Name: Functionele oppervlak-immobilisatie van genen met behulp van meerstaps Strand Displacement lithografie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Leer bephore lithografie voor DNA-immobilisatie op oppervlakken met behulp van strand displacement-reacties. Deze methode maakt celvrije genexpressie op biochips mogelijk voor synthetische biologie-onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We mijn dankbaarheid uitspreken aan financiële steun voor dit project door de Volkswagen-Stiftung (grant nr. 89 883) en de European Research Council (subsidie overeenkomst nr. 694410 - AEDNA). M.S.-S. ondersteuning door de DFG via GRK 2062 erkent.

<ol><li>Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+and+assembly+on+a+biochip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip.</a> Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).</li>
<li>Jaehme, M., Michel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cell-free+protein+synthesis+for+the+crystallization+of+membrane+proteins+-+a+case+study+on+a+member+of+the+glutamate+transporter+family+from+Staphylothermus+marinus%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins - a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus.</a> The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).</li>
<li>Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dependence+of+cell-free+protein+synthesis+in+E.+coli+upon+naturally+occurring+or+synthetic+polyribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+Of+The+National+Academy+Of+Sciences+Of+The+United+States+Of+America%22%5BJournal%5D)">The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 47, 1588-1602 (1961).</li>
<li>Harris, D. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+biology%3A+exploiting+the+interface+between+synthetic+biology+and+synthetic+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 672-678 (2012).</li>
<li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthetic+biology%3A+Thinking+outside+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell.</a> Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).</li>
<li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li>
<li>Estévez-Torres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-independent+and+reversible+photocontrol+of+transcription%2Fexpression+systems+using+a+photosensitive+nucleic+acid+binder%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (30), 12219-12223 (2009).</li>
<li>Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+biochemistry+molecular+purge+valve+module+that+maintains+redox+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance.</a> Nature Communications. 5 (1), 4113(2014).</li>
<li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762(2013).</li>
<li>Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coarse-Grained+Dynamics+of+Protein+Synthesis+in+a+Cell-Free+System%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Coarse-Grained Dynamics of Protein Synthesis in a Cell-Free System.</a> Physical Review Letters. 106 (4), 048104(2011).</li>
<li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+replication%2C+synthesis%2C+and+assembly+of+the+bacteriophage+T7+in+a+single+cell-free+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).</li>
<li>Maeda, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+MreB+filaments+on+liposome+membranes%3A+a+synthetic+biology+approach%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Assembly of MreB filaments on liposome membranes: a synthetic biology approach.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (2), 53-59 (2012).</li>
<li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox%3A+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (1), 29-41 (2012).</li>
<li>Niederholtmeyer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+cell-free+forward+engineering+of+novel+genetic+ring+oscillators%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators.</a> eLife. 4, e09771(2015).</li>
<li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li>
<li>Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+by+pure+translation+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis by pure translation systems.</a> Methods. 36 (3), 299-304 (2005).</li>
<li>Pohorille, A., Deamer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+cells%3A+prospects+for+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+In+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Artificial cells: prospects for biotechnology.</a> Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).</li>
<li>Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+genetic+circuit+interactions+within+and+between+synthetic+minimal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells.</a> Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).</li>
<li>Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., Leduc, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+crowding+shapes+gene+expression+in+synthetic+cellular+nanosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems.</a> Nature Nanotechnology. 8 (8), 602-608 (2013).</li>
<li>van Nies, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-replication+of+DNA+by+its+encoded+proteins+in+liposome-based+synthetic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based synthetic cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 1583(2018).</li>
<li>Buxboim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-step+photolithographic+interface+for+cell-free+gene+expression+and+active+biochips%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">A single-step photolithographic interface for cell-free gene expression and active biochips.</a> Small. 3 (3), 500-510 (2007).</li>
<li>Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergent+properties+of+dense+DNA+phases+toward+artificial+biosystems+on+a+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+Of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface.</a> Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).</li>
<li>Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+and+nanowire+assemblies+of+condensed+DNA+polymer+brushes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).</li>
<li>Daube, S. S., Bracha, D., Buxboim, A., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+by+directional+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+Of+The+National+Academy+Of+Sciences+Of+The+United+States+Of+America%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization by directional gene expression.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 107 (7), 2836-2841 (2010).</li>
<li>Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+on-chip+DNA+compartments+as+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells.</a> Science. 345 (6198), 829-832 (2014).</li>
<li>Tayar, A. M., Karzbrun, E., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nphys3469">Propagating gene expression fronts in a one-dimensional coupled system of artificial cells.</a> Nature Physics. 11 (12), 1037-1041 (2015).</li>
<li>Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+on+DNA+Biochips+Patterned+with+Strand-Displacement+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie-International+Edition+In+English%22%5BJournal%5D)">Gene Expression on DNA Biochips Patterned with Strand-Displacement Lithography.</a> Angewandte Chemie-International Edition In English. 57 (17), 4783-4786 (2018).</li>
<li>Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+and+Erasable+DNA+Photolithography%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Multicolor and Erasable DNA Photolithography.</a> ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).</li>
<li>Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Polymer+Brush+Patterning+through+Photocontrollable+Surface-Initiated+DNA+Hybridization+Chain+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction.</a> Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).</li>
<li>McDonald, J. C., et al. <a target="_blank" href=" Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane)">Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane).</a> Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen hebben.

Bephore lithografie is een robuuste en veelzijdige techniek voor het patroon immobilisatie van DNA of RNA. Nog, is de procedure omvat verschillende stappen, die - gewijzigd - kunnen er een oorzaak voor de storing of verminderde prestaties van het systeem.
Een cruciale stap in de fabricage van Bephore chips is de PEGylation van de drager vervagen, waardoor de biocompatibiliteit van het oppervlak. Hier, is de schoonmaak stap met een RCA-procedure belangrijk, omdat het ook het oppervlak voor de l...

Cel-gratis genexpressie reacties van groot belang voor diverse toepassingen in de biochemie, biotechnologie en synthetische biologie zijn. Cel-vrije expressie van eiwitten speelde voor de bereiding van zuivere EiwitSteekproeven, die de basis voor tal van studies in de structurele biologie vormden. Bijvoorbeeld, werden cel-vrije systemen met succes gebruikt voor de expressie van eiwit complexen1 of membraan eiwitten2, die zijn moeilijk te produceren met behulp van cel-gebaseerde expressie. Met name, cel-gratis genexpressie reacties ook gebruikt werden om het verhelderen van de structuur van de genetische code, beginnend met de baanbrekende experimenten door Nirenberg en Matthaei in 19613.
Onlangs is er een hernieuwde belangstelling voor cel-vrije methoden in de biotechnologie en synthetische biologie4,5,6. Cel-vrije systemen kunnen worden aangevuld met niet-biologische verbindingen, en onderdelen van diverse biologische oorsprong is cumuleerbaar gemakkelijker7. Hoewel cel-vrije systemen hebben de schijnbare nadeel dat ze niet "groeien en verdelen", is het denkbaar om te bereiden open cel-vrije bioreactoren met metabole basisfuncties en laat ze synthetiseren metabolieten wanneer voorzien van eenvoudige koolstof en energie ingangen8. Op het opkomende gebied van synthetische biologie beloven cel-vrije systemen om een meer voorspelbare "chassis" voor de uitvoering van synthetische biologische functies.
Momenteel, cel-vrije gen expressie reacties worden uitgevoerd hetzij met behulp van cel haalt (uit verschillende bronnen, zoals bacteriën, gist, insecten), of transcriptie/vertaling-systemen die zijn geoptimaliseerd voor verschillende toepassingen (bijvoorbeeld prokaryote vs. Eukaryotische genexpressie, productie van membraaneiwitten, enz.). Een populair protocol voor de bereiding van het extract van de bacteriële cel (vaak genoemd TXTL) is onlangs geleverd door V. Noireaux en collega's9. De biofysische eigenschappen geweest grondig gekarakteriseerd10, en het TXTL-systeem heeft al met succes gebruikt voor het uitvoeren van een reeks complexe biochemische taken: bijvoorbeeld, de vergadering van functionele bacteriofagen via cel-vrije expressie van de bacteriofaag genoom11, de synthese van de bacteriële eiwitten door samensmelting van filamenten12of de uitvoering van cel-vrije gene circuits13,14.
Een ander systeem populair in cel-vrij van synthetische biologie is het PURE systeem, dat opnieuw is samengesteld uit gezuiverde onderdelen15,16. Vergeleken met het TXTL-systeem, bevat het geen nucleasen of eiwit afbraak machines. Terwijl de afbraak van lineaire DNA is RNA-moleculen of eiwitten minder een probleem in het PURE systeem, verval trajecten zijn eigenlijk belangrijk is voor de uitvoering van dynamische functies. Teneinde het effect van exonuclease afbraak van lineaire gene sjablonen in het TXTL systeem (via RecBCD), dient het eiwit GamS beveiligen met een einde te worden toegevoegd. Zowel de TXTL als het PURE systeem zijn commercieel verkrijgbaar.
Een onderwerp verwant nauw aan cel-vrije biologie betreft de studie van het effect van de brandcompartimentering op biochemische reacties, en verder de oprichting van kunstmatige cel-achtige structuren of protocells17,18,19 ,20. Onderzoek naar kunstmatige cellen betekent meestal dat de inkapseling van een biochemische reactie systeem binnenkant van vesiculaire compartimenten fosfolipiden of andere amfifielen in mindering gebracht. Hoewel dergelijke systemen helpen om fundamentele aspecten van brandcompartimentering, of de opkomst van buiten en zelfreplicerende structuren te verkennen, ze geconfronteerd met de typische problemen van gesloten systemen: in het ontbreken van een goed functionerende stofwisseling en passende membraan vervoer mechanismen, is het moeilijk om te houden van de verzuilde Reacties lopen voor langere tijd - brandstof moleculen zijn opgebruikt en afvalstoffen zich ophopen.
Een interessant alternatief voor brandcompartimentering binnenkant van dergelijke cel nabootsen compartimenten is de ruimtelijke organisatie van genetisch materiaal photolithographic referentiemethoden. Immobilisatie van "genen op een chip" was gepionierd door de Bar-Ziv-groep aan het Weizmann Instituut meer dan tien jaar geleden21. Onder de belangrijke kwesties die moesten worden opgelost waren de aspecifieke adsorptie van DNA en de mogelijke denaturatie van eiwitten op het oppervlak van de chip. Bar-Ziv et al. ontwikkelde een speciale fotolithografie weerstaan genoemd "Daisy", die bestond uit een reactieve terminal silane voor immobilisatie van de moleculen resist op silicium dioxide oppervlakken, een lange polyethyleenglycol (PEG)-spacer die verzekerd biocompatibiliteit en een photocleavable headgroup, die werd omgebouwd tot een reactief amine bij bestraling met ultraviolet (UV) licht. Het is aangetoond dat Daisy kan worden gebruikt voor het immobiliseren van gen-lengte DNA moleculen (met een lengte van enkele kilo-basenparen (kbp)) op een oppervlak van de chip. Vanuit een polymeer natuurkunde oogpunt vertegenwoordigd de systemen polymeer borstels geënt op een stevige ondergrond. Vanwege de aard van de polyelectrolyte van DNA, is de conformatie van deze borstels sterk beïnvloed door osmotische en andere ion-specifieke effecten22,23.
Bovenal is het aangetoond dat substraat-geïmmobiliseerd genen nog steeds functionele zijn en kunnen getranscribeerde en vertaald in RNA en eiwitten. Gene borstels zijn toegankelijk voor RNA polymerase van oplossing24, en de complexe macromoleculaire mengsel van de transcriptie/vertaling is niet gedenatureerd aan het oppervlak. Een van de voordelen van immobilisatie van genetische componenten op een substraat is dat ze kunnen worden bediend in een open microfluidic reactor systeem dat voortdurend wordt geleverd met de voorloper van de kleine moleculen en uit welke afvalstoffen verwijderde25 kunnen , 26.
Wij recent ontwikkelde een variant op deze methode genoemd Bephore (voor biocompatibel elektronenbundel en fotoresist)27, die was uitsluitend gebaseerd op verkrijgbare onderdelen en volgorde-specifieke DNA strand invasie reacties voor gebruikt de realisatie van een eenvoudig te implementeren meerstaps litho-procedure voor de oprichting van chip gebaseerde kunstmatige cellen. Een schematisch overzicht van de procedure is afgebeeld in Figuur 1. Het is gebaseerd op DNA haarspeld moleculen bevat een photocleavable-groep, die zijn geïmmobiliseerd op een biocompatibele PEG-laag. Photocleavage van de haarspeld bloot een single-stranded steunpunt reeks, door welke DNA moleculen van belang (met de "displacing" DIS volgorde) aangesloten via steunpunt-gemedieerde strand invasie worden kunnen.
Terwijl Bephore mogelijk eenvoudiger is te implementeren, Daisy laat de realisatie van de zeer dichte en schoon "gene borstels", die heeft voordelen in bepaalde toepassingen. In principe echter kan Daisy en Bephore lithografie gemakkelijk gecombineerd worden. Een verwante lithografie methode met behulp van DNA strand verplaatsing voor het structureren van DNA borstels op goud werd eerder ontwikkeld door Huang et al., maar werd niet gebruikt in het kader van cel-vrije gen expressie28,29.
In het volgende protocol bieden wij dat een gedetailleerde beschrijving van de productie van DNA borstels voor cel-vrije genexpressie met behulp van de methode Bephore. We beschrijven hoe de gene chips zijn vervaardigd en voorbeelden van het gebruik van meerdere stappen foto-lithografie voor het ruimtelijk gestructureerde immobilisatie van genen op een chip. We bespreken ook de fabricage van reactie kamers en de toepassing van microfluidics voor de uitvoering van de op de chip gen expressie reacties.

<table><tbody><tr><td>Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate)</td><td>Siegert Wafer</td><td></td><td>Thickness (&micro;m): 525 &plusmn;25, Diameter (mm): 100</td></tr><tr><td>Silicon wafer (for PDMS master mold)</td><td>Siegert Wafer</td><td></td><td>Thickness (&micro;m): 525 &plusmn;25, Diameter (mm): 76.2 (3&rdquo;)</td></tr><tr><td>Glass slides no. 4</td><td>Menzel</td><td></td><td>22 mm x 50 mm</td></tr><tr><td>Glass slides no. 1.5</td><td>Assistent</td><td></td><td>24 mm x 24 mm</td></tr><tr><td>Biotin-PEG-Silane</td><td>Laysan Bio</td><td></td><td>MW 5,000</td></tr><tr><td>Anhydrous toluene</td><td>Sigma Aldrich (Merck)</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>S888</td><td></td></tr><tr><td>DNA</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>M0531S</td><td>PCR kit</td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td>Spin-column PCR clean-up kit</td></tr><tr><td>PURExpress</td><td>New England Biolabs</td><td>E6800S</td><td>Cell-free expression system</td></tr><tr><td>PDMS&nbsp;</td><td>Dow Corning</td><td>Slygard 184</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>F8771</td><td></td></tr><tr><td>PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm)</td><td>Bola</td><td>S 1810-10</td><td></td></tr><tr><td>EpoCore 20</td><td>micro resist technology&nbsp;GmbH</td><td></td><td>Photoresist</td></tr><tr><td>mr-Dev 600</td><td>micro resist technology&nbsp;GmbH</td><td></td><td>Photoresist developer</td></tr><tr><td>Ti-Prime</td><td>MicroChemicals</td><td></td><td>Adhesion promoter</td></tr><tr><td>Two-component silicon glue</td><td>Picodent</td><td>Twinsil&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>UV-protection yellow foil</td><td>Lithoprotect (via MicroChemicals)</td><td>Y520E212</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Masks for photolithography</td><td>Zitzmann GmbH</td><td></td><td>64.000 dpi, 180x240 mm</td></tr><tr><td>Upright microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td>Photolithography and fluorescence imaging</td></tr><tr><td>60x water immersion objective</td><td>Olympus</td><td>LumPlanFl</td><td>Used with Olympus BX51, NA 0.9</td></tr><tr><td>20x water immersion objective</td><td>Olympus</td><td>LumPlanFl</td><td>Used with Olympus BX51, NA 0.5</td></tr><tr><td>Camera</td><td>Photometrics</td><td>Coolsnap HQ</td><td>Used with Olympus BX51</td></tr><tr><td>Ligtht source</td><td>EXFO</td><td>X-Cite 120Q</td><td>Used with Olympus BX51</td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Nikon</td><td>Ti2-E</td><td>Fluorescence imaging of gene expression</td></tr><tr><td>4x objective</td><td>Nikon</td><td>CFI P-Apo 4x Lambda</td><td>Used with Nikon Ti2-E</td></tr><tr><td>Camera</td><td>Andor</td><td>Neo5.5</td><td>Used with Nikon Ti2-E</td></tr><tr><td>Light source</td><td>Lumencor</td><td>SOLA SM II</td><td>Used with Nikon Ti2-E</td></tr><tr><td>Cage incubator</td><td>Okolab</td><td>bold line</td><td>Used with Nikon Ti2-E</td></tr><tr><td>Pressure Controller</td><td>Elveflow</td><td>OB1 MK3</td><td></td></tr><tr><td>NanoPhotometer</td><td>Implen</td><td></td><td>DNA concentration measurement</td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Diener</td><td>Femto</td><td>200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage</td></tr></tbody></table>

functionele oppervlak-immobilisatie van genen met behulp van meerstaps strand displacement lithografie

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Immobilisatie van genen op lithographically gestructureerde oppervlakken kan de studie van verzuilde gen expressie processen in een open microfluidic bioreactor systeem. In tegenstelling tot andere benaderingen naar kunstmatige cellulaire systemen zorgt een dergelijke opstelling voor een continue aanvoer gen expressie reagentia en gelijktijdige aftappen van afvalproducten. Dit vergemakkelijkt de tenuitvoerlegging van cel-vrije gen expressie processen gedurende langere perioden van tijd, die belangrijk is voor de realisatie van dynamische gene regelgevende feedbacksystemen. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de fabrikatie van genetische biochips met behulp van een eenvoudige-en-klare lithografische techniek gebaseerd op DNA strand displacement reacties, die uitsluitend verkrijgbare onderdelen gebruikt. We bieden ook een protocol over de integratie van de verzuilde genen met een Polydimethylsiloxaan (PDMS)-gebaseerde microfluidic systeem. Bovendien laten we zien dat het systeem compatibel is met totale interne reflectie (TIRF) fluorescentie microscopie, die kan worden gebruikt voor de directe observatie van moleculaire interacties tussen DNA en de moleculen die zijn opgenomen in de expressie mix.

In twee stappen Litho: Figuur 5 toont het resultaat van een lithografische proces van twee stappen op een glasplaatje met overlappende patronen van fluorescently geëtiketteerde DIS strengen.
Uitdrukking van een fluorescente proteïne van een gen borstel: Figuur 6 toont de expressie van de fluorescente proteïne YPet van geïmmobiliseerdet DNA. Op verschillende punten in ti...

Op een ondergrond, die kan worden gebruikt voor het uitvoeren van cel-vrije gen expressie experimenten op biochips beschrijven we een eenvoudige lithografische procedure voor de immobilisatie van gen-lengte DNA moleculen.

Functionele oppervlak-immobilisatie van genen met behulp van meerstaps Strand Displacement lithografie

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...

DNA-biochips zijn een aantrekkelijk onderzoeksplatform voor zelfretische biologie, oorspronkelijk ontwikkeld door de BASF-groep, dat de werking van in vitro gencircuits over langere tijd mogelijk maakt. Met dit protocol hopen we deze technologie beschikbaar te maken voor een breder scala aan onderzoekers. Onze methode, beforore lithografie genoemd, vertegenwoordigt een strategie voor de immobilisatie van DNA op basis van de DNA-strengverplaatsingsreactie.De kracht van deze techniek ligt in zijn multi-step lithografische mogelijkheden, de eenvoudige reproduceerbaarheid, en de commerciële beschikbaarheid van alle componenten. Net als bij andere biochip-oplossingen kan bephore worden gecombineerd met verschillende technologieën. Functionele genborstels kunnen bijvoorbeeld in microcompartimenten worden gemonteerd voor eiwitexpressie.Om te beginnen, bereid een RCA mengsel door het mengen van vijf delen water met een deel van een 30%ammoniak oplossing in een glazen bekerglas. Verwarm het mengsel tot 70 graden Celsius op een hete plaat onder het roeren. Zodra het 70 graden Celsius bereikt, voeg een deel 30% waterstofperoxide.Plaats vervolgens een siliciumwafer met een diameter van 100 millimeter in de oplossing, om organisch materiaal en deeltjes eruit te verwijderen. Na 30 minuten, neem het substraat, spoel het grondig met water uit een wasfles, en droog het met een stikstof pistool. Ga onmiddellijk verder met de PEGylation van het substraat.Om dit te bereiken, eerst verdunen biotine-PEG-Silane in droge tolueen tot 5 milligram per milliliter, en vortex de oplossing totdat het goed gemengd. Met het substraat geplaatst in een glazen petrischaal, langzaam pipette de oplossing op het substraat, die het hele oppervlak, maar vermijd waardoor de oplossing te stromen over de rand. Zodra het oppervlak is bedekt, sluit de petrischaal, en voeg dan een extra deksel.Na 30 minuten, verwijder de cover, en voeg ongeveer 40 milliliter isopropyl alcohol aan de Petri schotel. Haal het substraat eruit, spoel het opnieuw grondig af met isopropylalcohol en droog het met een stikstofpistool. Wanneer droog, bewaar het substraat in het donker totdat het nodig is.Bereid een substraat met behulp van een glassnijder of een scalpel te vormen een centimeter bij een centimeter stukken. Voeg vervolgens een eenvoudige uitlijningsmarkering toe door een korte kras van het midden naar een rand van het substraat te maken. Blaas kleine deeltjes van de chip met een stikstofpistool.Meng vervolgens twee druppels siliconenlijm met twee componenten en breng de lijm aan op het oppervlak van de chip, waardoor het gebied rond het puntje van de kras leeg blijft. Daar zorgt de lijm voor een hydrofobe barrière, waardoor waterige oplossingen op de chip blijven. Dit vergemakkelijkt de volgende wasstappen en vermindert de hoeveelheid DNA die nodig is voor incubaties.In een latere stap kan de lijm gemakkelijk worden afgepeld. In de volgende stappen wordt fotocleavable DNA alleen behandeld in een gele lichtomgeving. Bedek de chip met ongeveer 10 microliter van een bephore mengsel bij kamertemperatuur, en plaats de chip in een doos gedeeltelijk gevuld met water om verdamping te verminderen.Na een uur was je de chip meerdere keren met PBS om een niet-gebonden bephore mix te verwijderen. Voeg vervolgens 10 microliter van de passivatiemix toe aan de chip. Na twee uur, was de chip meerdere malen met PBS om de niet-gebonden passivatie agenten te verwijderen.Snijd een afgedrukt fotomasker op de juiste grootte om een geschikte maskerhouder te passen. Plaats deze op de positie van de veldstop en gebruik de uitlijningsmarkeringen om het masker in de houder uit te lijnen. Met het substraat geplaatst op de microscopie stadium, steek een rood filter in de verlichting pad, en focus op het substraat oppervlak.Navigeer vervolgens naar het gebied van het substraat dat zal worden blootgesteld. Plaats vervolgens de maskerhouder, blokkeer de verlichting en verander in het UV-filter. Open bij een lage lichtintensiteit de sluiter en gebruik de camera om het masker snel op het substraat te richten.Met het substraat nu uitgelijnd en het masker in focus, blokkeer het lichtpad naar de camera en verlicht u het substraat bij een hoge lichtintensiteit voor de gewenste belichtingstijd. Na blootstelling, verwijder het monster uit de microscoop, en verwijder voorzichtig zo veel buffer mogelijk uit het substraat zonder het te drogen. Voeg vervolgens 10 tot 20 microliter DNA toe met de sequentie voor bevestiging aan het oppervlak.Plaats het substraat in een natte doos om te voorkomen dat het drogen, en uitbroed het DNA op het substraat gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Om de gecompartimenteerde genexpressie op een omgekeerde microscoop te observeren, moet u eerst afzonderlijk de twee delen van de monsterhouder voorbereiden. Begin met het lijmen van een bephore-chip met een geïmmobiliseerde genborstel op de chiphouder, met behulp van dubbelzijdige plakband.Voeg vervolgens wat vacuümvet toe rond het centrale gat van het onderste deel van de houder en steek de chiphouder in. Monteer nu het bovenste deel van de houder. Snijd een dunne PDMS-chip met compartimenten zo klein mogelijk, waardoor een kanaal open aan de ene kant om later voor de uitwisseling van afval en precursormoleculen door diffusie Vervolgens, plasma-behandel een glazen deksel slip in de achterkant van de PDMS chip met zuurstof plasma.Plaats onmiddellijk na de behandeling de PDMS-chip in het midden van de glazen schuif, waarbij de compartimenten naar boven wijzen. Bak vervolgens het glas met de PDMS gedurende een uur op 70 graden Celsius. Kort voor het monteren van de gehele monsterhouder, plasma-behandel de glazen dia met de PDMS chip als voorheen.Voeg vervolgens wat vacuümvet toe rond het grote gat van de bovenste houder en plaats de glazen schuif met de PDMS erop. Druk het glas voorzichtig op het vet. Verwijder voorzichtig de buffer uit de chip en was deze één keer met 10 microliters van zelfre expression systeem.Voeg vervolgens 60 microliter zelfre expression systeem op de chip, en verwijder de twee-component siliconen lijm van de randen. Voeg nu 20 microliter van het expressiesysteem toe aan de PDMS. Na het plaatsen van de druppel op de PDMS, controleer snel in de stereoscopische microscoop dat de compartimenten goed nat zijn en zonder luchtbellen.Als er luchtbellen zijn, probeer ze dan weg te wassen. Om de twee stukken van de houder te monteren en om kamers en DNA-borstels uit te lijnen, werken onder een stereoscopische microscoop. Immobiliseer de onderste houder met een grijperarm, zodat de twee schroeven en wingnuts gemakkelijk bereikbaar zijn met beide handen.Plaats de bovenste houder in de onderste houder en laat deze zakken totdat de druppels van het celvrije expressiesysteem smelten. Controleer vervolgens of de compartimenten en het uitlijningsmarkering zich in een vergelijkbaar gebied in het XY-vlak bevinden. Van de onderkant, schroef de wingnuts totdat ze raken de onderkant van de houder.Tijdens het uitlijnen van de compartimenten en de chip in het XY-vlak, draai je de wingnuts voorzichtig aan. Deze stap vereist enige ervaring en is afhankelijk van de constructie van de monsterhouder. De PDMS mag alleen met zachte kracht op de chip worden gedrukt.Spuit vervolgens een spons in de anti-verdampingsbehuizing met water en steek de houder in de doos. Vul vervolgens een spuit van vijf milliliter met siliconenlijm met twee componenten en gebruik deze om de doos te verzegelen. Breng ten slotte de doos over naar een temperatuurgestuurde microscoop en beeld de DNA-borstel en de reactie met behulp van fluorescentiemicroscopie.Een lithografisch proces in twee stappen, hier uitgevoerd op een beforore glasdia, levert overlappende patronen op van fluorescerend gelabelde DNA-strengen. In deze demonstratie van on-chip genexpressie wordt DNA geïmmobiliseerd in de kamer aan de linkerkant. Wanneer blootgesteld aan de expressie mix, de gele fluorescerende eiwit YPet wordt gesynthetiseerd uit de geïmmobiliseerde DNA.Om de activiteit van het genexpressiesysteem te beoordelen, wordt het herstel van de fluorescentie waargenomen na een bleekstap. Na twee uur herstelde de fluorescentieintensiteit zich snel. Echter, na vier en zes uur, het niet herstellen, wat aangeeft dat zonder een verse levering van de expressie mix, de reactie eindigde rond uur vier.Hoewel genexpressie beperkt is in een gesloten systeem, kan het gedurende langere perioden worden volgehouden door de expressiecompartimenten te voorzien van extra precursormoleculen via microvloeistoffen. De bephore methode wordt gebruikt om oligonucleotiden of genlengte DNA te immobiliseren, dat kan worden toegepast op systemen van interagerende DNA-borstels voor zelfhernorgenexpressie. De techniek kan ook worden gebruikt voor andere toepassingen in de biofysica, zoals single molecule fluorescentie studies.Na het bekijken van deze video, moet u in staat zijn om bephore biochips fabriceren van wafers of glazen dia's, en ze te integreren in uw onderzoeksprojecten.

functional-surface-immobilization-genes-using-multistep-strand

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In dit artikel beschrijven we hoe we krijgen FRET sporen van individuele DNA-moleculen geïmmobiliseerd op een oppervlak met behulp van een geautomatiseerde scanning confocale microscoop.

Geautomatiseerd systeem voor Single Molecule Fluorescentie metingen van Surface-geïmmobiliseerde biomoleculen

We een microfluïdische benadering voor de expressie van eiwit arrays. De inrichting bestaat uit duizenden reactiekamers gecontroleerd door micro-mechanische kleppen. De microfluïdische apparaat is gekoppeld aan een microarray-gedrukte gen bibliotheek. Deze genen worden vervolgens getranscribeerd en getranslateerd on-chip, resulterend in een eiwit array klaar voor experimenteel gebruik.

High-throughput eiwit expressie Generator Met behulp van een Microfluïdische Platform

Deze 3D microfluïdische printtechnologie drukt arrays van cellen op ondergedompelde oppervlakken af.  We beschrijven hoe arrays van cellen microfluïdisch in 3D-stroomcellen op ondergedompelde oppervlakken worden afgeleverd.  Door op ondergedompelde oppervlakken te printen, werden celmicroarrays geproduceerd die geneesmiddelscreening en cytotoxiciteitsbeoordeling mogelijk maken op een veelvoud van gebieden.

De Ondergedoken afdrukken van cellen op een gemodificeerde oppervlak met behulp van een continue stroom Microspotter

Deze studies rapporteren over de omkeerbare hechting van adenovirale genvectoren aan kapot metalen oppervlakken van stents en model mesh schijven. Duurzame afgifte van transductie-competente virale deeltjes, afhankelijk van de hydrolyse van cross-linkers die worden gebruikt voor vector immobilisatie, resulteert in een duurzame locatie-specifieke transgen expressie in vasculaire cellen en in stent-achtige slagaders.

Vasculaire Gene Transfer van Metallic stentoppervlakken met adenovirale vectoren Tethered via Hydrolyseerbare Cross-linkers

Celcultuur substraten die gefunctionaliseerd zijn met microscopische patronen van biologische liganden hebben een immense bruikbaarheid op het gebied van weefselengineering. Hier demonstreren we de veelzijdige en geautomatiseerde productie van celcultuur substraten met meerdere, microgepatteerde poly(ethyleenglycol) borstels die orthogonale chemieën presenteren die ruimtelijk nauwkeurige en locatiespecifieke immobilisatie van biologische liganden mogelijk maken.

Fabriceren Complex Cultuur Substrates behulp Robotic Microcontact Printing (R-μCP) en Sequential Nucleofiele Substitutie

Dit protocol beschrijft een bioprinting-methodologie met behulp van een geautomatiseerd robotsysteem voor het afzetten dat geëtste topografische geleidingssignalen combineert met de nauwkeurige afzetting van een hydrogel bio-inkt dat cellen bevat. De gedrukte cellen worden direct afgeleverd bij de geëtste kenmerken en kunnen deze waarnemen en er zich op oriënteren.

Geautomatiseerde Robotic Dispensing Techniek voor Surface Oriëntatie- en Bioprinting van Cellen

Het fabricageproces van een op PDMS gebaseerd, meerlaagse, microfluïdisch apparaat waarmee in vitro transcriptie-en vertalings Reacties (IVTT) gedurende langere perioden kunnen worden uitgevoerd, wordt beschreven. Bovendien wordt een uitgebreid overzicht gegeven van de hardware en software die nodig is voor het automatiseren en onderhouden van deze reacties voor langdurige duur.

Een Multilayer microfluidic platform voor de geleiding van langdurige cel-vrije genexpressie

Extracellulaire matrix liganden kunnen worden Gedessineerd op polyacrylamidehydrogels om de cultuur van menselijke embryonale stamcellen in kleine kolonies op conforme ondergronden mogelijk te maken. Deze methode kan worden gecombineerd met tractiekracht microscopie en biochemische testen om de wisselwerking tussen weefsel geometrie, door cellen gegenereerde krachten en de specificatie van het lot te onderzoeken.

Patroon van de geometrie van menselijke embryonale stamcel kolonies op conforme ondergronden om de mechanismen van Weefselniveau te beheersen

Dit protocol introduceert een lithografievrije micropatroonmethode die eenvoudig en toegankelijk is voor mensen met een beperkte bio-engineeringachtergrond. Deze methode maakt gebruik van aangepaste laser-cut stencils om micropatroon extracellulaire matrix eiwitten in een vorm van belang voor het moduleren van cel morfologieën. De procedure voor micropatterning wordt aangetoond met behulp van geïnduceerde pluripotente stamcel afgeleide cardiomyocyten.

Eenvoudige lithografie-vrije single cell micropatterning met behulp van Laser-Cut Stencils

Hier presenteren we een protocol voor micropatrintercellen met eencellige resolutie met behulp van DNA-geprogrammeerde adhesie. Dit protocol maakt gebruik van een benchtop fotolithografieplatform om patronen van DNA-oligonucleotiden op een glasplaat te creëren en vervolgens celmembranen te labelen met in de handel verkrijgbare complementaire oligonucleotiden. Hybridisatie van de oligo's resulteert in geprogrammeerde celadhesie.

Eenvoudige, betaalbare en modulaire patronen van cellen met behulp van DNA

Leer bephore lithografie voor DNA-immobilisatie op oppervlakken met behulp van strand displacement-reacties. Deze methode maakt celvrije genexpressie op biochips mogelijk voor synthetische biologie-onderzoek.

Functionele oppervlak-immobilisatie van genen met behulp van meerstaps Strand Displacement lithografie

Meer video's verkennen