pad instellen</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. assay Protocol
<ol><li>Individuele stoten overbrengen in een 24-well islet vangen microplate met behulp van een gesneden P1000 tip, zuigen 450 µL van media samen met het weefsel.</li>
	<li>Gebruik prima, rechte pincet om te stoten in het midden van de microplate zachtjes te manipuleren. Houd stoten georiënteerd in dezelfde richting (bijvoorbeeld, ganglion cel kant naar boven).<ol>
<li>Rusten de plaat vastleggen op een verwarming pad of verwarming blok ingesteld op 37 ° C als volgt worden herhaald voor de overige monsters. Opmerking: Voor elk experiment, gereserveerd 3-4 lege putjes met 450 µL van base media om te dienen als negatieve controles. In de resterende test 20-21 wells, elke biologische repliceren in drievoud. Elke plaat 24-well staat dan ook toe voor opname van 6-7 verschillende dieren of behandeling voorwaarden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vermijden van luchtbellen, zachtjes positie het rotseilandje vastleggen van mesh inzetstukken in elk goed gebruik van pincet en beveiligen van de inserts met een metalen zuiger of met een gesneden P1000 Pipetteer tip (Figuur 1 C). Opmerking: Vermijd buitensporige weefsel beweging tijdens deze stap om het standpunt van de retinale punch in het midden van het monster microchamber. Luchtbellen verstoren ernstig OCR lezingen. Hoewel de microchamber voldoende diepte aan typische muis netvlies (Figuur 1 c) heeft kunnen af en toe verspaning-gebreken in de mesh inzetstukken weefsels worden overdreven gecomprimeerd tijdens het inbrengen van het scherm veroorzaken. Als dit gebeurt, gewoon Maak een notitie van de geplette weefsel en uitsluiten dat monster van de definitieve analyse.</li>
	<li>Incubeer de weefsel plaat in een 37 ° C CO2-gratis incubator voor ten minste 60 min.</li>
	<li>Program van de extracellulaire flux-analyzer met behulp van de Mix, wachten, maatregel, en herhaalt u opdrachten. Als voorbeeld, een typisch experiment met weefsel van het netvlies kan omvatten het volgende: Meng 2 minuten, wacht 2 minuten en 5 minuten meten. Herhaal het experiment met deze drie tussen stappen 5 - 8 keer (cycli) voor een opname basislijn, en na injectie van elke stof wordt getest tijdens de run.</li>
	<li>Druk op de knop programma START op de extracellulaire flux analyzer en volg de instructies op het scherm om het invoegen van de sensor cartridge voor kalibratie.</li>
	<li>Volg de instructies op het scherm ter vervanging van de kalibrant plaat met de plaat met de retinale monsters aan het eind van de kalibratie.</li>
	<li>Het programma laat werken, zoals geprogrammeerd. Volg de instructies op het scherm om het uitwerpen van de plaat weefsel aan het einde van de termijn. De resultaten van de run bekijken en opslaan van het gegevensbestand.</li>
	<li>Met een gebogen 20 gauge naald en pincet, verwijder alle mesh inzetstukken uit de putten, de retinale punch achterlatend.</li>
	<li>Zorgvuldig gecombineerd van de media van het weefsel en spoel het weefsel tweemaal met 0,5 mL koude-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). De PBS gecombineerd na het wassen.</li>
	<li>100 µL van lysis buffer aan elk goed en Pipetteer omhoog en omlaag te homogeniseren weefsel toevoegen.</li>
	<li>Kwantificeren van de sterkte van de ingevoerde, op basis van totale double-stranded DNA (dsDNA) of totale eiwitgehalte. Opmerking: De volgende is gebaseerd op een commercieel beschikbare dsDNA assay.</li>
	<li>Lysed monsters 1:1 verdunnen door toevoeging van 100 µL van Tris-EDTA (TE) buffer en breng 100 µL van het verdunde monster naar een 96 goed plaat.<ol>
<li>Voeg 100 µL van detectie buffer in elk putje. Na het mengen voor 2-5 minuten, kwantificeren fluorescentie na excitatie bij 480 nm en emissie bij 520 nm, vergelijken met een standaard curve.</li>
		<li>Normaliseren van het ruwe extracellulaire flux traceren naar DNA inhoud binnen de put. Opmerking: In de resultaten die hier gepresenteerd, zijn monsters genormaliseerd naar 50 ng dsDNA - een typisch bedrag in een retinale punch van 1 mm. Daarom kan absolute waarden hier gepresenteerd worden vergeleken met studies presentatie van gegevens "per retinale punch". Normaliseren schetsen naar een interne standaard, zoals de basislijn uitgevoerd bij een concentratie van de glucose van 5 mM.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wong-Riley, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+of+the+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+and+brain%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism of the visual system.</a> Eye and brain. 2, 99-116 (2010).</li>
<li>Ames, A. 3rd, Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+of+rabbit+retina+as+related+to+function%3A+high+cost+of+Na%2B+transport%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 12 (3), 840-853 (1992).</li>
<li>Warburg, O. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13298683">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123 (3191), 309-314 (1956).</li>
<li>Wubben, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+metabolic+reprogramming+provides+survival+advantage+in+acute+stress+while+causing+chronic+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor metabolic reprogramming provides survival advantage in acute stress while causing chronic degeneration.</a> Scientific reports. 7 (1), 17863(2017).</li>
<li>Du, J., Linton, J. D., Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Metabolism+in+the+Intact+Retina+Using+Stable+Isotope+Tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Probing Metabolism in the Intact Retina Using Stable Isotope Tracers.</a> Methods in enzymology. 561, 149-170 (2015).</li>
<li>Felder, A. E., Wanek, J., Tan, M. R., Blair, N. P., Shahidi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+Combined+Retinal+Vascular+and+Tissue+Oxygen+Tension+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">A Method for Combined Retinal Vascular and Tissue Oxygen Tension Imaging.</a> Scientific reports. 7 (1), 10622(2017).</li>
<li>Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose%2C+lactate%2C+and+shuttling+of+metabolites+in+vertebrate+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+research%22%5BJournal%5D)">Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas.</a> Journal of neuroscience research. 93 (7), 1079-1092 (2015).</li>
<li>Winkler, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolytic+and+oxidative+metabolism+in+relation+to+retinal+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+general+physiology%22%5BJournal%5D)">Glycolytic and oxidative metabolism in relation to retinal function.</a> The Journal of general physiology. 77 (6), 667-692 (1981).</li>
<li>Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+flux+analysis+to+monitor+glycolytic+rates+and+mitochondrial+oxygen+consumption%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption.</a> Methods in enzymology. 542, 125-149 (2014).</li>
<li>Joyal, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+lipid+and+glucose+metabolism+dictates+angiogenesis+through+the+lipid+sensor+Ffar1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1.</a> Nature medicine. 22 (4), 439-445 (2016).</li>
<li>Kooragayala, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Oxygen+Consumption+in+Retina+Ex+Vivo+Demonstrates+Limited+Reserve+Capacity+of+Photoreceptor+Mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 56 (13), 8428-8436 (2015).</li>
<li>Pearsall, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPARalpha+is+essential+for+retinal+lipid+metabolism+and+neuronal+survival%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+biology%22%5BJournal%5D)">PPARalpha is essential for retinal lipid metabolism and neuronal survival.</a> BMC biology. 15 (1), 113(2017).</li>
<li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of visualized experiments. (46), (2010).</li>
<li>Lobanova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transducin+translocation+in+rods+is+triggered+by+saturation+of+the+GTPase-activating+complex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).</li>
<li>Winkler, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electroretinogram+of+the+isolated+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+research%22%5BJournal%5D)">The electroretinogram of the isolated rat retina.</a> Vision research. 12 (6), 1183-1198 (1972).</li>
<li>Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+proton+and+electron+leaks%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+in+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial proton and electron leaks.</a> Essays in biochemistry. 47, 53-67 (2010).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Methods in enzymology. 547, 309-354 (2014).</li>
<li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+Influences+Metabolic+Flux+and+Nucleotide+Metabolism+in+Mouse+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Phototransduction Influences Metabolic Flux and Nucleotide Metabolism in Mouse Retina.</a> The Journal of biological chemistry. 291 (9), 4698-4710 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

OCR en ECAR worden gemakkelijk gemeten in transplanteren retinale weefsel met behulp van een bioanalyzer met behulp van de beschreven technieken. Deze methode vertrekt van die van andere groepen in verschillende kritische stappen. Netvlies weefsels zijn geïsoleerd door middel van een grote cornea incision zonder enucleating van de hele wereld, zoals oorspronkelijk beschreven door Winkler15. Deze methode van retinale isolatie zorgt voor een snelle overdracht van het oog van de levende in de weefsel...

Het netvlies is een van de meest energie-eisen weefsels in het centrale zenuwstelsel1. Zoals de meeste weefsels genereert het adenosine trifosfaat (ATP) via glycolyse in het cytosol of via oxidatieve fosforylatie in de mitochondriën. De energieke voordeel van oxidatieve fosforylatie over glycolyse te produceren van ATP van één molecuul glucose is duidelijk: 36 moleculen van ATP gegenereerd op basis van de voormalige vs. 2 moleculen van ATP gegenereerd op basis van de laatste. Dienovereenkomstig, retinale neuronen is voornamelijk afhankelijk van mitochondriale ademhaling voor energievoorziening en dit komt tot uiting door hun hoge dichtheid van mitochondriën2. Nog, het netvlies ook sterk afhankelijk van glycolytic machines zelfs wanneer zuurstof overvloedig is. Dit proces van aërobe glycolyse werd oorspronkelijk in kankercellen beschreven door Otto Warburg3, die eens merkte op dat het netvlies het alleen na mitotische weefsel staat van deze vorm van metabolisme4. Sinds deze eerste opmerkingen, zijn veel post mitotische weefsels beschreven om deel te nemen in verschillende graden van glycolyse naast oxidatieve fosforylatie om hun ATP-eisen te voldoen.
Phototransduction, visuele pigment recycling, biosynthese van fotoreceptor buitenste segmenten, en synaptische activiteit zijn alle energie veeleisende processen in de researchdieren, de overheersende neuronale subklasse in het netvlies. Maar de noodzaak om actief transport van ionen tegen hun elektrische gevaren en concentratie verlopen is veruit het meest energiek tijdrovend proces in neuronen1. Researchdieren zijn eigenaardige neuronen in de zin dat ze zijn depolarized bij gebrek aan stimulatie (dat wil zeggen, in het donker), overwegende dat een lichte stimulans kanaal sluiting en latere hyperpolarisatie activeert. Daarom, in het donker verbruikt het netvlies grote hoeveelheden van ATP of te handhaven de depolarisatie "donkere huidig" zoals het gewoonlijk genoemd wordt. Vanuit een adaptieve oogpunt is een belangrijke uitdaging bij het verstrekken van deze enorme hoeveelheden van ATP de noodzaak van organismen om visuele helderheid door de optische as. De omgekeerde retinale architectuur gezien in moderne wezens is de dominante oplossing, zoals het houdt de dichte capillaire netwerk leveren researchdieren uit de buurt van het pad van licht. Maar dit wonder van natuurlijke bioengineering plaatst het netvlies in een afgrond in termen van metabole reserve. Zelfs kleine beledigingen aan netvlies kunnen potentieel verstoren het delicate evenwicht van de energievoorziening te eisen, en visuele disfunctie of openhartige blindheid kan ontstaan snel.
Gezien de unieke energetische eisen van het neurale netvlies, in combinatie met haar strakke beperking vasculaire voorzieningszekerheid, zou kunnen nauwkeurige meting van ATP verbruik in het netvlies en de veranderingen tijdens ziekte verstrekkende gevolgen in begrijpen en behandelen hebben verblindende aandoeningen zoals retinitis pigmentosa en diabetische retinopathie. Traditioneel, vereisen deze metingen dure, douane-ontworpen apparatuur met de meeste studies die voortkomen uit een handvol laboratoria geheel gewijd aan de metingen van de metabole activiteit2,5,6, 7,8. Technieken omvatten individuele tests voor specifieke metabolieten, tracer studies met radio-geëtiketteerden precursoren, zuurstofverbruik opname via Clark elektroden, en profilering van de9metabolomic.
Met high-throughput technologische vooruitgang en toegenomen beschikbaarheid van commerciële apparaten zijn technieken voor record retinale stofwisseling steeds toegankelijk en betaalbaar. De hier beschreven methode meet beide oxidatieve fosforylatie en transplanteren glycolyse bij het gebruik van het netvlies weefsel en een verkrijgbare extracellulaire flux analyzer9,10,11,12. Deze analyzer registreert afzonderlijk zuurstof verbruik rente (OCR) en de extracellulaire verzuring (ECAR), fungeren als indirecte indicatoren van oxidatieve fosforylatie en glycolyse, respectievelijk13. Deze metingen zijn gedaan door een sonde onderdompelen in een microchamber gemaakt over het weefsel van belang. Deze aanpassing van eerder gepubliceerde methoden gebruikt een plaat van de vangst oorspronkelijk ontworpen voor alvleesklier eilandjes van Langerhans voor het vastleggen van de metabole activiteit in kleine, cirkelvormige secties van muis netvlies. Meerdere farmacologische belichtingen kunnen worden afgeleverd bij het weefsel in de loop van een enkele opname, omdat het systeem 4 injectie-poorten voor elk monster goed bevat. Met behulp van dit systeem met afzonderlijke protocollen geoptimaliseerd voor ECAR- en OCR-opnamen, de reacties van het netvlies van de wild-type kunnen worden vergeleken met netvlies ontbreekt transducine (Gnat1- / -), een oorzaak van aangeboren stationaire nacht blindheid in mensen14.

<table><tbody><tr><td>Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer</td><td>Agilent, Santa Clara, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution)</td><td>Agilent, Santa Clara, CA</td><td>101174-100</td><td>Bevat islet capture microplate, sensor cartridge en calibrant oplossing</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Media (Poederachtig medium)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>R1383</td><td>RPMI 1640 Media met L-Glutamine en zonder glucose of natriumbicarbonaat</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G8270</td><td>1M D-Glucose gefilterd, voor mediavoorbereiding</td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat</td><td>Corning</td><td>25000CI</td><td>100 mM natriumpyruvaat</td></tr><tr><td>Antimycin-A</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A8674</td><td>Mitochondriale stressprotocol component</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C2920</td><td>Mitochondriale stressprotocol component</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Millipore-Sigma</td><td>R8875</td><td>Mitochondriale stressprotocol component</td></tr><tr><td>2-deoxyglucose</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D6134</td><td>Glycolyseprotocol component</td></tr><tr><td>1 mm huidbiopsie ponsen met plunjer</td><td>Integra-Miltex</td><td>33-31AA-P/25</td><td>Explantatietool voor retinaweefsel</td></tr><tr><td>Dumont Mini-Forceps Recht</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-10</td><td>Explantatietool voor retinaweefsel</td></tr><tr><td>Dumont Medisch #5/45 Forceps- Hoek 45 graden</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-25</td><td>Explantatietool voor retinaweefsel</td></tr><tr><td>Dumont #7 Forceps - Gebogen</td><td>Fine Science Tools</td><td>11271-30</td><td>Explantatietool voor retinaweefsel</td></tr><tr><td>Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit</td><td>Fisher Scientific</td><td>P7589</td><td>Loading normalisatie assay</td></tr><tr><td>Trizma base (Tris base)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T6066</td><td>Component van lysis buffer</td></tr><tr><td>Triton X-100 (polyethyleenglycol tert-octylfenylether)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>X100</td><td>Component van lysis buffer</td></tr><tr><td>0.5M EDTA pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9262</td><td>Component van lysis buffer</td></tr><tr><td>C57BL/6J muizen&nbsp;</td><td>Jackson Laboratories</td><td>&nbsp;Stam 000664</td><td>Dieren</td></tr><tr><td>Gnat1-/- en achtergrond-gematchte Gnat1+/+&nbsp;</td><td>Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine</td><td>Dieren</td><td></td></tr></tbody></table>

meting van de energie-stofwisseling in transplanteren retinale weefsel met behulp van extracellulaire flux-analyse

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Hoge gezichtsscherpte visie is een zwaar energieverbruikende proces, en het netvlies heeft verscheidene unieke aanpassingen precies om dergelijke eisen met behoud van de transparantie van de visuele as ontwikkeld. Verstoringen op dit delicate evenwicht veroorzaken verblindende ziekten, zoals diabetische retinopathie. Het begrip van energie metabolisme veranderingen in het netvlies tijdens ziekte is dus noodzakelijk om de ontwikkeling van rationele therapieën voor verschillende oorzaken van vison verlies. De recente komst van verkrijgbare extracellulaire flux analyzers heeft de studie van retinale energiemetabolisme toegankelijker gemaakt. Dit protocol beschrijft het gebruik van dergelijke een analysator voor het meten van bijdragen aan het netvlies energievoorziening door haar twee beginsel wapens - oxidatieve fosforylatie en glycolyse - door het kwantificeren van de veranderingen in het zuurstof verbruik (OCR) en extracellulaire verzuring tarieven (ECAR) als proxy's voor deze trajecten. Deze techniek wordt gemakkelijk uitgevoerd in transplanteren retinale weefsel, vergemakkelijking van de beoordeling van reacties op meerdere farmacologische agenten in een enkele experiment. Metabole handtekeningen in het netvlies van de dieren ontbreekt staaf fotoreceptor signalering worden vergeleken met wild-type besturingselementen met behulp van deze methode. Een belangrijke beperking bij deze techniek is het gebrek aan vermogen om te discrimineren tussen licht aangepast en dark-adapted energie gebruik, een belangrijke fysiologische overweging in netvlies weefsel.

Met behulp van de beschreven technieken (samengevat in Figuur 1), werden retinale explantaten van 8 weken oude wild type (WT) muizen vergeleken met leeftijd - en achtergrond-matched transducine null muizen (Gnat1- / -). Omdat Gnat1- / - dieren ontbreken de machines te sluiten cyclische-nucleotide gated ionenkanalen in reactie op lichte stimuli, hun rod researchdieren blijven depolarized zelfs in lichte<sup clas...

Deze techniek wordt beschreven real-time opname van zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring tarieven in het netvlies weefsel transplanteren muis met behulp van een extracellulaire flux-analyzer.

Meting van de energie-stofwisseling in transplanteren retinale weefsel met behulp van extracellulaire Flux-analyse

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen, zoals hoe energiemetabolisme in netvliesweefsel verschilt tussen biologische monsters, of na blootstelling aan farmacologische agentia. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het gebruik maakt van geëxplanteerd organotypic netvliesweefsel om tarieven van zowel glycolyse te meten, en geoxideerde fosforylatie en maakt beoordelingen van real-time interventies in vitro. Om de instrumentatie te kalibreren voor een extracellulaire fluxtest voeg eerst een milliliter kalibratieoplossing toe aan elke put van de 24 putsensorcartridge, en broed je 's nachts in een Co2-vrije couveuse uit bij 37 graden Celsius in een Co2-vrije incubator.Laad additieven voor het mitochondriale stressprotocol, of het glycolyseprotocol in elke injectorpoort op de sensorcartridge, waarbij u zich aanpast aan volumewijzigingen in de put. Uitgaande van een eerste putvolume van 450 microliters, zou een typische test 45 microliter van een additief in de eerste injectorpoort, 49,5 microliter in de tweede, 54,5 microliter in de derde en 60 microliter in de laatste omvatten. Tijdens de eerste verschillende experimenten, load base medium in poort A om te meten hoeveel weefsel beweging artefact optreedt na een haven injectie.Laat de geladen sensorplaat minstens 60 minuten incuneren bij 37 graden Celsius in een niet Co2-incubator. Begin isolatie van vers muis netvliesweefsel met een vers geëuthanaseerde muis. Gebruik een paar middelgrote gebogen tangen om de achterste bol te grijpen op de oogzenuw, en voorzichtig voorwaartse druk uit te oefenen om het oog te proptose.Met een schoon scheermesje, maak een limbus tot limbus incisie over het hoornvlies met behulp van een enkele, opzettelijke pass van het blad. Met behulp van fijne schuine McPherson stijl tangen, knijp de achterste bol om de lens en voorste hyloid membranen uit te drukken uit het hoornvlies incisie. Herhaal de knijpen manoeuvre met tangen om het neurale netvlies uit te drukken.Gebruik vervolgens de tang als een lepel om het netvlies weg te tillen van de hoornvliesincisie. Plaats het netvlies direct in het warme medium in een schaal van drie centimeter, of een zes goed weefsel cultuur clusterplaat. Gebruik vervolgens twee paar fijne schuine McPherson's stijl tangen om voorzichtig te ontleden resterende glasvocht van het netvlies.Dit is het beste gedaan door het grijpen van het glasvocht aan de periferie van de retinale beker, en trekken naar het centrum, met een definitieve disinertion van het glasvocht lichaam uit het centrum als geheel. Verwijder vervolgens het resterende netvliespigmenteptheel van het fotoreceptoroppervlak van het netvlies. Snijd een P1000 pipet tip met een scheermesje om een geschatte vier millimeter opening te creëren om onnodige trauma's aan het delicate netvliesweefsel te voorkomen tijdens overdracht manoeuvres.Gebruik vervolgens de gesneden pipetpunt om het geïsoleerde netvliesweefsel over te zetten naar vers medium. Tot slot, gebruik maken van een een millimeter biopsie punch uitgerust met een zuiger, om stoten van het netvlies snijden rond de oogzenuw. Zet het netvlies stoten opzij in schoon medium, bewaard op een 37 graden Celsius blok, of verwarming pad.Zodra het gewenste aantal stoten zijn verzameld, gebruik schattige P1000 tip om een individuele punch in 450 microliters van medium aan te trekken, en breng het over naar een 24 goed eyelet capture microplaat op een 37 graden Celsius warmte pad of warmteblok. Gebruik fijne, rechte tangen om stoten zachtjes te manipuleren in het midden van de microplaat. Houd stoten georiënteerd in dezelfde richting.Bijvoorbeeld, met de ganglion cel kant naar boven. Voor elk experiment opzij gezet drie tot vier lege putten met 450 microliters van basismedium om te dienen als negatieve controles. Terwijl u luchtbellen of overmatige beweging vermijdt, plaatst u het eyelet capture mesh-inzet in elke put en zet u de inzetstukken vast met een metalen zuiger of met een uitgesneden P1000 pipetpunt.Hoewel de microkamer voldoende diepte heeft om het typische muisnetvlies aan te passen, zorgen machinedefecten in de mesh-inzetstukken er af en toe voor dat weefsels overdreven worden samengeperst tijdens het inbrengen van het scherm. Als dit gebeurt, gewoon een notitie van dit verpletterde weefsel, en sluit dat monster uit de uiteindelijke analyse. Incubeer de weefselplaat in een 37 graden Celsius koolstofdioxide vrije incubator gedurende ten minste 60 minuten.Programmeer de extra cellulaire flux analyzer met behulp van mix, gewicht, meten en herhalen commando's. Als voorbeeld, een typisch experiment met retinale weefsel kan het volgende. Meng twee minuten, wacht twee minuten en meet vijf minuten.Herhaal het experiment met deze drie stappen tussen vijf tot acht keer voor de basislijn opname, en na injectie van elke verbinding wordt getest. Druk op de startknop van het programma op de extracellulaire fluxanalyzer en volg de instructies op het scherm om de sensorcartridge in te voegen voor kalibratie. Volg aan het einde van de kalibratie instructies op het scherm om de rembrantplaat te vervangen door de plaat met de retinale monsters en laat het programma vervolgens naar geprogrammeerd lopen.Bij het voltooien van de run, volg instructies op het scherm om de weefselplaat uit te werpen. Bekijk de resultaten van de run en sla het gegevensbestand op. Verwijder met een gebogen naald en tangen alle mesh-inzetstukken uit de putten, waardoor de retinale punch achterblijft.Spoel het medium voorzichtig aan uit het weefsel en was het weefsel twee keer met 0,5 milliliter koud fosfaat gebufferde zoutoplossing. Na het aspireren van de tweede PBS-was, voeg 100 microliters lysebuffer toe aan elke wasmachine en pipet op en neer om weefsel te homogeniseren. Ten slotte kwantificeren de inputniveaus op basis van het totale dubbele gestrande DNA-gehalte door lysed samples één op één te verdunnen, met 100 microliter van Tris-EDTA-buffer, en 100 microliter van het verdunde monster over te brengen naar een 96 putplaat.Voeg vervolgens 100 microliters detectiebuffer toe aan elke put en meng gedurende twee tot vijf minuten. Ten slotte, kwantificeren florescence na excitatie op 480 nanometer en emissie op 520 nanometer door te vergelijken met een standaard curve. Normaliseer de ruwe extracellulaire flux tracing naar DNA-inhoud binnen de put.Aan de basislijn, in aanwezigheid van vijf milli muller glucose en in aanwezigheid van 10 milli muller pyruvaat, is er geen significant verschil in de tarieven van zure eflux, gemeten door de extracellulaire verzuring. Tussen retinale weefsels van wile type dieren, of knock-out muizen die niet over de machines om cyclische nucleotide gated ion kanalen sluiten in reactie op licht stimuli. Vergelijkbare patronen worden gezien na toevoeging van 20 milli muller glucose en de glycolytische remmer 2DG.Deze gegevens kunnen wiskundig worden omgezet om fractionele veranderingen van basislijn te vertegenwoordigen, een formaat dat een betere vergelijking tussen verschillende experimentele interventies mogelijk maakt. Absolute zuurstofverbruik tarief bij baseline is ook gelijk tussen controle en mutant netvliesweefsel. De toevoeging van 20 milli muller glucose verhoogt mitochondriale ademhaling, maar geen verandering in waargenomen tussen groepen in termen van absolute kwantificering of in termen van verandering van baseline.De toevoeging van een milli muller FCCP, een ontkoppelingsmiddel, om maximale mitochondriale ademhalingssnelheden aan te tonen, verhoogt OCR niet significant boven het niveau van hoge glucose in controle en gemuteerd netvliesweefsel. Echter, signalen van beide muizen drastisch dalen na de toevoeging van RAA cocktail. Tot slot tonen we een techniek voor het kwantificeren van de tarieven van geoxideerde fosforylatie en glycolyse in organotypic explants van muis netvlies.Met een efficiënte isolatie van netvliesweefsel levert de techniek betrouwbare en reproudcable metingen op. Real-time effecten van blootstellingen, zoals ontkoppelingsmiddelen, kunnen worden beoordeeld. Naast deze procedure kunnen andere methoden, zoals kwantitatieve RTPCR en westelijke blotting, worden uitgevoerd op het overtollige weefsel geïsoleerd in de dissectiestap om parallelle informatie te verkrijgen die relevant is voor studies van het netvliesmetabolisme.

measurement-energy-metabolism-explanted-retinal-tissue-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This protocol provides a biochemical approach for measuring extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR) of primary leukemic cells with extracellular flux assay. The assessment of the metabolic profile of these cells helps to characterize their demands, leading to personalized therapy.

Extracellular Flux Assay: A Method for Measuring Metabolic Profile of Cells

This video demonstrates the method to analyze energy metabolism in activated human NK cells using an extracellular flux analyzer. Different inhibitors of the electron transport chain complexes impact ATP synthesis, which is measured through the oxygen consumption rate or OCR, providing insights into cellular metabolism and bioenergetics.

Real-Time Monitoring of Energy Metabolism in Human NK Cells Using an Extracellular Flux Analyzer

Metabolische herprogrammering is een kenmerkend en vereist kenmerk voor M1 en M2 macrofaagpolarisatie. Dit manuscript beschrijft een test voor de meting van fundamentele parameters van glycolyse en mitochondriale functie in muis-beenmerg-afgeleide macrofagen. Deze tool kan worden toegepast om te onderzoeken hoe bepaalde factoren het metabolisme en fenotype van macrofagen beïnvloeden.

Metabole karakterisering van gepolariseerde M1 en M2 Bone Marrow-afgeleide macrofagen met behulp van real-time extracellulaire Flux Analysis

Dit protocol biedt een rendabele aanpak om te isoleren en karakteriseren van muis primaire renale tubulaire cellen die vervolgens sub kunnen worden gekweekt om te beoordelen renale biologische functies- ex vivo, met inbegrip van de mitochondriale Bioenergetica.

Isolatie, karakterisering en High Throughput extracellulaire Flux-analyse van muis primaire renale tubulaire epitheliale cellen

Hier wordt een gedetailleerd protocol beschreven voor het uitvoeren van mitochondriale stresstest en glycolytische snelheidstest in ex vivo retinale weefselmonsters met behulp van een commerciële bioanalyzer.

Bepaling van mitochondriale ademhaling en glycolyse in ex vivo retinale weefselmonsters

De hier gepresenteerde methode vat geoptimaliseerde protocollen samen voor het beoordelen van cellulaire bio-energetica in niet-adherente muishematopoietische stam en primitieve voorlopercellen (HSPC's) met behulp van de extracellulaire fluxanalysator om de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) en zuurstofverbruikssnelheid (OCR) van HSPC's in realtime te meten.

Beoordeling van cellulaire bio-energetica in hematopoietische stamcellen van muizen en primitieve voorlopercellen met behulp van de extracellulaire fluxanalysator

Deze protocollen zullen gebruikers helpen bij het onderzoeken van mitochondriaal energiemetabolisme in 3D-kankercellijn-afgeleide sferoïden met behulp van Seahorse extracellulaire fluxanalyse.

Onderzoek naar mitochondriaal energiemetabolisme van enkelvoudige 3D-microtissue-sferoïden met behulp van extracellulaire fluxanalyse

De metabole status van menselijke retinale pigmentepitheelcellen (H-RPE) weerspiegelt hun gezondheid en functie. Hier wordt een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd voor het onderzoeken van de real-time metabole flux van H-RPE met behulp van respirometrie met hoge resolutie.

Real-time analyse van bio-energetica in primaire menselijke retinale pigmentepitheelcellen met behulp van respirometrie met hoge resolutie

Hier beschrijven we in detail methoden voor het extraheren van macrofagen uit het beenmerg, de milt en het hartinfarct, en vervolgens het beoordelen van de metabole flux in levende cellen.

Analyse van ex vivo metabole flux in milt- en cardiale macrofagen en beenmergmonocyten

Dit protocol beschrijft een kosteneffectieve manier om een glycolyse-stresstest uit te voeren om metabole herprogrammering in primaire muismicroglia te kwantificeren. Na isolatie en ontstekingsstimulatie wordt de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) gemeten met vers bereide, pH-gecorrigeerde reagentia, gevolgd door eiwitnormalisatie om een nauwkeurige en reproduceerbare beoordeling van glycolytische verschuivingen mogelijk te maken.

Onderzoek naar glycolyse in primaire microglia met behulp van extracellulaire fluxassay

In dit artikel beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het kwantificeren van de zuurstofconsumptiesnelheid en extracellulaire verzuringingssnelheid van ex vivo volwassen zebravisventrikels om hun oxidatieve en glycolytische metabole capaciteit te karakteriseren.

Beoordeling van de metabole activiteit van hele regenererende zebravisventrikels ex vivo met behulp van een extracellulaire fluxassay

Leer hoe je energiestofwisseling meet in geëxplanteerd muizenretina met behulp van extracellulaire fluxanalyse. Deze methode registreert zuurstofverbruik en glycolyse in realtime voor farmacologisch onderzoek.

Meting van de energie-stofwisseling in transplanteren retinale weefsel met behulp van extracellulaire Flux-analyse

Meer video's verkennen