Meting van de energie-stofwisseling in transplanteren retinale weefsel met behulp van extracellulaire Flux-analyse

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen, zoals hoe energiemetabolisme in netvliesweefsel verschilt tussen biologische monsters, of na blootstelling aan farmacologische agentia. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het gebruik maakt van geëxplanteerd organotypic netvliesweefsel om tarieven van zowel glycolyse te meten, en geoxideerde fosforylatie en maakt beoordelingen van real-time interventies in vitro. Om de instrumentatie te kalibreren voor een extracellulaire fluxtest voeg eerst een milliliter kalibratieoplossing toe aan elke put van de 24 putsensorcartridge, en broed je 's nachts in een Co2-vrije couveuse uit bij 37 graden Celsius in een Co2-vrije incubator.

Laad additieven voor het mitochondriale stressprotocol, of het glycolyseprotocol in elke injectorpoort op de sensorcartridge, waarbij u zich aanpast aan volumewijzigingen in de put. Uitgaande van een eerste putvolume van 450 microliters, zou een typische test 45 microliter van een additief in de eerste injectorpoort, 49,5 microliter in de tweede, 54,5 microliter in de derde en 60 microliter in de laatste omvatten. Tijdens de eerste verschillende experimenten, load base medium in poort A om te meten hoeveel weefsel beweging artefact optreedt na een haven injectie.

Laat de geladen sensorplaat minstens 60 minuten incuneren bij 37 graden Celsius in een niet Co2-incubator. Begin isolatie van vers muis netvliesweefsel met een vers geëuthanaseerde muis. Gebruik een paar middelgrote gebogen tangen om de achterste bol te grijpen op de oogzenuw, en voorzichtig voorwaartse druk uit te oefenen om het oog te proptose.

Met een schoon scheermesje, maak een limbus tot limbus incisie over het hoornvlies met behulp van een enkele, opzettelijke pass van het blad. Met behulp van fijne schuine McPherson stijl tangen, knijp de achterste bol om de lens en voorste hyloid membranen uit te drukken uit het hoornvlies incisie. Herhaal de knijpen manoeuvre met tangen om het neurale netvlies uit te drukken.

Gebruik vervolgens de tang als een lepel om het netvlies weg te tillen van de hoornvliesincisie. Plaats het netvlies direct in het warme medium in een schaal van drie centimeter, of een zes goed weefsel cultuur clusterplaat. Gebruik vervolgens twee paar fijne schuine McPherson's stijl tangen om voorzichtig te ontleden resterende glasvocht van het netvlies.

Dit is het beste gedaan door het grijpen van het glasvocht aan de periferie van de retinale beker, en trekken naar het centrum, met een definitieve disinertion van het glasvocht lichaam uit het centrum als geheel. Verwijder vervolgens het resterende netvliespigmenteptheel van het fotoreceptoroppervlak van het netvlies. Snijd een P1000 pipet tip met een scheermesje om een geschatte vier millimeter opening te creëren om onnodige trauma's aan het delicate netvliesweefsel te voorkomen tijdens overdracht manoeuvres.

Gebruik vervolgens de gesneden pipetpunt om het geïsoleerde netvliesweefsel over te zetten naar vers medium. Tot slot, gebruik maken van een een millimeter biopsie punch uitgerust met een zuiger, om stoten van het netvlies snijden rond de oogzenuw. Zet het netvlies stoten opzij in schoon medium, bewaard op een 37 graden Celsius blok, of verwarming pad.

Zodra het gewenste aantal stoten zijn verzameld, gebruik schattige P1000 tip om een individuele punch in 450 microliters van medium aan te trekken, en breng het over naar een 24 goed eyelet capture microplaat op een 37 graden Celsius warmte pad of warmteblok. Gebruik fijne, rechte tangen om stoten zachtjes te manipuleren in het midden van de microplaat. Houd stoten georiënteerd in dezelfde richting.

Bijvoorbeeld, met de ganglion cel kant naar boven. Voor elk experiment opzij gezet drie tot vier lege putten met 450 microliters van basismedium om te dienen als negatieve controles. Terwijl u luchtbellen of overmatige beweging vermijdt, plaatst u het eyelet capture mesh-inzet in elke put en zet u de inzetstukken vast met een metalen zuiger of met een uitgesneden P1000 pipetpunt.

Hoewel de microkamer voldoende diepte heeft om het typische muisnetvlies aan te passen, zorgen machinedefecten in de mesh-inzetstukken er af en toe voor dat weefsels overdreven worden samengeperst tijdens het inbrengen van het scherm. Als dit gebeurt, gewoon een notitie van dit verpletterde weefsel, en sluit dat monster uit de uiteindelijke analyse. Incubeer de weefselplaat in een 37 graden Celsius koolstofdioxide vrije incubator gedurende ten minste 60 minuten.

Programmeer de extra cellulaire flux analyzer met behulp van mix, gewicht, meten en herhalen commando's. Als voorbeeld, een typisch experiment met retinale weefsel kan het volgende. Meng twee minuten, wacht twee minuten en meet vijf minuten.

Herhaal het experiment met deze drie stappen tussen vijf tot acht keer voor de basislijn opname, en na injectie van elke verbinding wordt getest. Druk op de startknop van het programma op de extracellulaire fluxanalyzer en volg de instructies op het scherm om de sensorcartridge in te voegen voor kalibratie. Volg aan het einde van de kalibratie instructies op het scherm om de rembrantplaat te vervangen door de plaat met de retinale monsters en laat het programma vervolgens naar geprogrammeerd lopen.

Bij het voltooien van de run, volg instructies op het scherm om de weefselplaat uit te werpen. Bekijk de resultaten van de run en sla het gegevensbestand op. Verwijder met een gebogen naald en tangen alle mesh-inzetstukken uit de putten, waardoor de retinale punch achterblijft.

Spoel het medium voorzichtig aan uit het weefsel en was het weefsel twee keer met 0,5 milliliter koud fosfaat gebufferde zoutoplossing. Na het aspireren van de tweede PBS-was, voeg 100 microliters lysebuffer toe aan elke wasmachine en pipet op en neer om weefsel te homogeniseren. Ten slotte kwantificeren de inputniveaus op basis van het totale dubbele gestrande DNA-gehalte door lysed samples één op één te verdunnen, met 100 microliter van Tris-EDTA-buffer, en 100 microliter van het verdunde monster over te brengen naar een 96 putplaat.

Voeg vervolgens 100 microliters detectiebuffer toe aan elke put en meng gedurende twee tot vijf minuten. Ten slotte, kwantificeren florescence na excitatie op 480 nanometer en emissie op 520 nanometer door te vergelijken met een standaard curve. Normaliseer de ruwe extracellulaire flux tracing naar DNA-inhoud binnen de put.

Aan de basislijn, in aanwezigheid van vijf milli muller glucose en in aanwezigheid van 10 milli muller pyruvaat, is er geen significant verschil in de tarieven van zure eflux, gemeten door de extracellulaire verzuring. Tussen retinale weefsels van wile type dieren, of knock-out muizen die niet over de machines om cyclische nucleotide gated ion kanalen sluiten in reactie op licht stimuli. Vergelijkbare patronen worden gezien na toevoeging van 20 milli muller glucose en de glycolytische remmer 2DG.

Deze gegevens kunnen wiskundig worden omgezet om fractionele veranderingen van basislijn te vertegenwoordigen, een formaat dat een betere vergelijking tussen verschillende experimentele interventies mogelijk maakt. Absolute zuurstofverbruik tarief bij baseline is ook gelijk tussen controle en mutant netvliesweefsel. De toevoeging van 20 milli muller glucose verhoogt mitochondriale ademhaling, maar geen verandering in waargenomen tussen groepen in termen van absolute kwantificering of in termen van verandering van baseline.

De toevoeging van een milli muller FCCP, een ontkoppelingsmiddel, om maximale mitochondriale ademhalingssnelheden aan te tonen, verhoogt OCR niet significant boven het niveau van hoge glucose in controle en gemuteerd netvliesweefsel. Echter, signalen van beide muizen drastisch dalen na de toevoeging van RAA cocktail. Tot slot tonen we een techniek voor het kwantificeren van de tarieven van geoxideerde fosforylatie en glycolyse in organotypic explants van muis netvlies.

Met een efficiënte isolatie van netvliesweefsel levert de techniek betrouwbare en reproudcable metingen op. Real-time effecten van blootstellingen, zoals ontkoppelingsmiddelen, kunnen worden beoordeeld. Naast deze procedure kunnen andere methoden, zoals kwantitatieve RTPCR en westelijke blotting, worden uitgevoerd op het overtollige weefsel geïsoleerd in de dissectiestap om parallelle informatie te verkrijgen die relevant is voor studies van het netvliesmetabolisme.