Functionele oppervlak-immobilisatie van genen met behulp van meerstaps Strand Displacement lithografie

DNA-biochips zijn een aantrekkelijk onderzoeksplatform voor zelfretische biologie, oorspronkelijk ontwikkeld door de BASF-groep, dat de werking van in vitro gencircuits over langere tijd mogelijk maakt. Met dit protocol hopen we deze technologie beschikbaar te maken voor een breder scala aan onderzoekers. Onze methode, beforore lithografie genoemd, vertegenwoordigt een strategie voor de immobilisatie van DNA op basis van de DNA-strengverplaatsingsreactie.

De kracht van deze techniek ligt in zijn multi-step lithografische mogelijkheden, de eenvoudige reproduceerbaarheid, en de commerciële beschikbaarheid van alle componenten. Net als bij andere biochip-oplossingen kan bephore worden gecombineerd met verschillende technologieën. Functionele genborstels kunnen bijvoorbeeld in microcompartimenten worden gemonteerd voor eiwitexpressie.

Om te beginnen, bereid een RCA mengsel door het mengen van vijf delen water met een deel van een 30%ammoniak oplossing in een glazen bekerglas. Verwarm het mengsel tot 70 graden Celsius op een hete plaat onder het roeren. Zodra het 70 graden Celsius bereikt, voeg een deel 30% waterstofperoxide.

Plaats vervolgens een siliciumwafer met een diameter van 100 millimeter in de oplossing, om organisch materiaal en deeltjes eruit te verwijderen. Na 30 minuten, neem het substraat, spoel het grondig met water uit een wasfles, en droog het met een stikstof pistool. Ga onmiddellijk verder met de PEGylation van het substraat.

Om dit te bereiken, eerst verdunen biotine-PEG-Silane in droge tolueen tot 5 milligram per milliliter, en vortex de oplossing totdat het goed gemengd. Met het substraat geplaatst in een glazen petrischaal, langzaam pipette de oplossing op het substraat, die het hele oppervlak, maar vermijd waardoor de oplossing te stromen over de rand. Zodra het oppervlak is bedekt, sluit de petrischaal, en voeg dan een extra deksel.

Na 30 minuten, verwijder de cover, en voeg ongeveer 40 milliliter isopropyl alcohol aan de Petri schotel. Haal het substraat eruit, spoel het opnieuw grondig af met isopropylalcohol en droog het met een stikstofpistool. Wanneer droog, bewaar het substraat in het donker totdat het nodig is.

Bereid een substraat met behulp van een glassnijder of een scalpel te vormen een centimeter bij een centimeter stukken. Voeg vervolgens een eenvoudige uitlijningsmarkering toe door een korte kras van het midden naar een rand van het substraat te maken. Blaas kleine deeltjes van de chip met een stikstofpistool.

Meng vervolgens twee druppels siliconenlijm met twee componenten en breng de lijm aan op het oppervlak van de chip, waardoor het gebied rond het puntje van de kras leeg blijft. Daar zorgt de lijm voor een hydrofobe barrière, waardoor waterige oplossingen op de chip blijven. Dit vergemakkelijkt de volgende wasstappen en vermindert de hoeveelheid DNA die nodig is voor incubaties.

In een latere stap kan de lijm gemakkelijk worden afgepeld. In de volgende stappen wordt fotocleavable DNA alleen behandeld in een gele lichtomgeving. Bedek de chip met ongeveer 10 microliter van een bephore mengsel bij kamertemperatuur, en plaats de chip in een doos gedeeltelijk gevuld met water om verdamping te verminderen.

Na een uur was je de chip meerdere keren met PBS om een niet-gebonden bephore mix te verwijderen. Voeg vervolgens 10 microliter van de passivatiemix toe aan de chip. Na twee uur, was de chip meerdere malen met PBS om de niet-gebonden passivatie agenten te verwijderen.

Snijd een afgedrukt fotomasker op de juiste grootte om een geschikte maskerhouder te passen. Plaats deze op de positie van de veldstop en gebruik de uitlijningsmarkeringen om het masker in de houder uit te lijnen. Met het substraat geplaatst op de microscopie stadium, steek een rood filter in de verlichting pad, en focus op het substraat oppervlak.

Navigeer vervolgens naar het gebied van het substraat dat zal worden blootgesteld. Plaats vervolgens de maskerhouder, blokkeer de verlichting en verander in het UV-filter. Open bij een lage lichtintensiteit de sluiter en gebruik de camera om het masker snel op het substraat te richten.

Met het substraat nu uitgelijnd en het masker in focus, blokkeer het lichtpad naar de camera en verlicht u het substraat bij een hoge lichtintensiteit voor de gewenste belichtingstijd. Na blootstelling, verwijder het monster uit de microscoop, en verwijder voorzichtig zo veel buffer mogelijk uit het substraat zonder het te drogen. Voeg vervolgens 10 tot 20 microliter DNA toe met de sequentie voor bevestiging aan het oppervlak.

Plaats het substraat in een natte doos om te voorkomen dat het drogen, en uitbroed het DNA op het substraat gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Om de gecompartimenteerde genexpressie op een omgekeerde microscoop te observeren, moet u eerst afzonderlijk de twee delen van de monsterhouder voorbereiden. Begin met het lijmen van een bephore-chip met een geïmmobiliseerde genborstel op de chiphouder, met behulp van dubbelzijdige plakband.

Voeg vervolgens wat vacuümvet toe rond het centrale gat van het onderste deel van de houder en steek de chiphouder in. Monteer nu het bovenste deel van de houder. Snijd een dunne PDMS-chip met compartimenten zo klein mogelijk, waardoor een kanaal open aan de ene kant om later voor de uitwisseling van afval en precursormoleculen door diffusie Vervolgens, plasma-behandel een glazen deksel slip in de achterkant van de PDMS chip met zuurstof plasma.

Plaats onmiddellijk na de behandeling de PDMS-chip in het midden van de glazen schuif, waarbij de compartimenten naar boven wijzen. Bak vervolgens het glas met de PDMS gedurende een uur op 70 graden Celsius. Kort voor het monteren van de gehele monsterhouder, plasma-behandel de glazen dia met de PDMS chip als voorheen.

Voeg vervolgens wat vacuümvet toe rond het grote gat van de bovenste houder en plaats de glazen schuif met de PDMS erop. Druk het glas voorzichtig op het vet. Verwijder voorzichtig de buffer uit de chip en was deze één keer met 10 microliters van zelfre expression systeem.

Voeg vervolgens 60 microliter zelfre expression systeem op de chip, en verwijder de twee-component siliconen lijm van de randen. Voeg nu 20 microliter van het expressiesysteem toe aan de PDMS. Na het plaatsen van de druppel op de PDMS, controleer snel in de stereoscopische microscoop dat de compartimenten goed nat zijn en zonder luchtbellen.

Als er luchtbellen zijn, probeer ze dan weg te wassen. Om de twee stukken van de houder te monteren en om kamers en DNA-borstels uit te lijnen, werken onder een stereoscopische microscoop. Immobiliseer de onderste houder met een grijperarm, zodat de twee schroeven en wingnuts gemakkelijk bereikbaar zijn met beide handen.

Plaats de bovenste houder in de onderste houder en laat deze zakken totdat de druppels van het celvrije expressiesysteem smelten. Controleer vervolgens of de compartimenten en het uitlijningsmarkering zich in een vergelijkbaar gebied in het XY-vlak bevinden. Van de onderkant, schroef de wingnuts totdat ze raken de onderkant van de houder.

Tijdens het uitlijnen van de compartimenten en de chip in het XY-vlak, draai je de wingnuts voorzichtig aan. Deze stap vereist enige ervaring en is afhankelijk van de constructie van de monsterhouder. De PDMS mag alleen met zachte kracht op de chip worden gedrukt.

Spuit vervolgens een spons in de anti-verdampingsbehuizing met water en steek de houder in de doos. Vul vervolgens een spuit van vijf milliliter met siliconenlijm met twee componenten en gebruik deze om de doos te verzegelen. Breng ten slotte de doos over naar een temperatuurgestuurde microscoop en beeld de DNA-borstel en de reactie met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Een lithografisch proces in twee stappen, hier uitgevoerd op een beforore glasdia, levert overlappende patronen op van fluorescerend gelabelde DNA-strengen. In deze demonstratie van on-chip genexpressie wordt DNA geïmmobiliseerd in de kamer aan de linkerkant. Wanneer blootgesteld aan de expressie mix, de gele fluorescerende eiwit YPet wordt gesynthetiseerd uit de geïmmobiliseerde DNA.

Om de activiteit van het genexpressiesysteem te beoordelen, wordt het herstel van de fluorescentie waargenomen na een bleekstap. Na twee uur herstelde de fluorescentieintensiteit zich snel. Echter, na vier en zes uur, het niet herstellen, wat aangeeft dat zonder een verse levering van de expressie mix, de reactie eindigde rond uur vier.

Hoewel genexpressie beperkt is in een gesloten systeem, kan het gedurende langere perioden worden volgehouden door de expressiecompartimenten te voorzien van extra precursormoleculen via microvloeistoffen. De bephore methode wordt gebruikt om oligonucleotiden of genlengte DNA te immobiliseren, dat kan worden toegepast op systemen van interagerende DNA-borstels voor zelfhernorgenexpressie. De techniek kan ook worden gebruikt voor andere toepassingen in de biofysica, zoals single molecule fluorescentie studies.

Na het bekijken van deze video, moet u in staat zijn om bephore biochips fabriceren van wafers of glazen dia's, en ze te integreren in uw onderzoeksprojecten.