Name: Spatiotemporally gecontroleerde nucleaire translocatie van gasten in levende cellen gekooide moleculaire lijm als Photoactivatable Tags gebruiken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Leer lichtgeactiveerde nucleaire translocatie in levende cellen met gekooide moleculaire lijm-tags. Deze methode maakt site-selectieve nucleaire targeting voor precieze geneesmiddelenafgifte mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij erkennen het centrum voor NanoBio integratie, de Universiteit van Tokio. Dit werk was ondersteund door de Grant-in-Aid voor de wetenschappers (B) (26810046) van de jonge aan K.O. en slechts gedeeltelijk ondersteund door Grant-in-Aid speciaal bevorderd onderzoek (25000005) naar T.A. R.M. bedankt de Research Fellowships van Japan Society voor de promotie van wetenschap (JSPS ) voor jonge wetenschappers en het programma voor toonaangevende gediplomeerde scholen (GPLLI).

1. bereiding van gasten met gekooidelijm-R Tags
<ol><li>Bereid Cagedlijm-NBD-oplossing.<ol>
<li>Synthetiseren Cagedlijm-NBD (Figuur 1) na de procedures eerder beschreven20.</li>
		<li>Voorbereiden van een stamoplossing van Cagedlijm-NBD (10 mM) in droge dimethylsulfoxide (DMSO). Opmerking: Bewaar de stockoplossing in donker. De oplossing kan worden verdund met waterige buffers of cel-cultuur-media bij gebruik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid Cagedlijm-QD-oplossing.<ol>
<li>Synthetiseren Cagedlijm-dibenzocylooctyne (Cagedlijm-DBCO) (Figuur 1) volgens de procedures eerder beschreven20.</li>
		<li>Voorbereiden van een stamoplossing van Cagedlijm-DBCO (10 mM) in droge DMSO.</li>
		<li>Voor de bereiding van Cagedlijm-QD, eerst voorbereiden azide-matiemaatschappij QDs (Azide-QD; Figuur 3). Voeg 100 µL van een dimethyl formamide (DMF, 125 µM) oplossing van azide-PEG4-NHS ester (Figuur 3) aan 400 µL van een DMF (500 nM) oplossing van quantumdots (QDs) bekleed met amine-matiemaatschappij PEG (Amine-QD; Figuur 3). Roer het mengsel gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Dialyze van de resulterende oplossing gedurende 24 uur tegen 800 mL DMF gebruik van een folie van geregenereerde cellulose membraan met 3.500 molecuulgewicht cut-off (MWCO).</li>
		<li>Verdun de stockoplossing van Cagedlijm-DBCO tot 50 µM met DMF. Voeg 200 µL van de oplossing aan de oplossing na dialyse (Figuur 3) en roer het mengsel gedurende 3 uur bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Dialyze van de resulterende oplossing gedurende 24 uur tegen 800 mL DMF gebruik van een folie van geregenereerde cellulose membraan (25.000 MWCO).</li>
		<li>Verdun de resulterende oplossing tot 200 nM met DMF.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig3.jpg"> Figuur 3: Schematische afbeelding van de voorbereiding van Cagedlijm-QD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
2. bereiding van Hep3B cel monster voor microscopische waarnemingen
<ol><li>Handhaven van menselijke hepatocellulaire carcinoom Hep3B cellen in Eagle's minimale essentiële medium (EMEM) met 10% foetale runderserum (FBS) bij 37 ° C minder dan 5% CO2.</li>
	<li>Beënt de cellen, de dag voor het experiment. Zaad 5.0 × 103 Hep3B cellen per putje van een 8-chambered glas-substraat in EMEM (10% FBS, 200 µL), en Incubeer het monster van de cel bij 37 ° C minder dan 5% CO,2 gedurende 24 uur.</li>
	<li>Verwijder het kweekmedium en tweemaal spoelen van het monster van de cel met 100 µL Dulbecco van fosfaat buffer zoutoplossing (D-PBS).</li>
</ol>3. waarneming van nucleaire translocatie van gasten van de kleine-molecuul veroorzaakt door UV-licht
<ol><li>Leveren van het monster van de cel (bereid in stap 2.3) met 200 µL van FBS-vrije EMEM met Cagedlijm-NBD (10 µM) en Incubeer het resulterende cel monster bij 37 ° C minder dan 5% CO,2 voor 3 h. Opmerking: Incubatie van het monster van de cel in FBS-vrije EMEM langer dan 4U veroorzaakt ernstige celbeschadiging.</li>
	<li>Verwijder het kweekmedium en tweemaal spoelen van het monster van de cel met 100 µL van D-PBS.</li>
	<li>Voor de visualisatie van de Endosomen, leveren de cel monster met 200 µL van EMEM (10% FBS) met een rood-fluorescerende kleurstof (bvLysoTracker rood, 100 nM), en het resulterende cel monster bij 37 ° C te incuberen minder dan 5% CO,2 voor 20 min. Verwijder de cultuur medium, en spoel het monster van de cel met 100 µL van D-PBS tweemaal. Leveren van het monster van de cel met 200 µL van EMEM (10% FBS).</li>
	<li>Voor nucleaire translocatie van Cagedlijm-NBD, blootstellen aan het UV-licht voor 2 min via een optische vezel met behulp van een lichtbron van 100-W xenon, voorzien van een 365 nm bandfilter filter monster cel. Voor de cel van een referentiemonster is zonder UV-blootstelling, het monster van de cel in donker te houden. Opmerking: Het deksel van de glazen substraten kan afgenomen worden voor efficiënte UV-blootstelling. Lange-termijn blootstelling aan UV-licht kan het veroorzaken van cytotoxiciteit op de cellen.</li>
	<li>Voor de visualisatie van de kernen, voeg 1 µL van Hoechst 33342 (1 mg/mL) toe aan het kweekmedium en Incubeer het resulterende cel monster bij 37 ° C minder dan 5% CO,2 voor 10 min.</li>
	<li>Het monster van de cel onverminderd confocale laser scanning microscopie en opnemen van de microfoto na excitatie op 488 nm (λobs = 500-530 nm), 543 nm (λobs = 565-620 nm), en 710 nm (twee-foton; Λ Obs = 390-465 nm) voor NBD, rood-fluorescerende kleurstof en Hoechst 33342, respectievelijk.</li>
</ol>4. waarneming van nucleaire translocatie van gasten van de kleine-molecuul veroorzaakt door twee-foton NIR licht
<ol><li>Leveren van het monster van de cel (bereid in stap 2.3) met 200 µL van FBS-vrije EMEM met Cagedlijm-NBD (10 µM) en Incubeer het resulterende cel monster bij 37 ° C minder dan 5% CO,2 voor 3 h.</li>
	<li>Verwijder het kweekmedium en tweemaal spoelen van het monster van de cel met 100 µL van D-PBS. Leveren van het monster van de cel met 200 µL van EMEM (10% FBS).</li>
	<li>Het monster van de cel onverminderd confocale laser scanning microscopie en opnemen van de microfoto na excitatie op 488 nm (λobs = 500-530 nm).</li>
	<li>Bestralen voor nucleaire translocatie van Cagedlijm-NBD, de regio, met inbegrip van de cel van belang met een twee-foton excitatie-laser (710 nm), geïnstalleerd als een lichtbron in de Microscoop, gedurende 2 minuten (30 s × 4). Observeer de translocatie zoals beschreven in stap 4.3.</li>
</ol>5. waarneming van nucleaire translocatie van macromoleculaire gasten veroorzaakt door UV-licht
<ol><li>Het monster van de cel (bereid in stap 2.3) met 200 µL van FBS-vrije EMEM met Cagedlijm-QD leveren (10 nM), en Incubeer het resulterende cel monster bij 37 ° C minder dan 5% CO,2 voor 3 h.</li>
	<li>Verwijder het kweekmedium en tweemaal spoelen van het monster van de cel met 100 µL van D-PBS. Leveren van het monster van de cel met 200 µL van EMEM (10% FBS).</li>
	<li>Voor nucleaire translocatie van Cagedlijm-QD, blootstellen aan het UV-licht voor 2 min via een optische vezel met behulp van een lichtbron van 100-W xenon, voorzien van een 365 nm bandfilter filter monster cel. Voor de cel van een referentiemonster is zonder UV-blootstelling, het monster van de cel in donker te houden.</li>
	<li>Voor de visualisatie van de kernen, voeg 1 µL van Hoechst 33342 (1 mg/mL) toe aan het kweekmedium en Incubeer het resulterende cel monster bij 37 ° C minder dan 5% CO,2 voor 10 min.</li>
	<li>Het monster van de cel onverminderd confocale laser scanning microscopie en opnemen van de microfoto na excitatie op 405 nm (λobs = 430-520 nm) en 488 nm (λobs = 625-680 nm) voor Hoechst 33342 en QDs, respectievelijk.</li>
</ol>6. cel levensvatbaarheid Assay
<ol><li>Handhaven van menselijke hepatocellulaire carcinoom Hep3B cellen in EMEM (10% FBS) bij 37 ° C minder dan 5% CO2.</li>
	<li>Beënt de cellen, de dag voor het experiment. Zaad 5.0 × 103 Hep3B cellen per putje van een cultuur van de 96-wells-plaat in EMEM (10% FBS, 200 µL), en Incubeer het monster van de cel bij 37 ° C minder dan 5% CO,2 gedurende 24 uur.</li>
	<li>Verwijder het kweekmedium en tweemaal spoelen van het monster van de cel met 100 µL van D-PBS.</li>
	<li>Leveren van het monster van de cel met 200 µL van FBS-vrije EMEM met Cagedlijm-NBD (0.1-100 µM) en Incubeer het resulterende cel monster bij 37 ° C minder dan 5% CO,2 voor 3 h.</li>
	<li>Blootstellen aan het UV-licht voor 2 min via monster cel een optische vezel met behulp van een lichtbron van 100-W xenon, voorzien van een 365 nm bandfilter filter. Houd de cel monster in donker voor een monster analoog cel zonder UV-blootstelling.</li>
	<li>10 µL van cel tellen Kit-8 reagens (10 µL) toevoegen aan het cultuurmedium en Incubeer het resulterende cel monster bij 37 ° C minder dan 5% CO,2 gedurende 2 uur.</li>
	<li>Het monster van de cel onverminderd Absorptie spectroscopie (λ = 450 nm) met behulp van een microplate-lezer.</li>
</ol>

<ol><li>Miller, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gene+therapy+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human gene therapy comes of age.</a> Nature. 357, 455-460 (1992).</li>
<li>Roth, J. A., Cristiano, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+for+Cancer%3A+What+Have+We+Done+and+Where+Are+We+Going%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going.</a> Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).</li>
<li>Verma, I. M., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GENE+THERAPY%3A+Twenty-First+Century+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine.</a> Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).</li>
<li>Ragin, A. D., Morgan, R. A., Chmielewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Import+Mediated+by+Nuclear+Localization+Signal+Peptide+Sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular Import Mediated by Nuclear Localization Signal Peptide Sequences.</a> Chemistry & Biology. 9, 943-948 (2002).</li>
<li>Martin, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+protein+targeting+to+the+nucleolus%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Principles of protein targeting to the nucleolus.</a> Nucleus. 6, 314-325 (2015).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+the+nuclear+targeting+ability+of+nuclear+localization+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Drug+Targeting%22%5BJournal%5D)">Factors influencing the nuclear targeting ability of nuclear localization signals.</a> Journal of Drug Targeting. 24, 927-933 (2016).</li>
<li>Ventura, B. D., Kuhlman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Go+in%21+Go+out%21+Inducible+control+of+nuclear+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Go in! Go out! Inducible control of nuclear localization.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 34, 62-71 (2016).</li>
<li>Watai, Y., Sase, I., Shiono, H., Nakano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+nuclear+import+by+light-induced+activation+of+caged+nuclear+localization+signal+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Regulation of nuclear import by light-induced activation of caged nuclear localization signal in living cells.</a> FEBS Letters. 488, 39-44 (2001).</li>
<li>Engelke, H., Chou, C., Uprety, R., Jess, P., Deiters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Protein+Function+through+Optochemical+Translocation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Control of Protein Function through Optochemical Translocation.</a> ACS Synthetic Biology. 3, 731-736 (2014).</li>
<li>Mogaki, R., Hashim, P. K., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guanidinium-based+%26%2334%3Bmolecular+glues%26%2334%3B+for+modulation+of+biomolecular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Guanidinium-based &#34;molecular glues&#34; for modulation of biomolecular functions.</a> Chemical Society Reviews. 46, 6480-6491 (2017).</li>
<li>Okuro, K., Kinbara, K., Tsumoto, K., Ishii, N., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Glues+Carrying+Multiple+Guanidinium+Ion+Pendants+via+an+Oligoether+Spacer%3A+Stabilization+of+Microtubules+against+Depolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Molecular Glues Carrying Multiple Guanidinium Ion Pendants via an Oligoether Spacer: Stabilization of Microtubules against Depolymerization.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 1626-1627 (2009).</li>
<li>Okuro, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+Effects+of+a+Guanidinium+Ion+Appended+Dendritic+%26%2334%3BMolecular+Glue%26%2334%3B+on+the+ATP-Driven+Sliding+Motion+of+Actomyosin%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%2C+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Adhesion Effects of a Guanidinium Ion Appended Dendritic &#34;Molecular Glue&#34; on the ATP-Driven Sliding Motion of Actomyosin.</a> Angewandte Chemie, International Edition. 48, 3030-3033 (2010).</li>
<li>Uchida, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoclickable+Dendritic+Molecular+Glue%3A+Noncovalent-to-Covalent+Photochemical+Transformation+of+Protein+Hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Photoclickable Dendritic Molecular Glue: Noncovalent-to-Covalent Photochemical Transformation of Protein Hybrids.</a> Journal of the American Chemical Society. 135, 4684-4687 (2013).</li>
<li>Garzoni, M., Okuro, K., Ishii, N., Aida, T., Pavan, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Shape+Effects+of+Molecular+Glue+on+Supramolecular+Tubulin+Assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Structure and Shape Effects of Molecular Glue on Supramolecular Tubulin Assemblies.</a> ACS Nano. 8, 904-914 (2014).</li>
<li>Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+glues+for+manipulating+enzymes%3A+trypsin+inhibition+by+benzamidine-conjugated+molecular+glues%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Molecular glues for manipulating enzymes: trypsin inhibition by benzamidine-conjugated molecular glues.</a> Chemical Science. 6, 2802-2805 (2015).</li>
<li>Okuro, K., Sasaki, M., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boronic+Acid-Appended+Molecular+Glues+for+ATP-Responsive+Activity+Modulation+of+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Boronic Acid-Appended Molecular Glues for ATP-Responsive Activity Modulation of Enzymes.</a> Journal of the American Chemical Society. 138, 5527-5530 (2016).</li>
<li>Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+Photoswitch%3A+Selective+Photochemical+Modulation+of+Enzymes+under+Physiological+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Adhesive Photoswitch: Selective Photochemical Modulation of Enzymes under Physiological Conditions.</a> Journal of the American Chemical Society. 139, 10072-10078 (2017).</li>
<li>Hashim, P. K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductively+Cleavable+Nanocaplets+for+siRNA+Delivery+by+Template-Assisted+Oxidative+Polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization.</a> Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).</li>
<li>Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoinduced+Bioorthogonal+1%2C3-Dipolar+Poly-cycloaddition+Promoted+by+Oxyanionic+Substrates+for+Spatiotemporal+Operation+of+Molecular+Glues%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%2C+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues.</a> Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).</li>
<li>Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caged+Molecular+Glues+as+Photoactivatable+Tags+for+Nuclear+Translocation+of+Guests+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).</li>
<li>Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friction-Mediated+Dynamic+Disordering+of+Phospholipid+Membrane+by+Mechanical+Motions+of+Photoresponsive+Molecular+Glue%3A+Activation+of+Ion+Permeation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-water-content+mouldable+hydrogels+by+mixing+clay+and+a+dendritic+molecular+binder%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder.</a> Nature. 463, 339-343 (2010).</li>
<li>Tamesue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+versus+Dendritic+Molecular+Binders+for+Hydrogel+Network+Formation+with+Clay+Nanosheets%3A+Studies+with+ABA+Triblock+Copolyethers+Carrying+Guanidinium+Ion+Pendants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants.</a> Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).</li>
<li>Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., Güttler, T., Görlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+passive+permeability+barrier+of+nuclear+pore+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes.</a> EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).</li>
<li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions%3A+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li>
<li>Klán, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoremovable+Protecting+Groups+in+Chemistry+and+Biology%3A+Reaction+Mechanisms+and+Efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy.</a> Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Vorige onderzoeken van licht-geactiveerd translocatie van eiwitten in de celkern hebben bereikt met behulp van gekooide NLS-7,-8,9. Zoals eerder vermeld, vereisen deze methoden additionele technieken te nemen de NLS-gelabelde proteïnen in het cytoplasma. Onze Cagedlijm-R tag kan daarentegen niet alleen foto-geïnduceerde nucleaire translocatie, maar ook cellulaire opname van de gasten. Deze functie van de Caged</s...

De celkern, die genetische informatie draagt, is een van de belangrijkste organellen als subcellular drug-levering doel, sinds modulatie van gene replicatie en expressie is effectief voor de behandeling van verschillende ziekten waaronder kanker en genetische stoornissen van1,2,3. Voor nucleaire levering van drugs, vervoeging van peptide tags zoals nucleaire localisatie signalen (NLS)4,5,6 grote schaal is onderzocht. Ter beperking van ongewenste bijwerkingen hebben, is echter de spatio controle van de nucleaire translocatie nodig.
Eerder, licht-geactiveerd translocatie van eiwitten in de celkern heeft bereikt met behulp van gekooide NLS-7,-8,9. NLS worden naar de celkern door binding aan cytoplasmatische vervoer eiwitten6gemigreerd. In de gerapporteerde methoden, zijn gast eiwitten dragen gekooide NLS direct ingelijfd bij het cytoplasma van microinjection8 of uitgedrukt in de doelcellen met behulp van een genetische code uitbreiding techniek9. Een methode die zowel cellulaire opname- en foto-geïnduceerde nucleaire translocatie kan bereiken is dus voordelig voor praktische toepassingen.
Hierin beschrijven we licht geactiveerd nucleaire translocatie van gasten in levende cellen met behulp van dendritische gekooide moleculaire lijm (Cagedlijm-R, Figuur 1) tags. In water oplosbare moleculaire lijm10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , rekening houdend met meerdere Gu+ Hangers zijn eerder ontwikkeld, die strak houden aan eiwitten11,12,13,14,15, 16,17, nucleïnezuren18,19,20, fosfolipide membranen21en klei nanosheets22,23 via de vorming van meerdere zout bruggen tussen hun Gu+ hangers en oxyanionic groepen op de doelen. De hangers Gu+ van Cagedlijm-R worden beschermd door een anionogene photocleavable groep, butyraat-gesubstitueerde nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC). Gasten gelabeld met Cagedlijm-R worden overgenomen in levende cellen via endocytose en verblijf in Endosomen (Figuur 2). Op photoirradiation, zijn de BANVOC groepen Cagedlijm-R zodanig dat deze een uncaged moleculaire lijm (Glue-RUncaged) uitvoering van meerdere Gu+ Hangers, die vervolgens de migratie van de tagged gast vergemakkelijkt vrijstaand in het cytoplasma gevolgd door de celkern (Figuur 2). De Cagedlijm-R tag kan worden uncaged door blootstelling aan UV- of twee-foton nabij-infrarood (NIR) licht zonder ernstige fototoxiciteit. We tonen de spatiotemporally gecontroleerde nucleaire levering van macromoleculaire gasten evenals gasten van de kleine-molecuul met Cagedlijm-R tags, met behulp van quantumdots (QDs) en een fluorescente kleurstof (nitrobenzoxadiazole; NBD), respectievelijk, als voorbeelden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig1.jpg"> Figuur 1: Schematische structuren van Cagedlijm-R. De 9 guanidinium ion (Gu+) Hangers van Cagedlijm-R worden beschermd door een groep butyraat-gesubstitueerde nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC). De BANVOC groepen zijn gekloofd door bestraling met UV- of twee-foton NIR licht. De focal kern van Cagedlijm-R is matiemaatschappij met nitrobenzoxadiazole (NBD) of dibenzocylooctyne (DBCO). Overgenomen met toestemming van referentie20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig2.jpg"> Figuur 2: Schematische afbeelding van licht-geactiveerd nucleaire translocatie van gasten geconjugeerd met een Cagedlijm-R tag. De gast /Cagedlijm-R conjugaat wordt in beslag genomen in levende cellen via endocytosis. Op photoirradiation is de Cagedlijm-R tag uncaged een Uncagedlijm-R tag, die endosomal ontsnappen van de tagged gast vergemakkelijken kan opleveren. Vervolgens worden de tagged gast naar de celkern gemigreerd. Overgenomen met toestemming van referentie20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

<table><tbody><tr><td>Azide-PEG4-NHS ester</td><td>Click Chemistry Tools</td><td>AZ103</td><td></td></tr><tr><td>Q-dot 655 ITK</td><td>Invitrogen</td><td>Q21521MP</td><td></td></tr><tr><td>Geregenereerde cellulose membraan (MWCO 3.500)</td><td>NIPPON Genetics</td><td>TOR-3K</td><td></td></tr><tr><td>Geregenereerde cellulose membraan (MWCO 25.000)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>7425-RC25K</td><td></td></tr><tr><td>Hep3B-cellen</td><td>ATCC</td><td>HB-8064</td><td></td></tr><tr><td>8-kamerige glazen substraat</td><td>Nunc</td><td>155411JP</td><td></td></tr><tr><td>96-wells kweekplaat</td><td>Nunc</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>Eagle's minimaal essentieel medium (EMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10370-021</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum (FBS)</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30406.02</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's fosfaat buffer saline (D-PBS)</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>045-29795</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Red</td><td>Lonza Walkersville</td><td>PA-3015</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Dojindo</td><td>H342</td><td></td></tr><tr><td>Cell Counting Kit-8</td><td>Dojindo</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>Confocal laser scanning microscoop</td><td>Carl-Zeiss</td><td>LSM 510</td><td>Uitgerust met twee-foton excitatielaser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)</td></tr><tr><td>Confocal laser scanning microscoop</td><td>Leica</td><td>TCS SP8</td><td></td></tr><tr><td>Xenon lichtbron</td><td>Asahi Spectra</td><td>LAX-102</td><td></td></tr><tr><td>Microplaat reader</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax Paradigm</td><td></td></tr></tbody></table>

spatiotemporally gecontroleerde nucleaire translocatie van gasten in levende cellen gekooide moleculaire lijm als photoactivatable tags gebruiken

Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags

De celkern is een van de belangrijkste organellen als subcellular drug-levering doel, sinds modulatie van gene replicatie en expressie is effectief voor de behandeling van verschillende ziekten. Hier tonen we licht geactiveerd nucleaire translocatie van gasten met behulp van moleculaire lijm (GlueCaged-R) tags, waarvan meerdere guanidinium ion (Gu+) Hangers worden beschermd door een groep van de anionactieve photocleavable (butyraat-gesubstitueerde gekooide nitroveratryloxycarbonyl; BA NVOC). Gasten gelabeld met Cagedlijm-R worden overgenomen in levende cellen via endocytose en blijven Endosomen. Echter, op photoirradiation, Cagedlijm-R wordt omgezet in uncaged moleculaire lijm (Glue-RUncaged) uitvoering van meerdere Gu+ Hangers, dat de endosomal vlucht en de daaropvolgende nucleaire translocatie van de gasten vergemakkelijkt. Deze methode is veelbelovend voor site-selectieve nucleaire-targeting drug levering, aangezien de tagged gasten naar het cytoplasma gevolgd door de celkern migreren kunnen alleen als photoirradiated. Caged Lijm-R tags kunnen leveren macromoleculaire gasten zoals quantumdots (QDs) evenals kleine-molecuul gasten. Caged Lijm-R tags kunnen uncaged met niet alleen UV-licht, maar ook twee-foton nabij-infrarood (NIR) licht, dat diep in weefsel kan binnendringen.

Voor photoirradiation, Hep3B cellen geïncubeerd met Cagedlijm-NBD tentoongesteld punctate fluorescentie emissie van hun interieur (λext = 488 nm; Cijfers 4A en 4 C, groen). Een analoge opname werd verkregen na excitatie bij 543 nm voor rood-fluorescerende kleurstof (cijfers 4B en 4 C, rode), die aangeeft dat Cagedlijm-NBD gelokaliseerd in de Endosomen. Dienoveree...

Dit protocol beschrijft licht geactiveerd nucleaire translocatie van gasten in levende cellen met behulp van gekooide moleculaire lijm tags. Deze methode is veelbelovend voor site-selectieve nucleaire-targeting drug delivery.

Spatiotemporally gecontroleerde nucleaire translocatie van gasten in levende cellen gekooide moleculaire lijm als Photoactivatable Tags gebruiken

The cell nucleus is one of the most important organelles as a subcellular drug-delivery target, since modulation of gene replication and expression is ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de levering van geneesmiddelen, zoals hoe een geneesmiddel te leveren aan een specifieke cellulaire-korrelig. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat nucleaire translocatie van gas kan worden veroorzaakt door licht. Het aantonen van de procedure zal Rina Mogaki en Akio Arisaka de grad studenten uit mijn groep.Om te beginnen met de voorbereiding van de quantum dot gekoppelde kooi moleculaire lijm door het synthetiseren van gekooide moleculaire lijm gekoppeld dibenzocyclooctyne zoals beschreven in meer detail elders. Bereid een 10 millimolar voorraadoplossing van de gekooide moleculaire lijm gekoppelde dibenzocyclooctyne in droge DMSO. Bereid vervolgens de quantum dot gekoppelde gekooide moleculaire lijm door eerst het maken van aseye gefunctionaliseerde quantum dots.Om dit te bereiken voeg 100 microliter van 125 micromolar aseye PEG4 NHS ester in DMF tot 400 microliter van een DMF-oplossing met 500 nanomolar van quantum dots die zijn bekleed met amine gefunctionaliseerde peg. Roer het mengsel gedurende een uur op kamertemperatuur. Plaats de resulterende oplossing in een geregenereerd ce

spatiotemporally-controlled-nuclear-translocation-guests-living-cells

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

SNAP-tag en CLIP-tag eiwit labeling systemen maken het mogelijk de specifieke, covalente aanhechting van moleculen, inclusief fluorescente kleurstoffen, om een ​​eiwit van interesse in levende cellen. Eenmaal gekloond en uitgedrukt, kunnen de gelabelde eiwit gebruikt worden met een verscheidenheid van substraten voor tal van downstream-applicaties zonder opnieuw te klonen.

Fluorescerende Labeling van COS-7 tot expressie SNAP-tag fusieproteïnen voor live cell imaging

Enkel molecuul microscopie Approach die nieuwe inzichten naar nucleaire transport.

Single-molecule beeldvorming van de nucleaire transporten

Werkwijze voor tijdruimtelijke controle kleine GTPase activiteit licht beschreven. Deze methode is gebaseerd op rapamycine-geïnduceerde FKBP-FRB heterodimerisatie en foto-kooien systemen. Optimalisatie van het licht-bestraling kan de ruimtelijk-tijdelijk bestuurd activering van kleine GTPases op het subcellulaire niveau.

Spatio-temporele Manipulatie van kleine GTPase activiteit bij subcellulaire niveau en op de tijdschaal van seconden in levende cellen

Fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) in combinatie met single-molecule-tracking maakt directe observatie en kwantificering van eiwit-DNA-interacties in levende Escherichia coli cellen.

Visualiseren eiwit-DNA-interacties in levende bacteriële cellen met behulp Photoactivated Enkelmolecuul Tracking

Dit protocol beschrijft hoe totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie te gebruiken om enkele receptoren op het oppervlak van levende cellen te visualiseren en te volgen en daarmee de laterale mobiliteit van receptoren, de grootte van receptorcomplexen te analyseren, evenals om voorbijgaande receptor-receptorinteracties te visualiseren. Dit protocol kan worden uitgebreid tot andere membraaneiwitten.

Hoge-resolutie Spatiotemporal Analyse van Receptor Dynamics door Single-molecule fluorescentie microscopie

Dit protocol beschrijft een imaging gebaseerde methode om te activeren met behulp van photoactivatable peptide-MHC, waardoor nauwkeurige Spatio controle van T cel activatie van T-lymfocyten.

Ruimtelijke en temporele controle van T cel activatie met behulp van een Photoactivatable-Agonist

Een facile fluorescentie-bepaling is bedoeld om te evalueren van de doeltreffendheid van amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA paren integratie van niet-canonieke aminozuren (ncAAs) in eiwitten uitgedrukt in zoogdiercellen. De toepassing van ncAAs op het bestuderen van de G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs) wordt beschreven, met inbegrip van foto-crosslinking toewijzing van bindende sites en bioorthogonal GPCR etiketten op levende cellen.

Optimaliseren van de genetische opneming van chemische sondes in GPCRs voor foto-crosslinking kartering en Bioorthogonal scheikunde in levende cellen van zoogdieren

We beschrijven hoe micro- en photomanipulation technieken zoals FRAP en photoactivation inschakelen de bepaling van de parameters van de beweeglijkheid en de spatio dynamiek van eiwitten in het migreren van cellen. Experimentele uitlezingen omvatten subcellular dynamiek en omzet van beweeglijkheid toezichthouders of van de onderliggende actine cytoskelet.

Micromanipulation technieken waardoor analyse van morfogenetische dynamiek en een omzet van Cytoskeletal regelgevers

Dit protocol laat zien hoe een eiwit nucleaire translocatie onder hittestress bijhouden met behulp van een groene fluorescentie proteïne (GFP) fusieproteïne als merkstof en 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kleuring. De DAPI kleuring protocol is snel en behoudt de GFP en eiwit subcellular localisatie-signalen.

Opsporen van Eiwit Subcellular Localisatie door Green fluorescentie eiwit Tagging en 4', 6-Diamidino-2-phenylindole vlekken in Caenorhabditis elegans

Deze studie presenteert een nieuw protocol om direct mechanische kracht uit te oefenen op de celkern door middel van magnetische microbeads die in het cytoplasma worden afgeleverd en om gelijktijdige live-cell fluorescerende beeldvorming uit te voeren.

Combinatie van 3D Magnetic Force Actuator en multifunctionele fluorescentie beeldvorming om Nucleus Mechanobiology te bestuderen

Dit protocol beschrijft hoe geautomatiseerde analyses van live celbeeldvormingsgegevens die zijn verkregen door het nucleocytoplasmatisch transport via optogenetische hulpmiddelen efficiënt kunnen worden opgezet en uitgevoerd.

LEXY en LINuS optogenetica-tools en geautomatiseerde beeldanalyse gebruiken om de nucleocytoplasmatische transportdynamiek in levende cellen te kwantificeren

Leer lichtgeactiveerde nucleaire translocatie in levende cellen met gekooide moleculaire lijm-tags. Deze methode maakt site-selectieve nucleaire targeting voor precieze geneesmiddelenafgifte mogelijk.

Spatiotemporally gecontroleerde nucleaire translocatie van gasten in levende cellen gekooide moleculaire lijm als Photoactivatable Tags gebruiken (Video) | JoVE Journal

Spatiotemporally gecontroleerde nucleaire translocatie van gasten in levende cellen gekooide moleculaire lijm als Photoactivatable Tags gebruiken

Meer video's verkennen